专利名称：包含强心苷的scf提取物的制作方法欧洲夹竹桃(Nerium oleander)是广泛分布于亚洲亚热带、美国西南部和地中海的观赏性植物。早已认识到其医学性质和毒物学性质。它被用于治疗例如痔、溃疡、麻疯病、蛇咬、和甚至诱导流产。夹竹桃苷是夹竹桃提取物的重要组分，是人肿瘤细胞生长的强效抑制剂(Afaq F 等 Toxicol. Appl. Pharmacol. 195 :361_369，2004)。夹竹桃苷介导的细胞死亡涉及钙流入、细胞色素C从线粒体的释放、半胱天冬酶8和3的蛋白水解过程、聚 (ADP-核糖)聚合酶裂解、以及DNA分裂。已经证实夹竹桃苷是欧洲夹竹桃(Nerium oleander)的主要细胞毒性组分 (Newman 等，J. Herbal Pharmacotherapy, vol. 13，pp. 1-15，2001)。夹竹桃苷是外源性强心苷，正常情况下在体内不存在。夹竹桃苷在人肿瘤细胞系但不在鼠科动物肿瘤细胞系内诱导凋亡(Pathak 等，Anti-Cancer Drugs, vol. 11，pp. 455-463，2000)，抑制 NF_kB 的活化 (Manna等，Cancer Res.，vol. 60，pp. 3838-3847，2000)，并且部分地通过钙介导的细胞色素 C 的释放介导细胞死亡(McConkey 等，Cancer Res.，vol. 60，pp. 3807-3812，2000)。近期完成了夹竹桃热水提取物的I期实验(Mekhail等，Am. Soc. Clin. Oncol.，vol. 20，p. 82b， 2001)。结论是可以以高至1.2ml/m2/d的剂量安全地给予夹竹桃提取物。没有发现限制剂量的毒性。除了对于肿瘤细胞的选择性细胞毒性，强心苷还可以增强细胞对离子辐射的细胞毒性作用的响应。毒毛花苷G是身体内源性强心苷，据报道它可增强A549人肺腺癌细胞的体外辐射敏感性，但在改变正常人肺纤维原细胞的辐射响应方面无效(Lawrence， Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys.，vol. 15，pp. 953—958，1988)。毒毛花苷 G 后来显示可辐射敏化不同组织学类型的人肿瘤细胞，包括鳞状细胞癌和黑素瘤(Verheye-Dua等， Strahlenther. Onkol.，vol. 176，pp. 186-191，2000)。尽管毒毛花苷 G 诱导的辐射敏化的机理还没有被完全解释，但已经发现抑制从亚致死辐射损伤的修复和提高辐射诱导的凋亡的可能性(Lawrence, 2000 ；Verheye Dua 等，2000 ；Verheye-Dua 等，Strahlenther. Onkol.，vol. 172,pp. 156-161，1996)。强心苷夹竹桃苷还能够增强细胞对离子辐射的细胞毒性作用的敏感性。参见授予Newman等的美国专利No. -10/957, 875和Nasu等，Cancer Lett. Vol 185，pp.145-151，2002。Chen 等(Breast Cancer Research and Treatment (2006)，96，1-15)提出强心苷如毒毛花苷G和洋地黄可能可以用于开发同时作为Na+，K+-ATPaSe抑制剂和ER拮抗剂的抗乳腺癌药物。Smith 等(Biochemical Pharmacology(2000),62,1-4)报告 ANVIRZEL 及其关键强心苷组分夹竹桃苷可抑制前列腺癌细胞系PC3和DU145释放纤维原细胞生长因子-2 (FGF-2)。Newman 等(J. Experimental Therapeutics and Oncology(2006)，5，167—181)才艮告用夹竹桃苷温育人恶性黑素瘤BRO细胞导致时间依赖性地形成活性氧物种超氧化物阴离子基团，它们介导线粒体损伤和细胞GSH池的损失。Newman等的美国授权前(Pregrant)专利申请公开No. -20050112059公开了通过给予夹竹桃苷可增强癌症治疗中的放射疗法。通常使用沸水从夹竹桃属(Nerium)物种的植物中提取苷。使用沸水作为提取方法以从欧洲夹竹桃(Nerium oleander)中获得活性成分的工艺可获得许多产物。其中包括夹竹桃苷、夹竹桃叶苷和其它强心苷化合物。该植物提取物可用于治疗动物的细胞增殖性疾病。以商标ANVIRZEL 出售的通过用热水提取欧洲夹竹桃(Nerium oleander)获得的夹竹桃苷提取物可购得，其包含浓缩形式或粉末化形式的欧洲夹竹桃(Nerium oleander) 热水提取物。该提取物按照由Dr. Huseyin Ziya Ozel开发的工艺制备。美国专利 No. -5，135，745描述了用于在水中制备植物提取物的程序。欧洲夹竹桃(Nerium oleander) 植物的提取涉及将叶子切片，将切片的植物叶和茎在水中蒸煮2-3小时，并滤除残余物。将混合物再次加热。所报道的水性提取物包含几种分子量为2KD至30KD的多糖、夹竹桃苷和夹竹桃苷元、奥多诺苷(odoroside)和neritaloside。所报道的多糖包括酸性均聚半乳糖醛酸或阿拉伯糖半乳糖醛酸。Muller 等(Pharmaz ie. (1991) Sept. 46 (9) ,657-663)公开了关于欧洲夹竹桃 (Nerium oleander)的水提取物的分析结果。他们报道存在的多糖主要是半乳糖醛酸。其它多糖包括鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖。Newman等(J. Herbal Pharmacotherapy, (2001) vol 1, pp. 1-16)还报告了欧洲夹竹桃(Nerium oleander)热水提取物内的多糖含量和多糖的各自的糖组成。授予Selvaraj等的美国专利No. _5，869，060涉及夹竹桃属(Nerium)物种的提取物和制备的方法。要制备提取物，将植物材料置于水中并煮沸。然后从植物物质中分离粗提物并通过过滤灭菌。然后将所得提取物冻干以制备粉末。美国专利No. -6，565，897 (Selvaraj 等的美国授权前公开No. -20020114852 和 PCT 国际公开No.-WO 2000/016793)公开了用于制备基本上无菌的提取物的热水提取工艺。Erdemoglu 等(J. Ethnopharmacol. (2003)Nov. 89(1)，123-129)基于其抗疼痛和抗炎活性公开了植物，包括欧洲夹竹桃(Nerium oleander)的水提取物和乙醇提取物的比较结果。Adome 等(Afr. Health Sci. (2003) Aug. 3 (2)，77-86 ；乙醇提取物)、el-Shazly 等(J. Egypt Soc. Parasito 1. (1996)，Aug. 26 (2)，461-473 ；乙醇提取物)、Begum 等 (Phytochemistry (1999) Feb. 50 (3)，435-438 ；甲醇提取物)、Zia 等(J. Ethnolpharmacol. (1995) Nov. 49(1) ,33-39 ；甲醇提取物)、和 Vlasenko 等(Farmatsi ia. (1972) Sept. -Oct. 21 (5),46-47 ；醇提取物)也公开了欧洲夹竹桃(Nerium oleander)的有机溶剂提取物。超临界流体提取涉及使用超临界流体选择性地提取特定的化合物。超临界流体在大气条件下是液体或气体，但在它被压缩超过其临界压力和被加热超过其临界温度时变成超临界的。超临界流体在其临界区域内具有提高的溶解力。超临界流体的性质介于气体和液体之间，并能够溶解在气态或液态时仅仅微溶或根本不溶的化合物。超临界流体用于提取这些化合物是理想的，因为超临界流体在高密度下具有高溶解力，当压力或温度被改变时在较低密度显示化合物从流体中的良好分馏和分离。Raventos等已经在2002年 (M. Raventos等Application and Possibilities of Supercritical CO2 Extraction in Food Processing Industry :An Overview, Food Sci. Tech. Int. Vol. 8(5)(2002)269-284) 描述了在食品加工工业中使用超临界二氧化碳提取的一般程序，该文献的全部内容据此被纳入本文作为参考。Singh等的美国授权前专利申请公开No. -20040247660公开了用于治疗癌症的蛋白质稳定的夹竹桃苷脂质体制剂的制备。Singh等的美国授权前专利申请公开No. -20050026849公开了包含环糊精的夹竹桃苷的水溶性制剂。‘849公开提出了包含夹竹桃苷的环糊精复合物的固体填充胶囊的制备。夹竹桃苷被作为热水提取物或化学实体提供，然后用环糊精处理以形成复合物。Singh等的美国授权前专利申请公开No. -20040082521公开了从热水提取物中制备夹竹桃苷的蛋白质稳定纳米粒制剂的方法。通过形成脂质体混合物然后蒸发其中的有机溶剂来制备纳米粒。因此保证了用于提高来自植物材料的夹竹桃苷的相对含量的方法。尽管欧洲夹竹桃(Nerium oleander)的热水提取物可以以相对低的产率提供夹竹桃苷和相关强心苷，但需要用于获得浓缩形式的强心苷包括夹竹桃苷的改良方法。夹竹桃苷包含对酸敏感的内酯环，当口服给药时使所述物质易于酸降解，因此在制备液体制剂中必须注意确保溶液内的酸性物质最少化。已知技术未曾公开包括夹竹桃属(Nerium)物种，尤其是欧洲夹竹桃(Nerium oleander)的提取物的药物制剂。本领域也未曾公开或提示包括强心苷如夹竹桃苷的超临界流体提取物。持续需要更多剂型，以合适地递送夹竹桃属(Nerium)物种的提取物组分以治疗各种疾病和病症。还持续需要通过从植物材料中提取以获得强心苷的改良方法。
本发明希望克服本领域的一些或全部固有缺点。本发明提供了包括强心苷的超临界流体(SCF)提取物。所述提取物可以通过包含强心苷的植物物料的超临界流体提取获得。所述植物物料可以是夹竹桃属(Nerium)物种或黄花夹竹桃属(Thevetia)物种植物物料。具体物种包括欧洲夹竹桃(Nerium oleander)或黄花夹竹桃(Thevetia nerifolia)。所述超临界流体提取物可以包括至少一种其它药理学活性剂，当将提取物给予受试者时， 该药理学活性剂促进强心苷的治疗功效。它可以相加或协同地促进治疗功效。本发明还提供了包括含有强心苷的SCF提取物的药物组合物。本发明的一些实施方案包括夹竹桃植物(oleander plant)，如夹竹桃属(Nerium)物种，如欧洲夹竹桃(Nerium oleander),或黄花夹竹桃属(Thevetia)物种，如黄花夹竹桃(Thevetia nerifolia)的提取物。可以按照本文所述或2005年7月28日以C. Addington的名义提交的目前未决的美国申请60/653，210和2005年7月28日以C. Addington的名义提交的美国申请11/191，650所述的方法，或通过本文所述的方法，通过超临界流体(SCF) 二氧化碳(CO2)提取植物材料如植物物料的干粉末制备所述提取物，这些文献的全部内容据此被纳入本文作为参考。SCF提取可以在改性剂的存在下进行，以提高所需化合物从植物物料中的提取。因此，本发明还提供了包含强心苷的植物物料的超临界流体提取方法。所述方法包括用超临界流体将包含强心苷的植物物料处理足以从植物物料中提取强心苷的一段时间；从超临界流体中分离植物物料；和除去超临界流体，从而形成包括强心苷的超临界流体(SCF)提取物。所述超临界流体还可以包括改性剂。所述SCF提取物还可以包括除强心苷以外的至少一种其它的药理学活性剂。所述其它活性剂可以在将提取物给予受试者时促进强心苷的治疗功效。所述其它活性剂可以相加或协同地促进强心苷的治疗功效。所述包含强心苷的植物物料可以包括夹竹桃属(Nerium)物种或黄花夹竹桃属(Thevetia)物种。本发明的组合物及其剂型的优点是它能够在口服给予后提供提取物的全部或至少主要部分的溶液，从而当置于水性环境中时，所有组分是溶解的、乳化的或分散的。溶解、 分散或乳化可以是简单溶解、胶束形成或自乳化的结果，这取决于组合物所用的赋形剂组合。在一些实施方案中，SCF提取物的溶解是非pH依赖的。另一个优点是所有提取物组分基本上完全溶解在包括所述SCF提取物的液体药物组合物中。在一些实施方案中，所述制剂包括选自水溶性(混溶的)助溶剂、水不溶性(不混溶的)助溶剂、表面活性剂、抗氧化剂、螯合剂、吸收促进剂的至少两种物质和SCF提取物的组合。本发明的一个方面提供了药物组合物，其包括·夹竹桃植物物料的超临界流体提取物；和·提取物增溶量的至少一种增溶剂。在本发明的一些实施方案中，夹竹桃植物物料包括夹竹桃属(Nerium)物种如欧洲夹竹桃(Nerium oleander)、或黄花夹竹桃属(Thevetia)物种如黄花夹竹桃(Thevetia nerifolia)(或被称为黄色夹竹桃)。所述夹竹桃植物物料是包含强心苷的植物物料。所述强心苷可以是夹竹桃苷。本发明的另一方面提供了包括胶囊壳和本文所述的药物组合物的胶囊制剂。在一些实施方案中，所述胶囊制剂包括·胶囊壳；·通过夹竹桃属(Nerium)物种的超临界流体提取获得的夹竹桃苷提取物；和·提取物增溶量的至少一种增溶剂。所述胶囊制剂可以是固体、液体或半固体。所述增溶剂可以包括单种组分或两种、 三种、四种、五种或更多种组分的混合物。所述组分可以选自水溶性(混溶的)助溶剂、水不溶性(不混溶的)助溶剂、表面活性剂和抗氧化剂。本发明的一些实施方案包括SCF提取物和·至少一种水混溶的(water miscible)溶剂；·至少一种抗氧化剂；禾口·至少一种表面活性剂。所述增溶剂为至少单一的表面活性剂，但它也可以是多种物质的组合，例如以下物质的组合a)表面活性剂和水混溶的溶剂；b)表面活性剂和水不混溶(water immiscible)的溶剂；c)表面活性剂、抗氧化剂；d)表面活性剂、抗氧化剂和水混溶的溶剂； e)表面活性剂、抗氧化剂和水不混溶的溶剂；f)表面活性剂、水混溶的溶剂和水不混溶的溶剂；或g)表面活性剂、抗氧化剂、水混溶的溶剂和水不混溶的溶剂。所述组合物任选地还包括a)至少一种液体载体；b)至少一种乳化剂；C)至少一种增溶剂；d)至少一种分散剂；e)至少一种其它赋形剂；或f)其组合。在一些实施方案中，水混溶的溶剂是低分子量(小于6000)的PEG、二醇或醇。在一些实施方案中，所述表面活性剂是PEG化的表面活性剂，即包括聚(乙二醇)官能团的表面活性剂。在口服给予或暴露至水性溶液前，组合物的一些实施方案是澄清的，另一些是混悬液。在口服给予后或在水性介质中，本发明的一些实施方案在受试者的胃肠(GI)道内形成乳液、胶束分散体或固体分散体(混悬液)。本发明的剂型适合口服给予受试者并适合治疗恶性瘤性疾病、癌症、肿瘤、病毒感染和对强心苷如夹竹桃苷有治疗响应的其它适应症、病症或症状。在用于本文时，术语“受试者”指恒温动物如哺乳动物，例如猫、狗、小鼠、豚鼠、马、牛(bovine cows)、羊和人。实施例7-9提供了用本发明的SCF提取物治疗各种病症的示例性程序。所述SCF提取物可以用于治疗直肠、肛门、结肠直肠组织、头和颈组织、食道组织、肺(非小细胞和小细胞癌两者)、 乳腺、胃、胰腺、前列腺、肝、肾、膀胱、输尿管、卵巢组织的癌，类癌瘤，骨的肉瘤，间皮瘤和中枢神经系统的瘤。所述液体组合物的一些实施方案是无水的或未向其中添加水。所述组合物可以包含已经存在于一种或多种组合物组分内的内生水(endogenous water) 0或者，所述组合物包含作为其独立组分添加的水。
下列附图形成本说明书的部分并描述了所要求保护的发明的示例性实施方案。根据这些附图和本文的描述，技术人员将能够实施本发明而无需进行过度的实验。图IA和IB描绘现有技术的热水提取物与本发明示例性的超临界流体提取物的 HPLC色谱图比较。图2描绘本发明肠溶包衣的液体填充胶囊的溶出曲线。
图3描绘作为用于比较夹竹桃苷、热水提取物和本发明SCF提取物的抑制活性的实验的一部分获得的凝胶电泳的相关带的照片。



本发明提供了包含强心苷的植物物料的超临界流体(SCF)提取物。所述提取物可以被包括在包含提取物增溶量的增溶剂的药物组合物内。当通过SCF提取来提取包含强心苷的植物如欧洲夹竹桃(Nerium oleander)时，所述提取物内包括夹竹桃苷。所述提取物还可以包含一种或多种其它SCF可提取的药理学活性剂。所述组合物可以用于治疗对强心苷有治疗响应的广泛的病症。