高分子量的夏枯草多糖及其制备方法与在免疫药物中的应用的制作方法[0002]夏枯草(Prunella vulgaris L.),欧洲地区称“self -heal”,俗名羊肠菜、灯笼头、铁色草、棒柱头花、大头花等，为唇形科夏枯草属植物夏枯草的干燥果穗。夏枯草属植物是一种多年生植物，广泛分布于欧洲和中国，中国主要分布于江苏、浙江、安徽及湖北等地，产4种及3变种，其中I种为引种栽培。其性寒，辛、苦、入肝、胆经，具有清肝火、消肿止痛、清热解毒等功效。夏枯草是一种药食同源的草本，在中国民间，夏枯草作为食疗滋补品被广泛用于治疗咽喉痛、减少发热和促进伤口的愈合等；作为中药用于治疗黄疸、肝炎、糖尿病及肺结核等疾病；在华南地区作为凉茶配方和营养靓汤的成分之一。研究表明夏枯草富含许多重要的生物活性物质，主要包括多糖、三萜及其苷类、留醇及其苷类、黄酮类、香豆素、有机酸及挥发油等，其主要药理作用表现在降血压、降血脂、抗病毒、抗菌、抗氧化、免疫刺激作用和抗肿瘤等方面。[0003]天然植物多糖作为一类具有生物活性的大分子物质，近年来得到广泛的研究，现代医学研究表明，多糖具有抗氧化、免疫调节及抗肿瘤等多种生物活性。目前，发明专利CN1965894A公开了一种具有免疫活性的夏枯草多糖组合物及其制备方法和应用。然而国内外未有可用作药物的制备和使用的报道。而且，关于夏枯草多糖提取方法的报道主要采用传统热水浸提法，此种方法，由于植物细胞壁不易破坏，提取时间较长，提取率低，造成能源和资源浪费。
[0004]针对上述情况，本发明所解决的技术问题在于一种高分子量的夏枯草多糖的制备方法及应用，提供一种无毒副作用且具有较强免疫刺激活性的临床药物或保健品。[0005]本发明的目的通过如下技术方案实现:[0006]一种高分子量的夏枯草多糖的制备方法，包括以下步骤:[0007](I)将夏枯草果穗干燥后，粉碎，过筛，加入乙醇加热回流，脱色和除去小分子醇溶性物质，过滤处理得残留物，残留物重复加入乙醇加热回流2~3次，在45~60°C的鼓风干燥箱中干燥24~48h ；
[0008](2)将步骤⑴处理所得的夏枯草样品与蒸馏水配成固液比为1:15~1:35，置于超声场条件下，超声输出功率为100~300W，频率为15~50KHZ，处理时间10~30min，温度25~40°C ;然后将物料泵入高压场中，压力为100~500MPa，温度为100~130°C，时间10~30min，然后5~1s内减压到标准大气压，将物料泵回超声场中进行超声处理后，再进行高压处理，循环周期为3~5次；所述循环周期是指物料先超声处理再进行高压处理的一次循环过程；离心分离得提取液，离心力4500~1000g,时间5~1min,在45~65°C下减压浓缩到原体积的1/5~1/10，得多糖浓缩液；
[0009](3)在多糖浓缩液中加入Sevag试剂,多糖浓缩液与Sevag试剂的体积比为3:1~6:1,振荡20~30min，离心分离糖液，离心力4500~1000g,离心时间5~1min,重复进行10~20次；
[0010](4)将(3)中脱蛋白后的浓缩液加入到大孔树脂，进行静态吸附，浓缩液与大孔树脂的体积比为5:1~2:1，温度35~50°C，时间4~6h，过滤得滤液；
[0011](5)在(4)中滤液中加入无水乙醇，边搅拌边加入，使乙醇体积浓度达到65~85%,O~5°C冷藏室中静置12~24h，离心得沉淀的多糖，离心力4500~lOOOOg，时间10~15min,冷冻干燥得夏枯草粗多糖；
[0012](6)将粗多糖溶于蒸馏水，配制浓度为20~30mg/mL的多糖溶液，上样于DEAE - S印harose柱，上样量体积与柱体积的比为1:3~1:5，用蒸馏水进行洗脱，流速
0.5~2mL/min,分管收集,每管5~1mL,苯酹硫酸法检测多糖,将糖反应阳性收集液合并，45~65°C下减压浓缩，冷冻干燥得纯化的夏枯草多糖；所述阳性收集液为1/2最大吸光值范围的收集液。
[0013]为进一步实现本发明目的，优选地，所述乙醇体积浓度为95% ;所述过筛为过30~50目筛。所述步骤(3)中Sevag试剂为氯仿与正丁醇的混合液，其体积比为3:1~6:1。所述步骤(4)中大孔树脂为大 孔树脂D101，聚酰胺树脂或大孔树脂D354FD。所述步骤(6)制备的多糖分子量范围为1000~4000K道尔顿。步骤(5)和(6)中所述冷冻干燥是在-50±5°C，0.08~0.1MPa真空度下干燥干燥24~48h，干燥后的样品中水分的质量百分含量低于4%。所述加入乙醇加热回流为控制夏枯草粉与乙醇质量比为1:3~1:6，温度65~85°C，回流时间3~5h。
[0014]一种高分子量的夏枯草多糖，由上述制备方法制得。
[0015]所述夏枯草多糖在制备提高免疫力的临床药物和保健品中的应用。
[0016]本发明夏枯草多糖具有较强的免疫刺激活性，且对人体正常细胞无细胞毒性，可作为提高免疫力的临床药物或保健品。本发明的夏枯草多糖以口服和注射给药的形式使用，主要制成口服液、胶囊和注射针剂。
[0017]以上操作步骤如无特别说明，均按本领域常规操作。
[0018]与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果:
[0019](I)相比传统热水浸提技术，本发明采用超声和高压循环处理技术来进行多糖提取，提取时间短，提取率高，经测定夏枯草多糖提取率提高20~45%，多糖产率为7~10%。
[0020](2)本发明的夏枯草多糖，分子量范围为1000~4000K道尔顿，主要由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比百分含量范围分别为20~25%，50~60%，5~9%和6~12%，主要以10~25%的I —和I — 6糖苷键，60~70%的I — 3糖苷键连接组成，而且存在较长的侧链和较多的分支的高分子量的新型杂多糖。
[0021](3)本发明的夏枯草多糖由于含有较多的I — 3和I — 6糖苷键连接的高分子量葡聚糖，同时具有较多的分支结构，所以能够显著刺激小鼠巨噬细胞RAW246.5分泌抗炎因子，包括一氧化氮NO,肿瘤坏死因子TNF - α和白细胞介素IL - 6,且对小鼠巨噬细胞RAW246.5无细胞毒性，同时具有抗癌作用，可用作非特异性免疫临床药物或保健品。



[0022]图1为实施例1产品的紫外光谱扫描曲线图
[0023]图2为实施例1产品的GPC谱图
[0024]图3为实施例1产品的红外光谱图
[0025]图4为实施例1产品对小鼠巨噬细胞RAW246.5分泌一氧化氮(NO)的影响。
[0026]图5为实施例1产品对小鼠巨噬细胞RAW246.5分泌肿瘤坏死因子(TNF - α )的影响。
[0027]图6为实施例1产品对小鼠巨噬细胞RAW246.5分泌白细胞介素(IL-6)的影响。
[0029]实施例1
[0030](I)将夏枯草果穗干燥后，用粉碎机粉碎得到夏枯草粉，过30目筛，称取300g，加入900g的95% (v/v)乙醇，65°C回流3h，过滤得残留物，重复上述操作2次，残留物在45°C的鼓风干燥箱中干燥24h ；
[0031](2)称取(I)中处理后的夏枯草粉200g，加入蒸馏水进行水煮浸提，料液质量比为1:15，置于超声场条件下，超声输出功率为100W，频率为15KHz，处理lOmin，温度25°C;然后将物料泵入高压场中，压力为100MPa，100°C下lOmin，然后5s内减压到标准大气压，将物料泵回超声场中进行超声处理后，再进行高压处理，循环周期为3次，离心处理分离提取液，离心力4500g,时间5min,在45°C下减压浓缩到原体积的1/5,得多糖浓缩液；
[0032](3)在⑵浓缩液中加入Sevag试剂，使浓缩液与Sevag试剂的体积比为3:1，振荡20min,离心分离糖液,离心力5500g,时间5min,重复操作10次；
[0033](4)在(3)中处理液中加入大孔树脂DlOl，进行静态吸收，使浓缩液与大孔树脂的体积比为5:1，温度35°C，时间4h，过滤得滤液；
[0034](5)在⑷滤液中加入无水乙醇，边搅拌边加入，使乙醇体积浓度达到65%，4°C下静置12h，离心1min得沉淀的多糖，离心力4500g，冷冻干燥36h，得夏枯草水溶性粗多糖，经检测得夏枯草粗多糖的提取率为7.53%。
[0035](6)纯化:将粗多糖溶于蒸馏水，配制浓度为20mg/mL的多糖溶液，上样于DEAE - Sepharose柱，上样量体积与柱体积的比为1: 3，用蒸馏水溶液进行洗脱，流速ImL/min，分管收集，每管5mL，苯酚硫酸法检测多糖，将糖反应阳性收集液合并，45°C下减压浓缩，冷冻干燥36h得纯化的夏枯草多糖，其产率3.12%，呈白色棉絮状。
[0036]夏枯草多糖的鉴定:
[0037](I)样品中多糖含量的测定:多糖含量％ =总糖含量/样品质量X 100。总糖含量采用苯酚-硫酸法进行测定。经测定该夏枯草多糖中糖含量为98.5%。
[0038](2)溶解性测定:称取1mg夏枯草多糖,置于1mL离心管中，加入5mL蒸懼水,镟涡振荡lOmin，在离心力1000g下，离心10分钟，观察离心管底部有无沉淀。观察发现夏枯草多糖溶液经离心无沉淀，表明该夏枯草多糖的水溶解性较好。[0039](3)碘-碘化钾反应实验:配制浓度为lmg/mL的夏枯草多糖溶液，加入1.2mL的碘试剂(含0.02%的I2和0.2%的KI溶液)，混匀后在300 - 700nm波长范围内进行紫外扫描。结果表明多糖样品与碘试剂的反应液在360nm处有最大吸收峰,而在565nm处无最大吸收，证明该夏枯草多糖存在较长的侧链和较多的分枝。
[0040](4)紫外光谱扫描:配制多糖浓度为lmg/mL的溶液，以蒸馏水为对照，然后在190 - 400nm波长范围内进行紫外扫描。如附图1所示，该多糖样品在260nm、280nm波长处没有紫外吸收，证明该夏枯草多糖不含蛋白质和核酸。
[0041](5)分子量的测定:多糖样品的分子量用HPPC进行测量，采用美国沃特斯有限公司的凝胶渗透色谱仪(Water Breeze GPC)，色谱柱为TSK -G5000PffXL和TSK -G3000PffXL串联柱，流动相为0.02moL/L磷酸缓冲溶液(PH6.0);流速0.6mL/min ;柱温35°C，检测器为2414型示差折光检测器。如附图2GPC图谱所示，根据标准曲线计算得夏枯草多糖为平均分子量约为1700K道尔顿。 [0042](6)红外光谱分析:取多糖样品约2mg，通过与KBr混合压片，放入傅里叶变换红外光谱内，在400 -^OOcnr1区间进行扫描，采集样品的红外吸收图谱。如附图3红外光谱(IR)所示，多糖样品在3422CHT1附近的宽峰是O-H键的伸缩振动产生的，2925CHT1左右的较弱的峰是C - H键的伸缩振动，在1422cm ―1附近均有很小的吸收峰是C - H的变角振动峰，证明该夏枯草多糖是一种多糖类物质。
[0043](7)单糖组成测定:多糖样品首先经过水解成单糖，再经衍生化后生成糖腈乙酸酯衍生物，采用气相色谱分析多糖样品中的单糖组成，气相色谱柱为TR - 5MS弹性毛细管柱，载气为99.999%高纯氦气，升温程序:初始柱温100°C，保持2min，以5°C /min的升温速度升至280°C，保持5min，流速lmL/min，进样量I μ L，分流比10: 1，进样口温度250°C。结果表明该夏枯草多糖样品含阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔百分比含量分别为 24.2%, 55.9%, 1.9%,8.3%,9.7% ο
[0044](8)高碘酸氧化和Smith降解:多糖样品经过高碘酸氧化，然后再进行Smith降解后，进行衍生化处理制备糖腈乙酰酯衍生物。采用气相色谱仪Agilent6890T进行检测，气相色谱柱HP - 1701毛细管柱，检测器温度270°C ;汽化室温度220°C，升温程序:初始温度180°C，以2V /min的升温速度升至220°C，保持lmin，以5°C /min的升温速度升至260°C ；载气氢气流速40mL/min,空气流速为450mL/min,氮气流速为25mL/min,不分流。结果表明夏枯草多糖含有23.5%的I —和I — 6糖苷键，13.1 %的I — 2和I — 4糖苷键及63.4%的I —3糖苷键。
[0045]综上所述，本实施例的多糖是一种呈白色棉絮状，多糖含量达98%以上，水溶性好，不含蛋白质和核酸等杂质，含阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔百分比含量分别为24.2%,55.9%,1.9%,8.3%,9.7%，糖苷键由23.5%的I —和I — 6糖苷键，13.1%的I — 2和I — 4糖苷键及63.4%的I — 3糖苷键相连接，存在较长的侧链和较多的分枝的高分子量的新型杂多糖。
[0046]实施例2
[0047](I)将夏枯草果穗干燥后，用粉碎机粉碎得到夏枯草粉，过50目筛，称取300g，加入ISOOg的95% (v/v)乙醇，85°C回流5h，过滤得残留物，重复上述操作3次，残留物在60°C的鼓风干燥箱中干燥48h;[0048](2)称取(I)中处理后的夏枯草粉200g，加入蒸馏水进行水煮浸提，料液质量比为1:35,置于超声场条件下，超声输出功率为300W，频率为50KHz，处理30min，温度40°C;然后将物料泵入高压场中，压力为500MPa，130°C下30min，然后8s内减压到标准大气压，将物料泵回超声场中进行超声处理后，再进行高压处理，循环周期为5次，离心处理分离提取液，离心力lOOOOg，时间lOmin，在65°C下减压浓缩到原体积的1/10，得多糖浓缩液；
[0049](3)在⑵浓缩液中加入Sevag试剂，使浓缩液与Sevag试剂的体积比为6:1，振荡30min，离心分离糖液，离心力lOOOOg，时间lOmin，重复操作20次；
[0050](4)在(3)中处理液中加入大孔树脂DlOl，进行静态吸收，使浓缩液与大孔树脂的体积比为2:1，温度50°C，时间6h，过滤得滤液；
[0051](5)在(4)滤液中加入无水乙醇，边搅拌边加入，使乙醇体积浓度达到85%，4°C下静置24h，离心15min得沉淀的多糖，离心力lOOOOg，冷冻干燥48h，得夏枯草水溶性粗多糖，经检测得夏枯草粗多糖的提取率10.13%。
[0052](6)纯化:将粗多糖溶于蒸馏水，配制浓度为30mg/mL的多糖溶液，上样于DEAE -Sepharose柱，上样量体积与柱体积的比为1: 5，用蒸馏水溶液进行洗脱，流速0.5mL/min，分管收集，每管5mL，苯酚硫酸法检测多糖，将糖反应阳性收集液合并，65°C下减压浓缩，冷冻干燥48h得纯化的夏枯草多糖，其产率4.82%，呈白色棉絮状。其平均分子量约为1680K道尔顿，其它结果基本同实施例1。
[0053]实施例3
[0054](I)将夏枯草果穗干燥后，用粉碎机粉碎得到夏枯草粉，过40目筛，称取300g，加入1200g的95% (v/v)乙醇，75°C回流4h，过滤得残留物，重复上述操作2次，残留物在55°C的鼓风干燥箱中干燥30h ；
[0055](2)称取(I)中处理后的夏枯草粉200g，加入蒸馏水进行水煮浸提，料液质量比为1:20，置于超声场条件下，超声输出功率为180W，频率为30KHz，处理20min，温度30°C ;然后将物料泵入高压场中，压力为300MPa，115°C下20min，然后1s内减压到标准大气压，将物料泵回超声场中进行超声处理后，再进行高压处理，循环周期为4次，离心处理分离提取液，离心力8000g，时间7min，在55°C下减压浓缩到原体积的1/8，得多糖浓缩液；
[0056](3)在⑵浓缩液中加入Sevag试剂，使浓缩液与Sevag试剂的体积比为4:1，振荡25min,离心分离糖液,离心力6000g,时间8min,重复操作15次；
[0057](4)在(3)中提取液中加入大孔树脂DlOl，进行静态吸收，使浓缩液与大孔树脂的体积比为3:1，温度45°C，时间5h，过滤得滤液；
[0058](5)在(4)滤液中加入无水乙醇，边搅拌边加入，使乙醇体积浓度达到75%，4°C下静置18h，离心12min得沉淀的多糖，离心力7000g，冷冻干燥40h，得夏枯草水溶性粗多糖，经检测得夏枯草粗多糖的提取率为8.89%。
[0059](6)将粗多糖溶于蒸馏7K，配制浓度为25mg/mL的多糖溶液，上样于DEAE -Sepharose柱，上样量体积与柱体积的比为1: 4，用蒸馏水溶液进行洗脱，流速1.5mL/min,分管收集，每管5mL，苯酚硫酸法检测多糖，将糖反应阳性收集液合并，50°C旋转蒸发浓缩，冷冻干燥36h得纯化的夏枯草多糖，其产率4.05%，呈白色棉絮状。其平均分子量约为1770K道尔顿，其它结果基本同实施例1。
[0060]实施例4[0061]实施例1夏枯草多糖的免疫刺激活性实验
[0062]实验细胞:小鼠巨噬细胞RAW246.7
[0063]细胞培养:将小鼠巨噬细胞RAW246.7分散于新鲜培养基中，并接种于培养瓶，置于37°C，5% (体积分数)CO2浓度的培养箱中静置培养。新鲜培养基为含有10% (以质量百分比计)胎牛血清，100 μ g/mL链霉素，100单位/mL青霉素的DMEM培养基。
[0064](I)取对数生长期的小鼠巨噬细胞RAW246.7，加入新鲜培养基，吹打制备成单细胞悬液，用血球计数板计数后，将细胞浓度调整约I X 16个/mL，即细胞悬浮液，接种于96孔细胞培养板(1001117孔)，置于371:、5%二氧化碳培养箱中培养。实验设调零组、实验组、空白对照组和阳性对照组。调零组为不含10yL细胞的空白孔，实验时只添加；实验组、空白对照组和阳性对照组为含有100 μ L细胞悬浮液的孔。平板最外层边缘加入无菌的PBS溶液，每孔200 μ L0
[0065](2) 24h后，待细胞贴壁后，弃去培养基，往调零组和空白对照组加入100 μ L新鲜培养基，实验组分别加入62.5、125、250、500、1000μ g/mL的不同浓度的多糖样品10yL,阳性对照组中加入100 μ L的脂多糖(LPS，50y g/mL)(药液和阳性对照均用不含血清培养基配制)，每个不同组分样本设平行的5个孔。
[0066](3)继续置于37°C、5%二氧化碳培养箱中培养24h。分别用Elisa试剂盒检测细胞上清液中一氧化氮NO，肿瘤坏死因子TNF- α和白细胞介素IL-6的含量。检测方法采用NO测试盒(Α013 - 2)购买自南京建成生物工程研究所；小鼠TNF - a ELISA试剂盒(EMC102a)，小鼠IL - 6ELISA试剂盒(EMC004)购买自欣博盛生物科技有限公司。 [0067]实验结果如附图4、5、6，与空白组相比，不同浓度的多糖能显著刺激小鼠巨噬细胞RAW246.7分泌抗炎因子NO，TNF - α和IL - 6，随着多糖浓度的增加，细胞上清液中的NO，TNF - α和IL - 6含量也逐渐增加，当多糖浓度为1000 μ g/mL时，细胞上清液中的NO，TNF - α和IL - 6含量分别为10 μ mol/L, 850pg/mL, 1600pg/mL。结果表明该多糖具有显著的免疫刺激活性。其它实施例中的多糖样品的免疫刺激活性与实施例1样品相似。
[0068]实施例5
[0069]实施例1夏枯草多糖的细胞毒性实验-MTT法
[0070]细胞培养:培养方法同实施例5。
[0071](I)取对数生长期的小鼠巨噬细胞RAW246.7，吹打制备成单细胞悬液，加入新鲜培养基，用血球计数板计数后，将细胞浓度调整约5 X 14个/mL，即细胞悬浮液，接种于96孔细胞培养板(100μL孔)，置于37°C、5% (体积分数)二氧化碳培养箱中培养。实验设调零组、实验组和对照组。调零组不加细胞，加入100 μ L培养基，实验组和对照组，每孔加Λ 10yL细胞悬浮液。平板最外层边缘加入无菌的PBS溶液，每孔200 μ L。
[0072](2) 24h后，待细胞贴壁后，弃去培养基，往调零组和对照组加入100 μ L新鲜培养液，实验组分别加入62.5、125、250、500、1000μ g/mL的不同浓度的多糖样品100 μ L，所有样品均由培养基配制，每个不同组分样本设平行的5个孔。
[0073](3)继续置于37°C、5%二氧化碳培养箱中培养48h，每孔均加入10 μ L的MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h，然后弃去培养基，每孔加100 μ L的DMS0，振荡器上振荡lOmin，在酶标仪0D570nm处测量吸光值A，并计算细胞存活率，计算公式如下:
[0074]细胞存活率%=(As - Ao)/(Ac - Ao) X 100[0075]其中As为实验组的吸光值，Ac是对照组的吸光值，Ao是调零组的吸光值。
[0076]实验结果如表1，当多糖样品浓度低于250 μ g/mL，细胞存活率增加，表明低剂量的多糖样品能促进小鼠巨噬细胞RAW246.5增殖，当多糖浓度增加到1000 μ g/mL,细胞存活率大于90%，表明该多糖样品对小鼠巨噬细胞RAW246.7基本没有细胞毒性。其它实施例中的多糖样品的细胞毒性与实施例1样品相似。
[0077]表1
[0078]