专利名称：阿魏酸酯衍生物,3,9－二阿魏基香豆雌酚和含有它的美容产品的制作方法 皮肤老化是指随年龄增长而形成皱纹或下垂的情况。最近关于皮肤老化的研究大致分为两个方面；一方面是组织学研究，例如基质形成或结缔组织如皮肤胶原遭到破坏的机理，另一方面是免疫学研究，例如氧化压力与老化之间的关系。首先，从组织学的观点来看，皮肤收缩和下垂的原因是胶原蛋白纤维或弹性蛋白纤维的退化[M.Oshima等，Matrix，13，187(1993)；S.Harumiya等，J.Biocham.，120，745(1996)]。此外皮下组织和肌肉组织的支撑力下降也增加了皱纹。特别是胶原，它是胶原蛋白纤维和弹性蛋白的最初原料，在成纤维细胞中合成并形成胶原蛋白纤维和弹性蛋白。成纤维细胞的细胞膜具有信号受体糖蛋白，它能够特异性地识别营养通道和胞外物质。此受体与离子转运通道连接，并且如果外部物质到达成纤维细胞细胞膜上的受体，信号就会传送到细胞中，最终到达细胞核内部。指令合成胶原蛋白，且比普通状态下更多的蛋白质被合成出来并释放出细胞核。通过细胞中的各种细胞器，蛋白质生长并从细胞中释放出来。释放出来的蛋白质成为细胞之间胶原纤维或弹性蛋白的基础，因此有弹性的皮肤具有较强的支撑力[A.Hayasho等，Fragnance J.，2，32(1992)]。但是随年龄的增长真皮中胶原的生物合成急剧减少，并且各种压力如紫外线或环境污染导致形成皱纹[M.Oshima等，Matrix，13，187(1993)]。从免疫学的观点来看，人体内或体外的氧化压力破坏了细胞和生物结缔组织，这会增加皱纹的数目并使它们更深。此外，当生物抗氧化材料的生物合成能力随年龄增长而降低时，氧化材料的活化不可避免，如活性氧会逸出体外或者不可避免地发生代谢，导致加速皱纹形成[L.H.Kligman等，J.Invest.Dermatol.93，210(1989)；H.Tanaka等，Arch.Dermatol.Res.，285，352(1993)；M.D.Carbonare等，J.Photochem.Photobiol.B.Biol.，14，105(1992)；T.Okada等，Fragnance J.，1123(1993)]。因此为了防止机体包括皮肤的氧化，必须要人工摄取或使用抗氧化剂。自然界有许多材料具有抗氧化功能。抗氧化功能的原理可以按以下方式解释。形成细胞膜的脂质容易被过氧化物或其它氧活性种所攻击，这些活性氧产生于环境因素，如紫外线或污染或者内部因素如精神压力。它们转变为过氧化脂质，并且形成自由基聚合物，导致细胞膜的破坏[T.Shibamoto等，American Chem Soc 154(1994)]。保护胞内物质的细胞膜的损坏会导致细胞坏死和皮肤老化。在细胞膜脂质被氧化之前抗氧化材料先被氧化，因此防止了脂质被氧化。到目前为止，在化妆品行业所使用的抗氧化材料是各种植物提取物，如生育酚和抗坏血酸。但是有一个问题就是它们非常不稳定或者没有表现出足够的效果。目前对于大部分应用于抗老化化妆品中的功能材料，由于技术上的限制，抗老化效果仅仅在体外试验结果和临床试验结果的基础上进行讨论，而没有证实组织学方面的改进。也就是说，这些年来作为化妆品开发的抗老化材料仅集中在体外免疫学效应。因此，不能确信这些材料会带来实质性的抗皱纹效果。基于以上情况，本发明人发明了具有超强抗氧化作用的3，9-二阿魏基香豆雌酚，它是由阿魏酸和香豆雌酚合成的，它可以解决化学不稳定性或缺乏效果的问题，并且对于抑制老化和皱纹的形成具有组织学和免疫学效应。发明概述开发具有实质性抗老化功能的材料并不容易。如上所述，原材料和以抗老化概念市场化的产品集中在抗老化效果上，但是在实践中也没能获得所希望的效果。
抗氧化作用可以在一定程度上防止内部产生或外部进入的活性氧种类的攻击。但是从组织学的观点来看，这种功能没有保证实质性的抗老化效果，如皱纹的明显消失。因此，已经需要开发由抗氧化功能而具有免疫学抗老化功能的材料或产品，并且进一步能够加速皮肤胶原的产生，由此皮肤恢复和皮肤弹性以及皱纹改进效果都是优异的。
作为基本方向，本发明人试图开发能够加强免疫学功能的材料以用于抗老化以及在组织学上改进皮肤的皱纹。考虑到上述内容，我们由阿魏酸和香豆雌酚合成了一种新型的抗老化材料，其中阿魏酸以其优异的抗氧化性能著称，而香豆雌酚则作为前体以其加速胶原合成的优异性能而著称。
阿魏酸存在于阿魏、松脂、水稻植物的叶子中，并以其抗菌性、抗癌性和适度的抗氧化性能而著称[M.G.Smart等，Aust.J.PlantPhysical.6，485(1979)]。此外，已知它还具有防止血栓凝聚的功能，并且用作食品的一种防腐剂[T.Tsukiya等，Jpn.Lolai7518621(1975)，C.A.83，7602v(1975)]。阿魏酸是从植物树脂中提取出来的，并由澳大利亚的H.Hlasiwets及其同事于1866年命名[H.Hlasiwets等，Ann.138，61(1866)]。
从氧分子衍生出的氧活性种基本上是在代谢过程中产生的，且在人体内它们的浓度应当保持稳定。浓度太低会对代谢造成不良影响，而浓度太高则会导致生物分子如细胞器的细胞脂质膜的过氧化[A.M.Kligman等，J.Am.Acad.Dermatol.，15，836(1986)；E.J.VanScott等，Cutis.，43，222(1989)]。
阿魏酸对衍生于氧分子的各种氧活性种具有轻微的氧化能力，而对于氧化的过渡金属如铁离子或铜离子则具有较强的氧化能力[M.G.Smart等，Aust.J.Plant Physical.6，485(1979)]。此外还报道了阿魏酸被用来防止天然油脂如亚麻籽油的自动氧化。已经证实阿魏酸是化妆品、医疗和食品领域中作为抗氧化材料的一种活性材料。
然而，阿魏酸只具有简单的抗氧化功能，并且主要用作添加剂以防止产品中的有效组分被过渡金属或其它引入的氧活性种所氧化[T.Tsukiya等，Jpn.Kokai 751862191975]，C.A.83，7602v(1975)]。
香豆雌酚通常见于豆科植物中，具有适度的抗氧化效果，并且已知具有抗炎症、抗菌和抗病毒作用[Darbarwar.M.等，J.Sci.Ind.Res.，35，297(1982)；Jeffrey，B.H.等，Phytochemical Dictionary，Taylor&Francis，London，pp418(1933)]。
尽管其准确的机理尚未清楚，但已知它能加速结缔组织如皮肤和内部器官中胶原的生成，并且据信它具有抗老化或抗皱纹的效果[Bickoff，E.M.等，J.Anim.Sci.，19，4(1960)]。但是在黑豆中香豆雌酚的含量极少，因此简单的提取方法达不到所需效果。因此，本发明的目标是以大量合成的方式来生产香豆雌酚并将其与具有优异抗氧化效果的材料如阿魏酸结合起来，由此在化妆品领域开发一种具有实质性抗老化效果和改进皮肤弹性效果并兼有美白效果的新材料。
尽管已知大约有三种合成香豆雌酚的方法，但合成香豆雌酚并未统一化。本发明人使用了这三种方法之一[E.M.Bickoff等，J.Am.Chem.Soc.，80，4381(1958)]。所使用的方法是由总共7个步骤组成的总合成方法。本发明生产了一种具有较强抗氧化效果并通过加速皮肤结缔组织的生成而兼有抗老化和皮肤美白效果的新材料。
附图简述

图1表明根据本发明的3，9-二阿魏基香豆雌酚的合成方法和化学结构。
图2表明分别在第一组和对照组无毛大鼠的皮肤中有关胶原增加的组织学试验结果，其中在第一组中使用本发明的3，9-二阿魏基香豆雌酚。(A原生质，B胶原(蓝)，C细胞核，D皮脂腺，E汗腺，F脂肪，G神经层)。
发明详述(1)香豆雌酚的合成为了研究所合成的材料的物理和化学性能，使用Mel-TempII(实验室设备，美国)无校准来测量熔点。为了研究合成的中间体材料和最终化合物的结构，使用日立CW-60MHz和Varian FT-500MHz的1H-NMR光谱仪得到1H-NMR谱图，使用Varian FT-500MHz的13C-NMR光谱仪得到13C-NMR谱图，使用Jasco FT-IR-5300光谱仪得到红外谱图，使用Carry UV-VIS光谱仪得到紫外吸收谱图。化学位移以δ单位示出，以TMS(四甲基硅烷)作为内部标准物，并且数据以“化学位移(积分强度，多重性，偶合常数)”记录。
作为合成香豆雌酚的第一个步骤，50克2，4-二甲氧基苯甲醛、40克饶丹宁和150克乙酸钠溶解在200毫升乙酸中，然后加热到约130℃以合成2，4-二甲氧基苯亚甲基-饶丹宁。该产物几乎不溶，并且在瓶中迅速变成固体。将其冷却后，加入200毫升蒸馏水以萃取乙酸钠和乙酸。随后过滤此固体产物，并用过量蒸馏水洗涤直至乙酸的味道几乎都除去。用约250毫升的热乙醇萃取并除去剩余的杂质直至获得细小的针状黄色产物。
作为合成2，4-二甲氧基苯基硫代丙酮酸的第二个步骤，将20克第一步得到的2，4-二甲氧基苯亚甲基-饶丹宁漂浮在80毫升15％的氢氧化钠水溶液和20毫升14％的硫酸钠的混合物中，然后在氮气中将其搅拌并加热到100℃(大约10分钟)直至固体完全溶解。此混合物在冰浴中冷却并设置pH值为2-4以得到沉淀，过滤此沉淀物，用蒸馏水洗涤，然后用200毫升乙酸乙酯萃取。除去水层后，完全浓缩乙酸乙酯以得到暗橙色的针状晶体。
作为合成2，4-二甲氧基苯基丙酮酸肟的第三个步骤，18.79克甲醇钠溶解在无水甲醇中，加入盐酸化羟基胺浓缩水溶液并搅拌5分钟以得到羟基胺。过滤羟基胺溶液之后，加入24克2，4-二甲氧基苯基硫代丙酮酸，并回流加热直至不再排出硫化氢(大约1小时)。
冷却反应后的混合物并在减压下除去甲醇。然后用过量的5％氢氧化钠萃取出极少量的杂质，然后沉淀并过滤。通过在水溶液中加入200毫升乙酸乙酯来萃取和除去杂质后，用35％的盐酸水溶液将其pH值设定在2.0以萃取出固体产物。萃取出的固体产物用200毫升乙酸乙酯再萃取以除去残余的水，再次真空浓缩并除去乙酸乙酯。最后抽真空以得到细小的针状晶体。
作为合成2，4-二甲氧基苯基乙腈的第四个步骤，10克干燥的肟和6毫升无水乙酸酯在水浴中一起加热到100℃。它们非常剧烈地反应2-3分钟。加入约50毫升蒸馏水后剧烈搅拌之后，它们呈油状，然后立即转变为固体。用稀碳酸氢钠水溶液洗涤，然后用2-丙醇再蒸馏，得到象牙状粗针状晶体。
作为合成α-(2，4-二甲氧基苯基)-2，4-二羟基乙酰苯的第五个步骤，4.4克2，4-二甲氧基苯基乙腈和8克间苯二酚溶解在50毫升无水乙醚中，用HCl气体饱和约2小时，然后在0℃保持5天。过滤沉淀在乙醚溶剂中的酮亚胺盐，然后加到蒸馏水中，随后在100℃加热直至形成透明的板状沉淀物。过滤此沉淀物，并在填充有蓝色二氧化硅的干燥器中真空干燥。
作为合成3-(2，4-二甲氧基苯基)-4，7-二羟基香豆素的第六个步骤，6.69克α-(2，4-二甲氧基苯基)-2，4-二羟基乙酰苯和4.1毫升氯代甲酸甲酯在150毫升无水丙酮中回流并加热4小时。冷却反应混合物，用300毫升蒸馏水稀释，然后用35％的盐酸酸化。过滤生成的沉淀物，通过真空蒸发除去丙酮，在残留液中残留的液体和残留的沉淀物过滤，沉淀物溶解在100毫升甲醇中，加入少量茜素黄，然后加入溶于甲醇中的20％氢氧化钾直至指示剂变成暗黄色，同时在氮气中将其加热，然后再加热10分钟。
反应后的混合物冷却，并加入200毫升蒸馏水，然后用35％的盐酸酸化以得到沉淀物。将沉淀物重结晶以得到白色粉末。作为合成香豆雌酚的最后步骤，在第六个步骤中得到的1.00克香豆素和2克盐酸苯胺在氮气中于210-220℃加热4小时。冷却后的反应混合物用蒸馏水洗涤以除去盐酸苯胺，用少量乙酸乙酯和丙酮除去暗粉红色的杂质。
纯化到一定程度后，将其溶解在丙酮和甲醇的混合物中，并用150毫克活性炭加热10分钟。用填充有硅藻土的过滤器将活性炭过滤掉，然后将其真空浓缩直至残留约200毫升溶剂。残留的溶剂在常温下放置，然后过滤所得沉淀物。过滤后的香豆雌酚在真空干燥器中彻底干燥。为了证实在各个步骤所得到的材料以及它们的纯度，分析它们的熔点以及各种光谱数据并与参考文献做对比。
至于在第一个步骤中合成的2，4-二甲氧基苯甲饶丹宁，熔点为270-273℃(参考文献中为275℃)，产率为90％。
至于在第二个步骤中合成的2，4-二甲氧基苯基硫代丙酮酸，产率为86％，熔点为166-168℃(参考文献中为168-170℃)。
至于在第三个步骤中合成的2，4-二甲氧基苯基丙酮酸肟，产率为91％，熔点为149℃(参考文献中为149℃)。在傅立叶变换红外光谱中，峰位置在3232，3077，2961，1697，1616，1588，1509，1467，1422和1210cm-1，在1H-NMR(DMSO-d6，60MHz)光谱中，峰的位置在6.89(1H.m)，6.50(2H.m)，3.80(3H.s)，3.75(3H.s)和3.70(2H.s)ppm。
至于在第四个步骤中合成的2，4-二甲氧基苯基乙腈，产率几乎定量，Rf为0.70(己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)，熔点为76℃(参考文献中为76℃)。在傅立叶变换红外光谱(IBr)中，峰位置在2952，2848，2244，1620，1509，1413，1267，1217，1044cm-1，在1H-NMR(CDCl3，60MHz)光谱中，峰的位置在7.24(1H，d，9.6Hz)，6.50(2H.m)，3.85(3H.s)，3.81(3H.s)，3.60(2H.s)ppm。
至于在第五个步骤中合成的α-(2，4-二甲氧基苯基)-2，4-二羟基乙酰苯，产率为35％，Rf为0.36(己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)，熔点为155℃(参考文献中为156℃)。在傅立叶变换红外光谱(KBr)中，峰位置在3261，3006，2951，1634，1507，1235，1154，1134cm-1，在1H-NMR(CDCl3，60MHz)光谱中，峰的位置在7.78(1H.m)，7.03(1H.m)，6.40(4H.m)，4.10(2H.s)，3.75(6H.d)ppm。
至于在第六个步骤中合成的3-(2，4-二甲氧基苯基)-4，7-二羟基香豆素，产率为87％，Rf为0.30(己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)，熔点为260-263℃(参考文献中为263-264℃)。在傅立叶变换红外光谱(KBr)中，峰位置在3343，3121，2968，2941，2851，1689，1622，1514，1277cm-1，在1H-NMR(DMSO-d6，60MHz)光谱中，峰的位置在7.78(1H.m)，7.15(4H.m)，7.70(4H.m)，3.82(3H.s)，3.75(3H.s)ppm。
至于在最后的步骤中合成的香豆雌酚，产率为70％，Rf为0.54(己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)，熔点为382-383℃(参考文献中为385℃)。在傅立叶变换红外光谱(KBr)中，峰位置在3377，1705，1631，1499，1264，1092，1014cm-1，在1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)光谱中，峰的位置在7.80(1H.d，8.42Hz)，7.66(1H.d，8.42Hz)，7.15(1H.d，2.20Hz)，6.91(3H.m)ppm。
13C-NMR(DMSO-d6，100MHz)光谱中，峰的位置在165.23，163.45，162.75，161.57，159.90，158.60，126.64，124.57，118.55，117.82，117.74，108.10，107.05，105.99，102.66ppm，这表明合成进行地很好。
第五个步骤的产率较低，这在参考文献中也发现了。因此加倍反应时间并提高反应温度是无效的。据信该反应符合动力学方面，进行的并不好。通常总产率约为15％。
实施本发明的最佳模式实施例1阿魏酸酯衍生物，合成3，9-二阿魏基香豆雌酚为了通过阿魏酸和香豆雌酚的酯化反应得到新的合成材料3，9-二阿魏基香豆雌酚，阿魏酸购于Sigma公司，香豆雌酚在上述方法中合成。
至于用来确定合成材料的物理性能的方法，熔点用Mel-TempII(实验室设备，美国)来测定，无校准。合成材料的结构用BrukerFT-300MHz 1H-NMR光谱仪、Bruker FT-75MHz 13C-NMR光谱仪、Jasco-FT-IR 5300光谱仪和UV-VIS光谱仪来确定。化学位移用偏离内部标准物TMS(四甲基硅烷)的δ单位来指示，并且数据记录为“化学位移(积分强度，多重性，偶合常数)(Hz)”。
合成方法将详细解释。与气体吸收管连接的冷凝器接到100毫升的两口圆底烧瓶上，加入152毫克阿魏酸和5毫升THF，阿魏酸完全溶解。然后，加入110毫克亚硫酰氯并在水浴中加热和搅拌。以30分钟的时间间隔收集少量样品，并用甲醇加热1分钟。然后进行用来检测未反应材料存在的TLC测试以确定反应的终点(大约1小时)。反应结束后，THF真空抽干，加入100毫克香豆雌酚和15毫升DMSO并完全溶解。加热同时搅拌之，以1小时的时间间隔进行TLC测试以检测反应。反应结束后，反应物冷却至室温，加入5％的碳酸氢钠水溶液20毫升，然后搅拌10分钟。然后，将其过滤以除去不溶的固体。过滤后的液体加入5％的盐酸以使pH值设定在6-7，然后萃取出最终的产物。萃取后的产物过滤并用蒸馏水洗涤数次以除去酸和碱，然后在填充有二氧化硅的干燥箱中真空干燥1天以得到褐色的化合物(图1) 。
熔点高于400℃。FT-IR(KBr)光谱中各峰的位置在3423，2943，1728，1633，1597，1508，1417，1499，1257，1118，1030cm-1，在1H-NMR(DMSO-d6，300MHz)光谱中，峰的位置在7.91(1H.d)，7.86(1H.d)，7.77(1H.m)，7.72-7.68(2H.m)，7.58-7.44(3H.m)，7.29-7.27(4H.m)，7.02-6.97(2H.m)，6.84-6.64(2H.m)，3.87(3H.s)，3.85(3H.s)ppm。
13C-NMR(DMSO-d6，100MHz)光谱中，峰的位置在165.20，163.38，162.55，161.02，159.10，158.24，156.24，152.20，150.82，149.80，148.48，146.19，145.27，134.06，129.47，127.21，126.71，125.80，125.55，124.60，122.58，118.01，117.66，117.58，115.99，115.56，114.16，111.12，110.45，107.84，107.38，106.12，102.56，100.94，98.45，56.20，55.98ppm。这些数据表明合成了具有高纯度的化合物。
实施例2测量阿魏酸酯衍生物的美白和抗氧化活性合成的3，9-二阿魏基香豆雌酚溶解在1，3-丁二醇中，以生成0.1％(wt/wt)的溶液。通过测定酪氨酸酶抑制效应并使用NBT法来测量美白活性和抗氧化活性。0.1％的维生素C、0.1％的维生素E、曲酸和胚乳被用作样品。
为了测量本发明的美白效果，100毫升0.2mg/ml的1-酪氨酸溶液和5毫升680单位/毫升的酪氨酸酶溶液(3400单位/毫克稀释5倍)。空白试验的溶液是1毫升酪氨酸+1毫升磷酸缓冲液+1毫升蒸馏水。测试程序如下表1

1)混合A、B和C，在37℃保温30分钟。
2)加入D，保温30分钟。
3)10分钟±10秒后，将其取出并在冷冻条件下用冰使反应终止。
4)与对照样品比较吸光度，测试对照组的吸光度，然后测试空白测试组的吸光度(在475nm处)。
酪氨酸酶活性抑制效应(％)按以下方法进行计算，结果列于表2中。
酪氨酸酶活性抑制效应(％)[1-(E-B/C)]×100(B空白测试组，C对照组，E测试组)
在结果中，3，9-二阿魏基香豆雌酚的酪氨酸酶抑制效应大于维生素C或胚乳的抑制效应，但是它要小于曲酸的抑制效应。结果表明3，9-二阿魏基香豆雌酚可以用作美白材料。
表2

为了测定抗氧化效果，由黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶产生的活性氧用NBT法来测量，并且测定被测材料的活性氧消除效果。活性氧由黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶产生。通过测量在560nm波长处由活性氧和氮蓝四唑(NBT)的反应产生的蓝色来测定活性氧。
使用以下样品。
1)0.05M(50mM)Na2CO3缓冲液(MW＝105.99)一种溶液，其中5.25克(50mM)Na2CO3(Wako纯化学品有限公司)溶解在纯水中，然后混合50mM NaHCO3(MW＝84.01)并将pH设定在10.2。
2)3mM黄嘌呤溶液45.6mg黄嘌呤(Nakarai化学公司，MW＝152.11)溶解并设定在10毫升。
3)3mM EDTA溶液四乙酸乙二胺钠(Tojin化学公司，mw＝60.1)溶解并设定在3mM。
4)0.15％的BSA溶液15毫克BSA(V级，粉末，Sigma)溶解并设定在10毫升。
5)0.75mM NBT溶液61.32mg氮蓝四唑(MW＝817.65，Tokyo化学公司)溶解于蒸馏水中并设定在100毫升。
6)黄嘌呤氧化酶溶液黄嘌呤氧化酶(Boehringer)稀释约100倍，以至其空白测试的吸光度范围在0.2-0.23。换句话说，用纯水稀释以至吸光度变化为A560＝0.3/20分钟。
7)6mM CuCl2溶液102.29mg CuCl2·2H2O(MW＝134.45) 溶解于蒸馏水中并设定在100毫升。
使用以下的测量方法1.0.05M Na2CO3-2.4ml2.3mM黄嘌呤溶液-0.1ml3.3mM EDTA容液-0.1ml4.BSA溶液-0.1ml5.0.72mM NBT溶液-0.1ml6.黄嘌呤氧化酶溶液-0.1ml7.6mM CuCl2溶液-0.1ml(1)将1、2、3、4和5加入到小瓶中，再加入0.1ml样品溶液，在5℃保温10分钟。
(2)加入6并立即搅拌，然后在25℃培养20分钟。
(3)加入7后，反应终止，然后测量在560nm处的吸光度。
(4)按同样方法进行空白测试，除了使用蒸馏水来代替样品溶液并测量吸光度(Bt)。
(5)按同样方法进行样品的空白测试，除了使用蒸馏水来代替6并测量吸光度(Bo)。
按以下方法计算效果，结果列于表3中。
抑制比例(％)＝[1-(St-So)/(Bt-Bo)]×100St酶反应完成后样品溶液在560nm处的吸光度Bt酶反应完成后空白测试溶液在560nm处的吸光度So反应之前不添加酶时样品溶液在560nm处的吸光度Bo反应之前不添加酶时空白测试溶液在560nm处的吸光度结果表明其抗氧化作用与已知作为抗氧化剂的生育酚类似，但是不能测量维生素C的抗氧化作用，因为其抗氧化作用太强以至于它会与用来测量该效果的其它试剂反应。
表33，9-二阿魏基香豆雌酚的抗氧化活性

实施例33，9-二阿魏基香豆雌酚的细胞毒性和活性检测细胞为取自人的成纤维细胞(ATCC，Hs68)，在37℃于5％CO2，100％湿度的条件下培养于加有10％FBS的DMEM培养基中。于96孔板中接种细胞(1×105个细胞/毫升)并在37℃孵育24小时。用0.2m的滤器灭菌后的样品按照固定浓度加入，并进一步在37℃孵育24小时。然后加入MTT试剂并在37℃孵育4小时，随后移去培养液。加入1N的NaOH异丙醇溶液后搅拌20分钟，测量在565nm处的吸光度。然后通过与未处理的细胞(存活率100％)比较来确定细胞程序死亡的浓度。
1，3-丁二醇中的50μM 3，9-二阿魏基香豆雌酚逐级稀释以找到未显示细胞程序死亡的浓度，结果在78μM(0.0048％)的范围时未显示细胞程序死亡。在LD50的细胞活性为20％，这是令人满意的水平。
表4

实施例43，9-二阿魏基香豆雌酚的胶原形成效果(胶原增殖促进效应的皮肤组织测试)为证实合成的3，9-二阿魏基香豆雌酚的胶原形成效果，准备10只雌性无毛8周大的大鼠。从2只大鼠上取皮，并用皮肤的侧部和中部制备标准染色样品以研究胶原增殖水平。其它8只大鼠分为两组，即应用组和对照组。
在相同的测试条件下，应用组和对照组的整体(除了头部和腹部)用0.1％(wt/wt)3，9-二阿魏基香豆雌酚的1，3-丁二醇溶液和1，3-丁二醇溶液处理15天和30天。
分别从应用组和对照组中选出2只大鼠，切下它们的皮肤，然后由皮肤的侧部和中部得到染色样品。30天后，以同样的方式得到皮肤染色样品，对于对照组和应用组得到的10个染色皮肤样品，胶原增殖促进效果根据8周大的皮肤情况做比较。2周后，与最初的8周大对照组和1，3-丁二醇应用对照组比较，在3，9-二阿魏基香豆雌酚中发现胶原的合成和增殖。30天后在3，9-二阿魏基香豆雌酚应用组中，真皮层的胶原增殖增加并且组织密度提高。由此结果，在实验上证实3，9-二阿魏基香豆雌酚在胶原合成和胶原增殖促进方面是效果优异的(图2)。
实施例5、6和7在这些实施例中，含有按照实施例1的3，9-二阿魏基香豆雌酚的化妆品做临床上的比较。临床测试用化妆品制剂是如表4中的面霜。
首先，加热表5中的B相并在70℃保温，然后向其中加入A相以预乳化，随后用均质混合器均匀乳化，然后缓慢冷却以制备面霜。(实施例5-7，对比例)表5代表的面霜应用于5名被测女性对象(20-35岁)的右脸，每日两次，持续一个月。试验结束后，她们脸的颜色用影像分析仪做比较，并按以下标准评价最暗为5，中等为3，最亮为1。
表6比较了使用实施例5面霜的被测对象和使用对比例面霜的被测对象的脸颜色。
如表6中所示，使用含有3，9-二阿魏基香豆雌酚的面霜的被测对象的脸表现出更好的皮肤颜色改善效果。
表5面霜组合物

表6面霜的测试结果

结果表明本发明具有优异的皮肤改善效果实施例88克95％的乙醇，0.05克聚吡咯烷酮，0.1克油醇，0.2克聚氧乙烯单油酸酯，0.2克香精，0.1克甲基对羟苯甲酸酯，少量抗氧化剂和少量颜料混合并溶解。混合溶液中加入0.05克实施例1的3，9-二阿魏基香豆雌酚和85.33克纯化水中的5克甘油，搅拌以提供具有皮肤改善效果的化妆水。
实施例91.2克鲸蜡醇，10克角鲨烷，2克凡士林，0.2克乙基对羟苯甲酸酯，1克单硬脂酸甘油酯，1克聚氧乙烯(加入20摩尔)单酯和0.1克香精混合并加热到70℃。然后将0.5克实施例1的3，9-二阿魏基香豆雌酚、5克双丙甘醇、2克聚乙二醇1500、0.2克三乙醇胺和76.2克纯化水在75℃溶解。两种溶液混合并乳化，然后冷却以提供具有皮肤改善效果的水/油溶液。
实施例105克95％的乙醇，1.2克聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，0.3克Kitullose，0.2克透明质酸，0.2克维生素E乙酸酯，0.2克甘草酸，0.1克乙基对羟苯甲酸酯，1克实施例1的3，9-二阿魏基香豆雌酚和适量颜料混合以提供具有皮肤改善效果的化妆品溶液。
根据本发明的3，9-二阿魏基香豆雌酚不仅具有优异的美白效果和抗氧化效果，而且非常安全，并且可以应用于各种美容用的化妆品。


本发明涉及一种含有3,9－二阿魏基香豆雌酚的皮肤美容产品,特别是含有一种阿魏酸键合在香豆雌酚上的化合物的皮肤美容产品。该皮肤美容产品具有几种优异的改善美容失调的效果,诸如抗老化效果、美白效果和毛发种植效果。