专利名称：用作抗肿瘤药的2,4－二(杂－)芳基氨基(－氧基)－5－取代的嘧啶的制作方法：本发明涉及嘧啶衍生物或其可药用的盐或其体内可水解的酯，它们具有细胞周期抑制活性，因此它们的抗癌(例如抗细胞增生的、抗细胞移行和/或凋亡)活性是有用的，用于治疗温血动物，例如人的方法。本发明还涉及生产所述嘧啶衍生物地方法，含有它们的药物组合物和它们在生产药物中的用途或在产生对温血动物，例如人的抗癌(例如抗细胞增生和/或移行和/或凋亡)中的用途。一族称为细胞周期蛋白的细胞内蛋白质在细胞周期中起中心作用，细胞周期蛋白的合成和降解受紧紧控制使得在细胞周期中它们的表达含量波动。细胞周期蛋白结合依赖于细胞周期蛋白的丝氨酸/苏氨酸激酶(CDK)，该联合对于细胞内的CDK(例如CDK1、CDK2、CDK4和/或CDK6)活性是必需的。尽管每种因子如何结合以调节CDK的具体细节很难理解，但两种命令之间的平衡将在整个细胞周期中发生。近来致癌基因和肿瘤抑制基团研究的会聚已确认进行细胞周期的入口的调节是肿瘤中有丝分裂期发生的关键控制点。此外，CDK显示是许多致癌基因信号途径的下游，通过细胞周期蛋白的向上调节和/或内生抑制剂的缺失的CDK活性的双调节(disregulation)显示在致有丝分裂信号途径和肿瘤细胞增生之间是重要轴。因此，人们认识到细胞周期激酶的抑制剂，尤其是CDK2、CDK4和/或CDK6(分别以S-相、G1-S和G1-S相操作)的抑制剂作为细胞增生，例如哺乳动物癌细胞的生长的选择性抑制剂应是有价值的。此外，人们相信包含在信号转导途径中的病灶粘连激酶(FAK)的抑制引导导致细胞凋亡(细胞死亡)和/或抑制细胞移行，FAK抑制剂因此作为抗癌药是有价值的。本发明基于发现某些2，4-嘧啶化合物出乎意料地抑制细胞周期激酶的效果，显示对CDK2、CKD4和CDK6的选择性，还抑制FAK，因此具有抗癌(抗细胞移行/增生和/或细胞凋亡)性质。该性质被预期在治疗与异常细胞周期和细胞增生有关的疾病，例如癌症(固体肿瘤或白血病)、纤维增生和分化疾病、牛皮癣、类风湿性关节炎、卡波济氏肉瘤、haemangioma、急性或慢性肾病、粉瘤、动脉粥样硬化、动脉再狭窄、自身免疫疾病、急性和慢性炎症、骨疾病和视网膜脉管增生的眼病中是有价值的。因此，本发明提供了式(I)的嘧啶衍生物或其可药用的盐或其体内可水解的酯 其中Q1和Q2分别选自芳基或碳连接的杂芳基；和Q1和Q2之一或Q1和Q2两者在环碳原子上被式(Ia)或(Ia’)的一个取代基取代
其中
Y是-NHC(O)-或-C(O)NH-；
Z是RaO-、RbRcN-、RdS-、ReRfNNRg-、C3-8环烷基、苯基或杂环基；其中所述苯基、C3-8环烷基或杂环基选择性地在环碳原子上被一个或多个选自Rh的基团取代；和其中如果所述杂环基团含有-NH-部分，则氮可选择性地选自Ri的基团取代；
Ra、Rb、Rc、Rd、Re、Rf和Rg分别选自氢、C1-4烷基、C2-4烯基和C3-8环烷基；其中所述C1-4烷基、C2-4烯基和C3-8环烷基选择性地被一个或多个选自Rj的基团取代；
n是0或1；
m是1、2或3；
Q3是氮连接的杂环；其中所述杂环在环碳原子上选择性地被一个或多个选自Rk的基团取代；和其中如果所述杂环基团含有-NH-部分，则氮可选择性地被选自Rm的基团取代；
G是-O-或-NR2-；
R2选自氢、C1-6烷基、C3-6烯基和C3-6炔基；其中所述C1-6烷基、C3-6烯基和C3-6炔基选择性地被一个或多个选自Rn的基团取代；
R1选自氢、卤素、羟基、硝基、氨基、N-(C1-3烷基)氨基、N，N-二-(C1-3烷基)氨基、氰基、三氟甲基、三氯甲基、C1-3烷基[选择性地-被1或2个选自卤素、氰基、氨基、N-(C1-3烷基)氨基、N，N-二-(C1-3烷基)氨基、羟基和三氟甲基取代]、C3-5烯基[选择性地被至多三个卤素取代基或被一个三氟甲基取代基取代]、C3-5炔基、C1-3烷氧基、巯基、C1-3烷基硫烷基(sulphanyl)、羧基和C1-3烷氧基羰基；
Q1是在环碳原子上选择性地被1-4个取代基取代，取代基分别选自卤素、巯基、硝基、甲酰基、甲酰氨基、羧基、氰基、氨基、脲基、氨基甲酰基、磺酰氨基、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基[其中所述C1-4烷基、C2-4烯基和C2-4炔基选择性地被一个或多个选自Ro的基团取代]、C1-4链烷酰基、C1-4烷氧羰基、杂环基、C1-4烷基S(O)a，其中a是0-2[选择性地被羟基取代]、N’-(C1-4烷基)脲基、N’，N’-二-(C1-4烷基)脲基、N’-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N’，N’-二-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、N-(C1-4烷基)磺酰氨基、N，N-二-(C1-4烷基)磺酰氨基、N-C1-4烷基氨基甲酰基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基甲酰基和C1-4链烷酰基氨基；
并且独立地，或除上述取代基之外，Q1可选择性地被1-2个分别选自芳基、C3-8环烷基和杂环基团的取代基取代；其中所述芳基、C3-8环烷基和杂环基团在环碳原子上选择性地被-个或多个选自Rp的基团取代；和其中如果所述杂环基团含有-NH-部分，则氮可选择性地被选自Rq的基团取代；
并且独立地，或除上述取代基之外，Q1可选择性地被1个C1-4烷氧基或1个羟基取代基取代；
Q2是在环碳原子上选择性地被1-4个取代基取代，取代基分别选自卤素、羟基、巯基、硝基、甲酰基、甲酰氨基、羧基、氰基、氨基、脲基、氨基甲酰基、磺酰氨基、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基[其中所述C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C1-4烷氧基选择性地被一个或多个选自Rr的基团取代]、C1-4链烷酰基、C1-4烷氧羰基、杂环基、C1-4烷基S(O)a，其中a是0-2[选择性地被羟基取代]、N’-(C1-4烷基)脲基、N’，N’-二-(C1-4烷基)脲基、N’-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N’，N’-二-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、N-(C1-4烷基)磺酰氨基、N，N-二-(C1-4烷基)磺酰氨基、N-C1-4烷基氨基甲酰基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基甲酰基、C2-4烯氧基、C2-4炔氧基、C1-4链烷酰基氨基和上述式(Ia)或(Ia’)基团；
并且独立地，或除上述取代基之外，Q2可选择性地被1或2个分别选自芳基、C3-8环烷基和杂环基团的取代基取代；其中所述芳基、C3-8环烷基和杂环基团在环碳原子上选择性地被一个或多个选自Rs的基团取代；和其中如果所述杂环基团含有-NH-部分，则氮可选择性地被选自Rt的基团取代；
Rj、Rn、Ro和Rr分别选自羟基、卤素、氨基、氰基、甲酰基、甲酰氨基、羧基、硝基、巯基、氨基甲酰基、磺酰氨基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、C1-4链烷酰基、C1-4链烷酰基氧基、C1-4烷氧基、C1-4烷氧羰基、N-C1-4烷基氨基甲酰基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基甲酰基、C1-4链烷酰基氨基、C1-4烷基S(O)a，其中a是0-2、C1-4烷基磺酰氨基、N-(C1-4烷基)磺酰氨基、N-(C1-4烷基)2磺酰氨基、N-(C1-4烷基)氨基甲酰基、N-(C1-4烷基)2氨基甲酰基、苯基、苯硫基、苯氧基、C3-8环烷基和杂环基；其中所述苯基、苯硫基、苯氧基、C3-8环烷基和杂环基在环碳原子上选择性地被一个或多个选自Ru的基团取代；和其中如果所述杂环基团含有-NH-部分，则氮可选择性地被选自Rt的基团取代；
Rh、Rk、Rp、Rs和Ru分别选自羟基、卤素、氨基、氰基、甲酰基、甲酰氨基、羧基、硝基、巯基、氨基甲酰基、磺酰氨基、C1-4烷基[选择性地被一个或多个选自卤素、氰基、氨基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基或羟基取代]、C2-4烯基[选择性地被一个或多个选自卤素的基团取代]、C2-4炔基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、C1-4链烷酰基、C1-4链烷酰基氧基、C1-4烷氧基[选择性地被一个或多个卤素的基团取代]、C1-4烷氧羰基、N-C1-4烷基氨基甲酰基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基甲酰基、C1-4链烷酰基氨基、C1-4烷基S(O)a，其中a是0-2、C1-4烷基磺酰氨基、N-(C1-4烷基)磺酰氨基、N-(C1-4烷基)2磺酰氨基、苯基、C3-8环烷基和杂环基；
Ri、Rq、Rt和Rv分别选自C1-4烷基、C1-4链烷酰基、C1-4烷基磺酰基、C1-4烷氧羰基、氨基甲酰基、N-(C1-4烷基)氨基甲酰基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基甲酰基、苄基、苄氧基羰基、苯甲酰基和苯基磺酰基。
“芳基”是全部或部分不饱和的，单或双环碳环，它含有4-12个碳原子，“芳基”优选是含有5或6个原子的单环或含有9或10个原子的双环。更优选“芳基”是苯基、萘基、四氢萘基或二氢化茚基。“芳基”尤其是苯基、萘基或二氢化茚基，“芳基”更具体地是苯基。
“碳连接的杂芳基”是全部不饱和的，5-或6-元单环或9-或10-元双环，它们的至少一个原子选自氮、硫或氧。环以碳原子连接于-NH-(对于Q1)或G(对于Q2)。“碳连接的杂芳基”优选是呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、咪唑基、吡唑基、呋咱基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、吲哚基、喹啉基或苯并咪唑基。“碳连接的杂芳基”优选是吡啶基、噻唑基或吡唑基。具体的“碳连接的杂芳基”是吡啶基。
“杂环基团”是饱和、部分饱和或不饱和，含有4-12个原子的单或双环，其中至少一个原子选自氮、硫或氧，除非另有说明，它可以是碳或氮连接的，其中-CH2-基团可选择性地被-C(O)-取代，和环硫原子可选择性地被氧化以形成S-氧化物。“杂环基团”优选是吡咯烷基、吗啉代、哌啶基、吡啶基、吡喃基、吡咯基、异噻唑基、吲哚基、喹啉基、噻吩基、呋喃基、1，3-苯并二噁烷基、噻二唑基、哌嗪基、噻唑烷基、吡咯烷基、硫代吗啉代、吡唑基、吡咯啉基、高哌嗪基、四氢吡喃基、咪唑基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、异噁唑基、4-吡啶酮、1-异喹啉酮、2-吡咯烷酮、4-噻唑烷酮、咪唑并[1，2-a]吡啶或3-氮杂-8-氧杂二环[3.2.1]己烷。更优选“杂环基团”是吡咯烷基、吗啉代、哌嗪基、吲哚基、噻吩基、呋喃基、哌嗪基、硫代吗啉代、吡唑基、咪唑基、2-吡咯烷酮、咪唑并[1，2-a]吡啶或3-氮杂-8-氧杂二环[3.2.1]己烷。
“氮连接的杂环”是饱和、部分饱和或不饱和，含有4-12个原子的单或双环，其中至少一个原子是氮原子(连接形成酰胺)，而其它的原子是全部碳原子或它们是碳原子和1-3个选自氮、硫或氧的杂原子，其中-CH2-基团可选择性地被-C(O)-取代，和环硫原子可选择性地被氧化以形成S-氧化物。显然，在形成该氮键中，氮原子未被季化，即形成中性化合物。“氮连接的杂环”优选是吡咯-1-基、吡咯啉-1-基、吡咯烷-1-基、咪唑-1-基、咪唑啉-1-基、咪唑烷-1-基、吡唑-1-基、吡唑啉-1-基、吡唑烷-1-基、三唑-1-基、哌啶-1-基、哌嗪-1-基、吗啉代、硫代吗啉代、吲哚-1-基、吲哚烷-1-基或苯并咪唑-1-基。更优选“氮连接的杂环”是哌啶-1-基。
在本说明书中，术语“烷基”包括直链和支链烷基，但对于单个的烷基，例如“丙基”仅特定用于直链，类似的约定适用于其它一般术语。“卤素”是氟、氯、溴和碘。
C2-4烯基的实例是乙烯基和烯丙基；C2-6烯基的实例是C3-5烯基、乙烯基和烯丙基；C3-6烯基的实例是烯丙基；C3-6炔基的实例是C3-5炔基和丙炔-2-基；C2-4炔基的实例是乙炔基和丙炔-2-基；C2-6炔基的实例是乙炔基和丙炔-2-基；C1-4链烷酰基的实例是乙酰基和丙酰基；C1-4烷氧羰基的实例是C1-3烷氧羰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基和叔丁氧基羰基；C1-4亚烷基的实例是亚甲基、亚乙基和亚丙基；C1-4烷基的实例是C1-3烷基、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基；C1-6烷基的实例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基和3-甲基丁基；C1-4烷氧基的实例是C1-3烷氧基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基和丁氧基；C2-4烯氧基的实例是烯丙基氧基；C2-4炔氧基的实例是丙炔氧基；C1-4烷基S(O)a，其中a是0-2的实例是C1-3烷基硫烷基、甲硫基、乙硫基、丙硫基、甲基亚硫酰基、乙基亚硫酰基、丙基亚硫酰基、甲磺酰基、乙磺酰基和丙磺酰基；N-C1-4烷基氨基甲酰基的实例是N-甲基氨基甲酰基、N-乙基氨基甲酰基和N-丙基氨基甲酰基；N，N-二-(C1-4烷基)-氨基甲酰基的实例是N，N-二甲基氨基甲酰基、N-乙基-N-甲基氨基甲酰基和N，N-二乙基氨基甲酰基；N-C1-4烷基氨基的实例是N-(C1-3烷基)氨基、甲基氨基、乙基氨基和丙基氨基；N，N-二-(C1-4烷基)氨基的实例是N，N-二-(C1-3)氨基、二甲基氨基、N-乙基-N-甲基氨基、二乙基氨基、N-甲基-N-丙基氨基和二丙基氨基；C1-4链烷酰基氨基的实例是乙酰氨基、丙酰氨基和丁酰氨基；C3-8环烷基的实例是环丙基、环戊基和环己基；C1-4链烷酰基的实例是乙酰基和丙酰基；C1-4链烷酰基氧基的实例是乙酰氧基和丙酰氧基；N’-(C1-4烷基)脲基的实例是N’-甲基脲基和N’-乙基脲基；N’，N’-二-(C1-4烷基)脲基的实例是N’-甲基脲基、N’，N’-二异丙基脲基和N’-甲基-N’-丙基脲基；N’-(C1-4)-N-(C1-4烷基)脲基的实例是N’-甲基-N-乙基脲基和N’-甲基-N-甲基脲基；N’，N’-二-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基的实例是N’，N’-二甲基-N-乙基脲基和N’-甲基-N’-丙基-N-丁基脲基；N-(C1-4烷基)磺酰氨基的实例是N-甲基磺酰基氨基和N-异丙基磺酰基氨基；N，N-二-(C1-4烷基)磺酰基氨基的实例是N-甲基-N-乙基磺酰基氨基和N，N-二丙基磺酰基氨基；和C1-4烷基磺酰基氨基的实例是甲磺酰基氨基、乙基磺酰基氨基和丙基磺酰基氨基。
本发明的嘧啶衍生物的合适可药用的盐是例如本发明的嘧啶衍生物的酸加成盐，它是足够碱性的，例如与例如无机或有机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、三氟乙酸、柠檬酸或马来酸的酸加成盐。此外，足够酸性的本发明的嘧啶衍生物的合适可药用的盐是碱金属盐，例如钠或钾盐、碱土金属盐，例如钙或镁盐、铵盐或与提供生理可接受的阳离子的有机碱形成的盐，例如与甲胺、二甲胺、三甲胺、哌啶、吗啉或三-(2-羟基乙基)胺形成的盐。
式(I)化合物以前药形式给药，它在人体中动物体内分解以得到式(I)的化合物，前药的实例包括式(I)化合物的体内可水解的酯。
含有羰基或羟基的式(I)化合物的体内可水解的酯是例如可药用的的酯，它在人体或动物体内水解以生产母体酸或醇。羧基合适的可药用的酯包括C1-6烷氧基甲基酯，例如甲氧基甲基、C1-6链烷酰基氧基甲基酯，例如新戊酰氧基甲基、肽基酯、C3-8环烷氧基羰基氧基C1-6烷基酯，例如1-环己基羰基氧基乙基；1，3-二氧杂环戊烯-2-酮基甲基酯，例如5-甲基-1，3-二氧杂环戊烯-2-酮基甲基；和C1-6烷氧羰基氧基乙基酯，例如1-甲氧基羰基氧基乙基和可在本发明的化合物中的任何羧基上形成。
含有羟基的式(I)化合物的体内可水解的酯包括无机酯，例如磷酸酯和α-乙酰氧基烷基酯和相关的化合物，由于在体内酯水解断裂得到母体羟基。α-乙酰氧基烷基酯的实例包括乙酰氧基甲氧基和2，2-二甲基丙酰氧基-甲氧基。对于羟基体内可水解酯形成基团的选择包括链烷酰基、苯甲酰基、苯基乙酰基和取代的苯甲酰基和苯基乙酰基，烷氧羰基(以得到烷基碳酸酯)、二烷基氨基甲酰基和N-(二烷基氨基乙基)-N-烷基氨基甲酰基(以得到氨基甲酸酯)、二烷基氨基乙酰基和羧基乙酰基。在苯甲酰基上的取代基的实例包括吗啉代和哌啶子基，由环氮原子经亚甲基连接苯甲酰基环的3-或4-位。
式(I)的某些化合物可含有手性中心和/或几何异构体中心(E-和Z-异构体)，可理解本发明包括所有该具有CDK和/或FAK抑制活性的旋光、立体异构体和几何异构体。
本发明涉及具有CDK和/或FAK抑制活性的式(I)化合物的任一和所有互变异构形式。
还应理解，式(I)的某些化合物可存在溶剂化物以及非溶剂化物形式，例如水合形式。应理解，本发明包含具有CDK和/或FAK抑制活性的所有该溶剂化形式。
本发明尤其优选的化合物包括式(I)的嘧啶衍生物或其可药用的盐或其体内可水解的酯，其中R1、Q1、Q2和G具有上述定义的任何含义或任何如下数值。该数值可在与上文或下文定义的任何定义、权利要求或实施方案适当时使用。
Q1和Q2优选分别选自苯基、吡啶基、噻唑基和吡唑基。
Q1优选是苯基。
Q2优选是苯基、吡啶基、噻唑基或吡唑基。
Q2更优选是苯基或吡啶基。
优选Q1是苯基，Q2选自苯基、吡啶基、噻唑基和吡唑基。
更优选Q1是苯基，Q2选自苯基和吡啶基。
优选在取代基(Ia)或(Ia’)中
Y是-NHC(O)-或-C(O)NH-；
Z是RaO-、RbRcN-、RdS-、苯基或杂环基团；其中所述苯基或杂环基团选择性地在环碳原子上被一个或多个选自Rh的基团取代；和如果所述杂环基团含有-NH-部分，氮可选择性地被选自Ri的基团取代；
Ra、Rb、Rc和Rd是C1-4烷基；
n是0或1；
m是1、2或3；和
Q3是氮连接的杂环；其中所述杂环基团选择性地在环碳原子上被一个或多个选自Rk的基团取代；
更优选在取代基(Ia)或(Ia’)中
Y是-NHC(O)-或-C(O)NH-；
Z是RaO-、RbRcN-、RdS-、苯基、吡咯烷基、吗啉代、哌啶基、吲哚基、噻吩基、呋喃基[选择性地被一个或多个甲基取代]、哌嗪基[选择性地在环氮上被甲基取代]、硫代吗啉代、吡唑基[选择性地被一个或多个甲基取代]、咪唑基[选择性地被一个或多个选自甲基和硝基的基团取代]、2-吡咯烷酮、咪唑并[1，2-a]吡啶或3-氮杂-8-氧杂二环[3.2.1]己烷；
Ra、Rb、Rc和Rd是C1-4烷基；
n是0或1；
m是1、2或3；和
Q3是选择性地被吡咯烷-1-基取代的哌嗪-1-基。
尤其取代基(Ia)或(Ia’)是N-[2-(3-氮杂-8-氧杂二环[3.2.1]己-3-基)乙基]氨基甲酰基、N-(2-二-正丁基氨基乙基)氨基甲酰基、N-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基、N-(2-二异丙基氨基乙基)氨基甲酰基、N-[2-(3，5-二甲基吡唑-1-基)乙基]氨基甲酰基、N-(2-吲哚-3-基乙基)氨基甲酰基、N-(2-异丙基氨基乙基)氨基甲酰基、N-[2-(2-甲基-5-硝基咪唑-1-基)乙基]氨基甲酰基、N-(2-甲硫基乙基)氨基甲酰基、N-(2-吗啉代乙基)氨基甲酰基、N-(2-哌啶-1-基乙基)氨基甲酰基、N-(2-吡咯烷-1-基乙基)氨基甲酰基、N-(2-噻吩-2-基乙基)氨基甲酰基、N-(2-硫代吗啉代乙基)氨基甲酰基、N-(3-正丁氧基丙基)氨基甲酰基、N-(3-二正丁基氨基丙基)氨基甲酰基、N-(3-咪唑-1-基丙基)氨基甲酰基、N-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基]氨基甲酰基、N-(3-甲硫基丙基)氨基甲酰基、N-(3-吗啉代丙基)氨基甲酰基、N-[3-(2-氧基吡咯烷-1-基)丙基]氨基甲酰基、N-(3-吡咯烷-1-基丙基)氨基甲酰基、N-(2-二异丙基氨基乙基)氨基甲酰基甲基、N-(2-吗啉代乙基)氨基甲酰基甲基、N-(4-二甲基氨基苄基氨基)氨基甲酰基、N-(咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基甲基)氨基甲酰基、N-(5-甲基呋喃-2-基甲基)氨基甲酰基、4-(吡咯烷-1-基)哌嗪-1-基羰基、3-(二甲基氨基)丙酰胺或3-(异丙基氨基)丙酰胺。
更优选的取代基(Ia)或(Ia’)是N-(2-异丙基氨基乙基)氨基甲酰基、N-(2-吡咯烷-1-基乙基)氨基甲酰基或N-(3-咪唑-1-基丙基)氨基甲酰基。
取代基(Ia)或(Ia’)优选在环Q1上。
优选当Q1是苯基时，式(Ia)或(Ia’)取代基在相对于-NH-的对-或间-位上。
在发明的一个方面，优选G是-O-。
在发明的另一方面，优选G是-NR2-。
在发明的一个方面，当G是-NR2-时，优选R2是氢。
在发明的另一方面，当G是-NR2-时，优选R2不是氢。
优选R1是氟、氯、溴、甲基或氰基。
更优选R1是溴。
优选除式(Ia)或(Ia’)取代基之外，Q1是未取代的。
优选Q2是未取代的或被1或2个选自氟、溴、甲基、甲氧基、甲硫基或羟基甲基的基团取代。
更优选Q2是未取代的或被1或2个选自氟、甲基或羟基甲基的基团取代。
优选Q2是苯基、2-羟基甲基苯基、3-氟苯基、3-甲基苯基、4-氟苯基、3，4-二氟苯基、吡啶-2-基、6-甲基吡啶-2-基、4-甲基噻唑-2-基或5-甲基吡唑-2-基。
更优选Q2是吡啶-2-基、6-甲基吡啶-2-基、3-氟苯基或2-羟基甲基苯基。
因此，在本发明的优选方面，它提供了如上定义的式(I)的嘧啶衍生物，其中
Q1和Q2分别选自苯基、吡啶基、噻唑基和吡唑基；Q2是未取代或被1或2个选自氟、溴、甲基、甲氧基、甲硫基或羟基甲基的基团取代；和Q1在环碳上被如上所述的式(Ia)或(Ia’)取代基取代，其中
Y是-NHC(O)-或-C(O)NH-；
Z是RaO-、RbRcN-、RdS-、苯基或杂环基团；其中所述苯基或杂环基团选择性地在环碳原子上被一个或多个选自Rh的基团取代；和如果所述杂环基团含有-NH-部分，氮可选择性地被选自Ri的基团取代；
Ra、Rb、Rc和Rd是C1-4烷基；
n是0或1；
m是1、2或3；和
Q3是氮连接的杂环；其中所述杂环基团选择性地在环碳原子上被一个或多个选自Rk的基团取代。
G是-O-或-NH-；和
R1是氟、氯、溴、甲基或氰基；或其可药用的盐或其体内可水解的酯。
因此，在本发明的更优选方面，其提供如上定义的式(I)嘧啶衍生物，其中
Q1是苯基和Q2是吡啶-2-基、6-甲基吡啶-2-基、3-氟苯基或2-羟基甲基苯基；和Q1在-NH-连接部分的对位上被选自N-(2-异丙基氨基乙基)氨基甲酰基、N-(2-吡咯烷-1-基乙基)氨基甲酰基或N-(3-咪唑-1-基丙基)氨基甲酰基的基团取代；
G是-NH-；和
R1是溴；或其可药用的盐或其体内可水解的酯。
在本发明的一个方面，本发明的优选化合物是实施例41、80、82、84、85、92、94、96、114或115的化合物或其可药用的盐或其体内可水解的酯。
在本发明的另一方面，本发明的优选化合物包括实施例的任何一种或其可药用的盐或其体内可水解的酯。
本发明的优选方面是那些涉及该化合物或其药用盐。
式(I)的嘧啶衍生物或其可药用的盐或其体内可水解的酯可通过任何已知用于制备化学上相关化合物的方法制备。在用于制备式(I)的嘧啶衍生物，或其可药用的盐或其体内可水解的酯时，该方法提供本发明的另一特征，由如下代表性的实施例举例说明，其中除非另有说明，R1、Q1、Q2和G具有上文用于式(I)嘧啶衍生物的定义的任何含义，除非在环Q1或Q2上画出另外的取代基，环可带有任何上文所述的取代基(如果需要选择性地被保护)。当在环Q1上画出取代基时，其包括(除非另有说明)除了环Q1上的取代基之外，在环Q2上的可能的取代基。所需的起始物料可通过有机化学的标准方法得到(参见例如AdvancedOrganic Chemistry(Wiley-Interscience)，Jerry March-还用于有关反应条件和试剂的一般指导)。该起始物料的制备方法在所附非限制方法和实施例中描述。此外，所需的起始物料可由有机化学的一般技术人员通过类似方法得到。
因此，作为本发明的另一特征，提供了如下方法，其包括-a)对于其中G是-NR2-的式(I)化合物；使式(II)的嘧啶
其中L是如下定义的可代替的基团，与式(III)化合物反应
其中G是-NR2-；b)使式(IV)的嘧啶
其中L是如下定义的可代替的基团，与式(V)化合物反应
c)对于其中侧链是式(Ia)和Y是-C(O)NH-的式(I)化合物；使式(VI)的酸
或其活性衍生物；与式(VII)的胺反应
Z-(CH2)m-NH2(VII)d)对于其中侧链是式(Ia)和Y是-NHC(O)-的式(I)化合物；使式(VIII)的胺
与式(IX)的酸或其活性衍生物反应
Z-(CH2)m-CO2H(IX)e)对于其中侧链是式(Ia’)的式(I)化合物；使式(VI)的酸(或其活性衍生物)与式(X)的胺反应
和随后如果需要i)将式(I)化合物转化为式(I)的另一化合物；ii)除去任何保护基团；iii)形成可药用的盐或体内可水解的酯。
L是可代替的基团，L的合适定义是例如卤素、磺酰氧基或硫基，例如氯、溴、甲磺酰氧基、甲苯-4-磺酰氧基、甲磺酰基、甲硫基和甲基亚硫酰基。
用于上述反应的具体反应条件如下-方法a)
式(II)的嘧啶和式(III)的化合物可在一起反应i)选择性地在合适的酸，例如无机酸，例如盐酸或硫酸，或有机酸，例如乙酸或甲酸存在下。反应优选在合适的惰性溶剂或稀释剂，例如二氯甲烷(DCM)、乙腈、丁醇、四亚甲基砜、四氢呋喃、1，2-二甲氧基乙烷、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺或N-甲基吡咯烷-2-酮中，在温度范围，例如0℃-150℃，方便地在或接近回流温度下进行；或ii)在标准Buchwald条件(例如参见J.Am.chem.Soc.，118，7215；J.Am.chem.Soc.，119，8451；J.Org.Chem.，62，1568和6066)下，例如在乙酸钯存在下，在合适的溶剂，例如芳香溶剂，例如甲苯、苯或二甲苯中，用合适的碱，例如无机碱，例如碳酸铯或有机碱，例如叔丁醇钾，在合适的配位体，例如2，2’-双(二苯基膦基)-1，1’-联萘存在下在25-80℃的温度下。
式(II)的嘧啶可根据如下方案制备
其中Ra是选择性地取代的烷基或芳基，L是如上定义的如代替的基团，Ra优选的甲基、乙基或对甲苯基。
式(III)化合物是商业可获得的或通过现有技术中已知的方法制备。方案b)
式(IV)的嘧啶和式(V)的苯胺可在一起反应，i)在合适的溶剂，例如酮，例如丙酮或醇，例如乙醇或丁醇或芳烃，例如甲苯或N-甲基吡咯烷中，选择性地在合适的酸，例如如上定义的酸(或合适的路易斯酸)存在下，并在0℃-回流，优选回流的温度下；或ii)在如上所述的标准Buchwald条件下。
式(IV)的嘧啶根据方案制备
其中L是如上定义的可代替的基团。
式(V)的苯胺是商业可获得的或通过现有技术中已知的方法制备。
式(IVA)的嘧啶是商业可获得的或可通过例如使其中L是-OH的式(IVA)化合物(即尿嘧啶)与POCl3反应得到其中L是-Cl的式(IVA)化合物。方法c)
式(VI)的酸和式(VII)的胺可在合适的偶合试剂存在下偶合。现有技术中已知的标准肽偶合试剂可用作合适的偶合试剂，或例如羰基联咪唑和二环己基-碳化二亚胺，选择性地在催化剂，例如二甲基氨基吡啶或4-吡咯烷并吡啶存在下，选择性地在碱，例如三乙胺、吡啶或2，6-二烷基吡啶，例如2，6-二甲基吡啶或2，6-二叔丁基吡啶存在下。合适的溶剂包括二甲基乙酰胺、二氯甲烷、苯、四氢呋喃和二甲基甲酰胺。偶合反应可方便地在-40-40℃的温度范围内进行。
合适的活性酸衍生物包括酰卤，例如酰氯和活性酸，例如五氟苯基酯。这类化合物与胺的反应是现有技术中已知的，例如它们可在碱，例如上述的碱存在下，在合适的溶剂，例如上述的溶剂中反应。反应可方法地在-40-40℃的温度范围内方便地进行。
式(VI)的化合物可根据如下方案制备
其中Pg是合适的酸保护基团，例如在如下所述的基团。
式(VIII)的胺是商业可获得的或通过现有技术中已知的方法制备。方案d)
式(IX)的酸和式(VIII)的胺可在上述方案c)中所述的条件下偶合。
式(VIII)的化合物可根据如下方案制备
其中Pg是合适的酸保护基团，例如在如下所述的基团。
式(IX)的酸是商业可获得的或通过现有技术中已知的方法制备。方案e)
式(VI)的酸和式(X)的胺可在上述方案c)中所述的条件下偶合。
式(X)的胺是商业可获得的或通过现有技术中已知的方法制备。
式(I)化合物转化为式(I)的另一化合物的实例是i)当G是-NR2-时；将为氢的R2转化为其它R2’例如
其中L是可代替的基团；ii)当G是-NR2-时；将为取代的侧链的R2转化为其它取代的侧链，例如
其中Ms是甲磺酰基，Nu是亲核试剂，它引入取代基，该取代基是在式(I)中关于R2的选择取代基(NB羟基部分不必在如上所述的末端碳原子上)；iii)将式(Ia)的一种侧链转化为式(Ia)的另一种侧链。iv)使用标准技术将R1的一种数值转化为R1的另一数值，例如，将R1的羟基转化为C1-4烷氧基。
本领域的读者将理解在方法上述c)、d)和e)中所述的侧链(Ia)或(Ia’)和在i)和ii)中侧链R2的形成还可以中间体上进行。例如
本发明的优选方法是方法b)。
显然，在本发明的化合物中各种环取代基可在上述方法之前或之后，通过标准芳香取代反应引入或通过常规官能团改性产生，其本身包括在本发明的方法方面中。该反应和改性包括，例如通过芳香取代反应引入取代基、取代基的还原、取代基的烷基化和取代基的氧化。用于该过程的试剂和反应条件是化学领域中已知的。芳香取代反应的具体实例包括使用浓硝酸引入硝基、使用例如酰卤和路易斯酸(例如三氯化铝)在Friedel Crafts条件下引入酰基；使用烷基卤化物和路易斯酸(例如三氯化铝)在Friedel Crafts条件下引入烷基；和引入卤素基团。改性的具体实例包括通过例如在盐酸存在下通过加热使用镍催化剂或用铁处理催化氢化将硝基还原为氨基；将烷硫基氧化为烷基亚硫酰基或烷基磺酰基。
还应理解，在本文上述的某些反应中，必需/需要保护在化合物的任何敏感基团。其中保护是必需或需要的情况和用于保护的合适方法是本领域技术人员已知的。常规保护基团可根据标准实践使用(参见例如T.W.Green，Protective Groups in Organic Synthesis，JohnWiley and Sons，1991)。因此，如果试剂包括基团，例如氨基、羧基或羟基，将需要在本文上述某些反应中保护该基团。
用于氨基或烷基氨基的合适保护基团是例如酰基，例如链烷酰基，例如乙酰基、烷氧羰基，例如甲氧基羰基、乙氧基羰基或叔丁氧基羰基、芳基甲氧基羰基，例如苄氧基羰基、或芳酰基，例如苯甲酰基。用于上述保护基团的脱保护条件需要根据保护基团的选择而变化。因此，例如酰基例如链烷酰基或烷氧羰基或芳酰基可例如通过用合适的碱，例如碱金属氢氧化物，例如氢氧化锂或钠水解除去。此外，酰基，例如叔丁氧基羰基可例如通过用合适的酸，例如盐酸、硫酸或磷酸或三氟乙酸处理除去，芳基甲氧基羟基，例如苄氧基羟基可例如通过在催化剂，例如钯/碳上氢化或通过用路易斯酸，例如三(三氟乙酸酯)硼处理除去。用于伯氨基的合适的其它保护基团是例如邻苯二甲酰基，它可通过用烷基胺，例如二甲基丙基胺或用肼处理除去。
用于羟基的合适保护基团是例如酰基，例如链烷酰基，例如乙酰基，苄酰基，例如苯甲酰基或芳基甲基，例如苄基。用于上述保护基团的脱保护条件必需根据保护基团的选择变化。因此，例如酰基，例如链烷酰基或芳酰基可例如通过用合适的碱，例如碱金属氢氧化物，例如氢氧化锂或钠水解除去。此外，芳基甲基，例如苄基可通过使用在催化剂，例如钯/碳上氢化除去。
用于羧基的合适保护基团是例如酯化基团，例如甲基或乙基，它们可例如通过用碱，例如氢氧化钠水解除去，或例如叔丁基，综可例如通过用酸，例如有机酸，例如三氟乙酸处理除去，或例如苄基，它可例如通过在催化剂，例如钯/碳上氢化除去。
保护基团可在合成中在任何方便的阶段使用化学领域中已知的常规技术除去。
本文中定义的许多中间体是新的，例如，式II和IV的中间体，它们提供本发明的其它特征。试验
如上所述，本发明中定义的嘧啶衍生物具有抗细胞增生活性，例如抗癌活性，它被认为是由化合物的CDK和/或FAK抑制活性产生的。这些性质可例如使用如下的方法测定CDK4抑制试剂
使用了如下缩写HEPES是N-(2-羟基乙基)哌嗪-N’-(2-乙烷磺酸)DTT是二硫苏糖醇PMSF是苯基甲基磺酰基氟
化合物在体外激酶试验中在96孔板格式中使用ScintillationProximity Assay(SPA-由Amersham获得)测量[γ-33-P]三磷酸腺苷在试验基质(GST-成视网膜细胞瘤)中的结合测试。在每个孔中加入所试验的化合物(在DMSO和水中稀释以校准浓度)，以对照孔中是p16作为抑制剂对照或DMSO作为正对照。
将约0.5μl在25μl培养缓冲液中稀释的CDK4/细胞周期蛋白D1部分纯化的酶加入每个孔中，随后加入20μlGST-Rb/ATP/ATP33混合物(含有0.5μgGST-Rb和0.2μlATP和0.14μCi[γ-33-P]三磷酸腺苷)，得到的混合物缓慢摇晃，随后在室温下培养60分钟。
随后在每个孔中加入150μL含有(0.8mg/孔的蛋白质A-PVT SPA球(Amersham))，20pM抗谷光甘肽转移酶，兔IgG(由MolecularProbes得到)，61mMEDTA和50mM含有0.05％叠氢化钠pH7.5的停止溶液。
板用Topseal-S板密封器密封，放置2小时，随后以2500rpm，1124xg.旋转5分钟，板用Topcount每个孔阅读30秒钟。
用于稀释酶和基质混合物的培养缓冲液含有50mM pH7.5的HEPPES、10mM氯化锰、1mMDTT、100μM钒酸钠、100μM氟化钠，10mM甘油磷酸钠，BSA(1mg/ml最终)。
作为对照组，另一已知的CDK4抑制剂可用于代替p16。试验基质
在该试验中，仅使用部分成视网膜细胞瘤(Science 1987 Marl3；235(4794)1394-1399；Lee W.H.，Bookstein R.，Hong F.，YoungL.J.，Shew J.Y.，Lee E.Y.)，融合到成视网膜细胞瘤氨基酸加成盐379-928(由成视网膜细胞瘤质粒ATCCpLRNL得到)的GSTtag.PCR，序列克隆到pGEX 2T融合因子(Smith D.B.和Johnson，K.S.Gene 67，31(1988)；它含有用于诱导表达的tac启动子，用于任何大肠杆菌宿主的内lac Iq基因和用于凝血酶断裂的编码区域-由PharmaciaBiotech得到)，它用于放大氨基酸，该序列重新克隆到pGEX 2T中。
所得到的成视网膜细胞瘤792-928序列使用标准诱导表达技术在大肠杆菌(BL21(DE3)pLysS细胞)中表达，并纯化如下。
大肠杆菌浆料重新悬浮在10ml/gNETN缓冲液(50mM Tris pH7.5，120mMNaCl，1mMEDTA，0.5％v/vNP-40，1mMPMSF，1ug/ml leupeptin，1ug/ml抑肽酶和1ug/ml抑胃酶素)，每100ml匀浆超声处理2×45秒。在离心后，上清液放置在10ml谷胱甘肽琼脂糖柱(Pharmacia Biotech，Herts，UK)，用NERN缓冲液洗涤。在用激酶缓冲液(50mM HEPES pH7.5，10mM MgCl2，1mM DTT，1mMPMSF，1ug/ml leupeptin，1ug/ml抑肽酶和1ug/ml抑胃酶素)洗涤后，蛋白质用在激酶缓冲液中的50mM还原谷胱甘肽洗脱。收集含有GST-Rb(792-927)馏分，相对于激酶缓冲液透析过夜。最终产物用8-16％Tris-甘氨酸凝胶(Novex，San Diego，USA)用Sodium Dodeca Sulfate(SDS)PAGE(聚丙烯酰胺)分析。CDK4和细胞周期蛋白D1
CDK4和细胞周期蛋白D1如下由来自MCF-7细胞系(由ATCC№HTB22，乳腺癌系得到)的RNA克隆。RNA由MCF-7细胞系制备，随后使用寡脱氧胸苷酸引物逆转录。PCR用于放大每个基因的完整编码序列[CDK4氨基酸1-303；Ref.Cell 1992年10月16日，71(2)323-334；matsushime H.，Ewen M.E.，Stron D.K.，Kato J.Y.，HanksS.K.，Roussel M.F.，Sherr C.J.和细胞周期蛋白D1氨基酸1-296；Ref.Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.，1991；5693-97；Amold A.，Motokura T.，Bloom T.，Kronenburg，Ruderman J.，Juppner H.，Kim H.G.]。
在序列测定后，PCR产物使用标准技术克隆到昆虫表达因子pV11393(由Invitrogen1995目录编号V1392-20得到)中，PCR产物随后双重表达[使用标准病毒Baculogold共感染技术]到昆虫SF细胞体系(由Fall Army Worm的卵巢组织得到的Spodoptera Frugiperda细胞-商业可获得的)中。
如下实施例提供在SF21细胞(在TC100+10％FBS(TCS)+0.2％Pluronic)中对细胞周期蛋白D1&CDK4的每种病毒具有双重感染MOI3的细胞周期蛋白D1/CDK4制备的详细说明。细胞周期蛋白D1/CDK4的举例生产
在滚瓶培养中生长至2.33×106细胞/ml的SF21细胞以0.2×10E6细胞/ml用于接种10×500ml滚瓶，滚瓶在28℃在滚瓶设备中培养。
3天(72小时)后，计数细胞，2瓶的平均值是1.86×10E6细胞/ml(99％存活)，培养物随后用双重病毒以每种病毒MOI3感染。
10×500ml用JS303细胞周期蛋白D1病毒效价-9×10E7pfu/ml。JS304CDK4病毒效价-1×10E8pfu/ml感染。对于每个500ml瓶，细胞周期蛋白(1.86×10E6×500×3)/(0.9×108)＝31ml病毒。对于每个500ml瓶，CDK4(1.86×10E6×500×3)/(1×108)＝28ml病毒。
病毒在加入培养物之前混合，培养物放回28℃滚瓶设备。
在感染后3天(72小时)，收获5L培养物，在收获中总细胞数是1.58×10E6细胞/ml(99％存活)。细胞以250ml的批量在HeraeusOmnifuge 2.0RS中在4℃以2500rpm旋转。放弃上清液，将约4×10E8细胞/菌丝球的20个菌丝球快速冷冻在LN2中，贮存在-80℃的CCRF冷库中。SF21细胞随后通过重新悬浮在溶胞缓冲液(50mM HEPES pH7.5，10mM MgCl2，1mM DTT，10mM甘油磷酸盐，0.1mMPMSF，0.1mM氟化钠，0.1mM原钒酸钠，5ug/ml抑肽酶，5ug/ml leupeptin和20％w/v蔗糖)中低渗溶解细胞，加入冰冷的软化水。在离心后，将上清液加入Poros HQ/M1.4/100阴离子交换柱(PE Bio systems，Hertfork，UK)中。CDK4和细胞周期蛋白D1在溶胞缓冲液中用375ml NaCl共同洗脱，用免疫印迹法使用合适的抗CDK4和抗细胞周期蛋白D1抗体(由Santa Cruz Biotechnology，California，US得到)检测它们的存在。p16对照(Nature 366704-707；1993；Serrano M.Hannon GJ.BeachD)
p16(CDK4/细胞周期蛋白D1)由HeLa cDNA(ATCC CCL2，人体子宫颈epitheloid癌，得到的Hela细胞；Cancer Res.12264，1952)放大，克隆到具有5’组氨酸标签的pTB 375 NBSE中，使用标准技术转化为BL21(DE3)pLysS细胞(由Promega得到；Ref.Studier F.W.和Moffat B.A.，J.Mol. Biol.，189，113，1986)。将1L培养物生长至合适OD，随后用IPTG诱导以表达p16过夜，细胞随后通过在50mM磷酸钠，0.5M氯化钠，PMSF，0.5μg/ml leupeptin和0.5μg/ml抑肽酶中超声处理溶解细胞。混合物旋转，上清液加入镍螯合物球中，混合1.5小时。球在磷酸钠，NaCl pH6.0和在磷酸钠，NaCl pH7.4中洗脱的p16中用200mM咪唑洗涤。
pTB NBSE如下由pTB 375 NBPE构成pTB 375
用于产生pTB 375的背景载体是pZEN0042(参见UK专利2253852)，含有产生背景的pAT153中的来自质粒RP4的tetA/tetR诱导四环素抗性序列和来自质粒pKS492的神经酰胺稳定性序列。pTB375通过加入由T7基因10启动子、多克隆位点和T7基因10终止序列组成的表达盒样产生。此外，在表达盒样的上游包括用于降低背景载体的转录连读的终止子序列。pTB375NBPE
除去在pTB375中存在的单一EcoRI限制位点，将含有限制酶NdeI，BamHI，PstI和EcoEI的识别序列的新多克隆位点在破坏存在于pTB375中存在的原始BamHI的NdeI和BamHI位点之间引入pTB375。pTB375NBSE
将含有用于限制酶NdeI，BamHI，SmaI和EcoEI的识别序列的新多克隆位点在NdeI和EcoEI位点之间引入pTB375NBPE，含有这些限制位点的低核苷酸在NdeI和BamHI位点之间还含有6个与NedI位点中存在的起始密码子(ATG)相同的阅读框的组氨酸密码子
通过上述类似的方法，可构成用于测定CDK2和CDK6抑制的试验。CDK2(EMBL Accession №X62071)可与细胞周期蛋白A或细胞周期蛋白E(参见EMBL Accession №M73812)一起使用，该试验的进一步细节包含在PCT国际公开№WO99/21845中，其相关的生物化学和生物评价部分列为本文参考文献。
如果使用CDK2与细胞周期蛋白E，可如下实现部分共同纯化将Sf21细胞重新悬浮溶胞缓冲液(50mM Tris pH8.2，10mM MgCl2，1mMDTT，10mM甘油磷酸盐，0.1mM原钒酸钠，0.1mM氟化钠，1mMPMSF，1ug/ml leupeptin和1ug/ml抑肽酶)，在10ml Dounce均化器中均化2分钟。在离心后，将上清液加入Poros HQ/M1.4/100阴离子交换柱(PE Biosystems，Hertfork，UK)中。CDK2和细胞周期蛋白E开始用0-1M氯化钠梯度(在减去蛋白酶抑制剂的溶胞缓冲液中试验)共同洗脱，用免疫印迹法使用抗CDK2和抗细胞周期蛋白E抗体(Santa CruzBiotechnology，California，US)检测共同洗脱。FAK3激酶抑制试验
该试验测定试验化合物抑制人体病灶粘着激酶(FAK)的酪氨酸激酶活性的能力。
编码PAK的DNA通过总基因合成(Edward M，International Biotechnology Lab 5(3)，19-25，1987)或克隆得到。随后它们在合适的表达系统中表达以得到具有酪氨酸激酶活性的多肽。例如，在昆虫细胞中通过表达重组蛋白质得到的FAK被发现显示内三酪氨酸激酶活性。
FAK(由Andre等描述的全长度cDNA(Biochemical andBiophysical Re search Communicatios，1993，190(1)140-147；EMBL/GenBank Accession Number L05186))被改性使得得到的蛋白质在翻译时在先前的起始蛋氨酸的N-末端具有6个组氨酸标签。活性FAK蛋白质使用类似于N-末端6-组氨酸标签先在杆状病毒系统中表达(Protein Expression And Purification，1996，712-18)。人体FAK cDNA克隆到杆状病毒移位载体pFastbac1(Life Technologies)中，重组结构与病毒DNA共同转染到昆虫细胞(例如Spodopterafrugiperda 21(Sf21))中以制备重组杆状病毒(用于装配重组DNA分子的方法和重组杆状病毒的制备和使用的细节可在标准文章中找到，例如Sambrook等，1989，Molecular cloning-A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbour Laboratory Press和O’Reilly等，1992，Baculovirus Expression Vector-A Laboratory Manual，W.H.Freeman and New York。特定于pFastbac(Bac to Bac’)系统的用途的细节在Anderson等，1995，FOCUS(Life TechnologiesBulletin Magazine)，17，53页)找到。
对表达生物活性人体FAK蛋白质，Sf21细胞以3的感染多重性用空斑纯FAK重组病毒感染，48小时后收获。收获的细胞用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(PBS)(10mM磷酸钠，pH7.4，138mM氯化钠，2.7mM氯化钾)洗涤，以每1千万细胞250μ溶胞缓冲溶液重新悬浮在冰冷的溶胞缓冲溶液(50mM HEPES pH7.5，1mM二硫苏糖醇，10uM氟化钠，100uM原钒酸钠，10mM甘油磷酸盐，100uM苯基甲基磺酰氟(PMSF)，5ug/ml抑肽酶，5ug/ml leupeptin，1％Tween；PMSF在使用前用新鲜制备的在甲醇中的100mM溶液加入)。悬浮液随后在冰上培养15分钟，在4℃以13000rpm离心10分钟。除去上清液(酶存贮)，等分样品在液氮中快速冷冻，在-70℃下贮存。对于典型批量，存贮的酶用酶稀释剂(100mM HEPES pH7.4，0.2mM二硫苏糖醇，20uM原钒酸钠，0.1％Triton X-100)以1∶250稀释，50ml新稀释的酶用于每个试验孔(参见如下FAK3原始记录)。FAK3体外酶试验原始记录
基质溶液备料由含有酷氨酸，例如Poly(Glu，Ala，Tyr)6∶3∶1(Sigma P3899)无规聚合物制备，在-20℃作为在PBS中的1mg/ml备料贮存，用PBS以1∶500稀释用于板涂覆。
在试验前1天，用100μl稀释的基质溶液分散在试验板(Maxisorp96孔免疫板，Life technologies，Cat.No.439454A)的所有孔中，它用板密封器密封，在4℃下放置过夜。
在试验日，弃掉基质溶液，试验板孔用200μlPBST(含有0.05％v/vTween 20)洗涤一次，用200μl 50mM Hepes pH7.4洗涤一次。
试验化合物在DMSO中制成10mM或30mM备料，随后进一步在玻璃蒸馏水中稀释至高于最终试验浓度10倍的浓度。将10μl稀释的化合物加入洗涤的试验板孔中，“非化合物”对照孔含有10μl玻璃蒸馏水，而不是化合物。
在所有试验孔中加入40μl的含有6.25μM腺苷-5’-三磷酸(ATP)的25mM氯化锰，为开始反应，在每个孔中加入新鲜稀释的酶，板在23℃下培养90分钟，随后通过加入含有20mM EDTA的100μl PBS，随后弃掉液体，孔用PBST洗涤两次。
在每个孔中加入用含有0.5w/v牛血清白蛋白(BSA)的PBST以1∶1500稀释的100μl小鼠HRP连锁的抗磷酪蛋白抗体(Santa Cruz，Product SC 7020-HRP)，板在室温下培养1小时，随后弃掉液体，用200μl PBST洗涤孔两次。在每个孔中加入100μl在50ml新鲜制备的50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液pH5.0+0.03％过硼酸钠(用每100ml蒸馏水中1磷酸盐柠檬酸盐缓冲液与过硼酸钠(PCSB)胶囊(Sigma P4922)制备)中的使用1个50mg ABTS片(Boehringer 1204 521)新鲜制备的2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)。板随后在室温下培养20-60分钟，直到用板阅读分光光度仪在405nm下测定的“非化合物”对照孔的吸光值接近1.0。
使用Origin Software由吸光度读数产生剂量响应曲线，如Origin Software分析定义，用抑制浓度50(IC50)排列化合物的效价。
虽然式(I)化合物的药理学性质随着结构变化改变，但通常在上述试验中式(I)化合物具有的活性可用IC50浓度或在250μM至1nM的剂量说明。
在上述体外试验中测试时，实施例45的CDK4抑制活性据测量为IC50＝0.235μM。在上述体外试验中测试时，实施例47的FAK抑制活性据测量为IC50＝0.097μM，实施例52的活性为IC50＝0.814μM。
本发明化合物的体内活性可通过标准技术，例如通过测定细胞生长的抑制和估计细胞毒性估计。例如进一步的细节在如下参考文献中找到a)“病灶粘着激酶表达的减毒诱导肿瘤中编程性细胞死亡”，Xu L-h等，Cell Growth & Differentiation(1996)7，p413-418；b)“病灶粘着激酶的COOH-末端区域诱导人体肿瘤细胞粘着的损失和细胞死亡”，Xu L-h等，Cell Growth & Differentiation(1998)9，p999-1005；c)“在培养的成纤维细胞中pp125-FAK的抑制导致编程性细胞死亡”，Hungerford J.E等，The Journal of Cell Biology(1996)135，p1383-1390；d)“以病灶粘着为信号的病灶粘着激酶(FAK)的抑制降低细胞能动性和增生”，Gilmore A.P and Romer L.H.Molecular Biology of theCell(1996)7，p1209-1224。
细胞生长的抑制可通过用Sulforhodamine B(SRB)，一种染色蛋白质的荧光染料染色细胞，随后给出在孔中蛋白质(即细胞)数量的评价测定(参见Boyd，M.R.(1989)Status of the NCI preclinicalantitumour drug discovery screen.Prin.Prac Oncol 101-12)。因此提供如下测量细胞生长的抑制的细节
细胞以100μl的体积在合适的培养基中在96孔板中平板接种；培养基是用于MCF-7，SK-UT-1B和SK-UT-1的Dulbecco’s ModifiedEagle培养基。细胞附着过夜，随后抑制剂化合物以不同的浓度以1％DMSO(v/v)最大浓度加入。测试对照板以得到在给药前细胞的数值，细胞在37℃，(5％CO2)培养3天。
在3天后，在板中加入TCA至16％(v/v)的最终浓度，板随后在4℃培养1小时，除去上清液，板用自来水洗涤。在干燥后，在37℃加入100μl SRB染料(在1％乙酸中的0.4％SRB)30分钟，除去过量的SRB，板用1％乙酸洗涤。结合于蛋白质的SRB溶解在100mM Trip pH7.5中，在室温下振荡30分钟。在540nm下读出OD，导致50％生长抑制的抑制剂浓度由抑制剂浓度的半对数图减去吸光度测定。降低光密度至低于在实验开始时细胞平板接种时得到的数值时的化合物浓度给出用于毒性的数值。
在SRB试验中，本发明的化合物的通常IC50数值在1mM-1nM范围内。
根据本发明的另一方面，它提供了药物组合物，它含有如上定义的式(I)的嘧啶衍生物或其可药用的盐或其体内可水解的酯和可药用的稀释剂或载体。
组合物可以是适合于口服给药的形式，例如作为片剂或胶囊，适合于肠胃外注射的形式(例如静脉内、皮下、肌内，血管内或输液)，如无菌溶液、悬浮液或乳液，适合于局部给药形式，例如软膏或乳剂或用于直肠给药的形式，如栓剂。
通常上述组合物可以常规方法使用常规赋形剂制备。
嘧啶将通常以每平方米动物体面积5-5000范围，即约0.1-100mg/kg的单位剂量向温血动物给药，这通常提供治疗有效剂量。单位剂量形式通常将含有例如1-250mg活性成分，优选采用1-50mg/kg的日剂量。然而，日剂量必需根据所治疗的宿主，具体的给药途径和所治疗的疾病的严重程度变化。因此，最佳剂量可由治疗任何具体患者的参与者确定。
根据本发明的另一方面，提供了如上定义的式(I)的嘧啶衍生物或其可药用的盐或其体内可水解的酯在预防或治疗温血动物，例如人中的用途。
我们发现本发明中定义的嘧啶衍生物或其可药用的盐或其体内可水解的酯是有效的细胞周期抑制剂(抗细胞增生药)，该性质(不打算限制于理论)被认为由它们的CDK抑制性质产生的。化合物还是FAK的有效抑制剂，因此，本发明的化合物被预计用于治疗单独或部分地由CDK和/或FAK酶传递的疾病或症状，即化合物可用于在需要该治疗的温血动物中产生CDK和/或FAK抑制作用。因此，本发明的化合物提供了治疗以CDK和/或FAK酶的抑制为特征的恶性细胞的增生和/或迁移的方法。化合物还可通过诱导细胞死亡(编程性细胞死亡)用作FAK抑制剂。由于CDK和/或FAK涉及许多常见的人体癌症，例如白血病和乳腺、肺、结肠、直肠、胃、前列腺、膀胱、胰腺和卵巢癌，该本发明的嘧啶衍生物被预期具体广泛的抗癌性质，因此，可预期本发明的嘧啶衍生物对这些癌症将具有抗癌活性。此外，可预期本发明的嘧啶衍生物将对各种白血病、淋巴恶性肿瘤和固体肿瘤，例如在组织，如肝、肾、前列腺和胰腺中的癌和肉瘤具有活性。本发明的该化合物尤其被预期有利地延缓例如结肠、乳腺、前列腺、肺和皮肤的原发和复发固体肿瘤。本发明的该化合物更尤其被预期抑制与CDK和/或FAK有关的这些原发和复发肿瘤，尤其是那些其生产和扩散主要取决于CDK和/或FAK的肿瘤，包括例如某些结肠、乳腺、前列腺、外阴和皮肤肿瘤的生长。
此外，可预期本发明的嘧啶衍生物将对在各种其它疾病症状中的其它细胞增生/迁移，包括白血病、纤维增生和分化疾病、牛皮癣、类风湿性关节炎、卡波济氏肉瘤、haemangioma、急性或慢性肾病、粉瘤、动脉粥样硬化、动脉再狭窄、自身免疫疾病、急性和慢性炎症、骨疾病和视网膜脉管增生的眼病具有活性。
因此，根据本发明的方面，其提供如上定义的式(I)的嘧啶衍生物或其可药用的盐或其体内可水解的酯作为药物的用途；和如上定义的式(I)的嘧啶衍生物或其可药用的盐或其体内可水解的酯在生产在温血动物，例如人中用于产生抗癌、细胞周期抑制(抗细胞增生)作用和/或FAK抑制(抗细胞迁移和/或编程性细胞死亡诱导)作用的药物中的用途。细胞周期抑制作用尤其通过抑制CDK2、CDK4和/或CDK6，尤其是CDK4和CDK6的以S或G1-S相产生。
根据本发明的该方面的进一步特征，其提供了在需要该治疗的温血动物，例如人中产生抗癌、细胞周期抑制(抗细胞增生)作用和/或FAK抑制(抗细胞迁移和/或编程性细胞死亡诱导)作用的方法，其包括向所述动物给药有效量的如上定义的嘧啶衍生物。抑制作用尤其通过抑制CDK2、CDK4和/或CDK6，尤其是CDK4和CDK6以S或G1-S相产生。
如上所述，用于治疗或预防治疗特定细胞增生疾病所需的剂量大小将根据所治疗的宿主、给药途径和所治疗的疾病的严重程度变化。可预计在例如1-100mg/kg，优选1-50mg/kg的单位剂量。
如上定义的CDK和/或FAK抑制活性可作为仅有的治疗施用或除本发明的化合物之外，可包含一种或多种其它物质和/或药物。该联合治疗可通过同时、依次或单独给药治疗的单个组成实现，在医治肿瘤学中，除如上定义的细胞周期抑制治疗之外，该联合治疗的其它组成可以是外科手术、放射治疗或化学治疗。该化学治疗可覆盖三种主要种类的治疗药物(i)通过与本文上述相同或不同的机理作用的其它细胞周期抑制剂；(ii)细胞抑制剂，例如抗雌激素药(例如他莫昔芬、托米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、iodoxyfene)、孕激素(例如乙酸甲地孕酮)、aromatase抑制剂(例如anastrozole、letrazole、伏罗唑、依西美坦)、抗孕激素、抗雄激素(例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、乙酸环丙孕酮)、LHRH激动剂和拮抗剂(例如乙酸性瑞林、luprolide)、睾丸5α-二氢还原酶(例如非那甾胺)、抗侵袭药(例如代谢蛋白酶抑制剂，如marimastat和尿激酶纤溶酶原激活物受体因子抑制剂)和生长因子功能抑制剂(例如生长因子包括例如血小板衍生的生长因子和肝细胞生长因子，如抑制剂，包括生长因子抗体、生长因子受体抗体、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂)；和(iii)在医治肿瘤学中使用的抗增生/抗肿瘤药和它们的组合，例如抗代谢物(例如抗叶酸盐，例如甲氨喋呤、氟嘧啶，如5-氟尿嘧啶、嘌呤和腺苷类似物、胞嘧啶抗体)；抗肿瘤抗生素(例如anthracycline，如阿霉素、柔红霉素、表阿霉素和去甲氧柔红霉素)；铂衍生物(例如顺铂、碳铂)；烷化剂(例如氮芥、抗瘤氨酸、苯丁酸氮芥、白消安、环磷酰胺、异环磷酰胺、亚硝脲、塞替派)；抗有丝分裂药(例如长春花属生物碱，如长春新碱和taxoid，如太平洋紫衫素、taxotere)；拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素，如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、托泊替苷)。根据本发明的该方面，其提供治疗产品，它含有如上定义的式(I)嘧啶衍生物或其可药用的盐或其体内可水解的酯和如上定义的附加抗肿瘤物质。抗呕吐药也可有用地给药，例如在采用该联合治疗时。
除其在治疗医学中的用途之外，式(I)的化合物和其可药用的盐还在实验动物，例如猫、狗、兔子、猴、大鼠和小鼠中用于评价细胞周期活性的抑制剂的效果的体外和体内试验体系的开发和标准化过程中，作为新治疗药物研究的部分，用作药理学工具。
除此之外，本文还提供了所述化合物的药物组合物、加工、方法、使用和药物生产特征、另外的和优选的实施方案。
本发明现在用如下非限制实施例举例说明，其中如果需要，可使用对熟练化学家已知的标准技术和在这些实施例中描述的类似技术，其中，除非另有说明(i)蒸发过程通过真空旋转过程进行，加工过程在通过过滤除去残余固体，例如干燥剂之后进行；(ii)操作在室温下，通过在18-25℃和在空气中进行，除非另有说明或除非熟练技术人员将在惰性气体，例如氩气的气氛下操作；(iii)柱色谱法(通过快速方法)和中压液相色谱法(MPLC)用由E.Merck，Darmstadt，Germany得到的Merck kieselgel硅胶(Art.9385)或Merck Lichroprep RP-18(Art.9303)逆相硅胶进行；带洗脱色谱法使用由Varian Sample preparation Products，California，USA得到的Varian Mega Bond Elut药筒(10g，操作码1225-6034)；(iv)收率仅用于说明，不必是可获得的最大值；(v)式(I)的最终产物的结构通常用核(通常是质子)磁共振(NMR)和质谱技术证实；质子核磁共振化学位移在氘化DMSOd6(除非另有说明)用δ刻度(由四甲基甲硅烷的ppm低磁场)使用在300MHz场强度操作的Varian Gemini 2000分光计或在250MHz场强度操作的Bruker AM250分光计测量；峰多重性如下s，单峰；d，双重峰；dd双重双重峰；t，三重峰；tt，三重三重峰；q，四重峰；tq，三重四重峰；m，多重峰；br，宽峰；质谱(MS)在VG平台上用electrospray进行；(vi)除非在内容中具体说明，分析高性能液相色谱法(HPLC)用WatersSpherisorb ODS1 25cm柱，以2ml/分钟的流速，使用乙腈/水/三氟乙酸(60∶40∶0.1v/v)作为洗脱剂进行，检测在254nm的波长下进行，数据是停留时间(RT)，分钟；(vii)机器人系统使用Zymate XP机器人，用Zymate masterLaboratory Station溶液添加进行，经Stem RS5000 Reacto-Station搅拌在25℃进行；(viii)由机器人合成得到的反应混合物的加工和纯化过程如下进行蒸发过程在真空中使用Savant Sympur MPLC或Jones FlashmasterMPLC系统用硅胶，使用Varian Mega Bond Elut药筒进行；最终产物的结构由LCMS用Micromaaa OpenLynx系统使用如下条件进行，读数为停留时间(RT)，分钟柱 4.6mm×10cm hichrom RPB 100?溶剂(体系A)I＝5％在水中的甲醇+0.1％甲酸，
II＝5％在乙腈中的甲醇+0.1％甲酸，溶剂(体系B)I＝水+0.1％甲酸，
II＝乙腈+0.1％甲酸，停留时间 10分钟，6分钟梯度由5-95％II波长 254nm，带宽10mm质量检测器Platform LC(ix)中间体通常不完全表征，纯度用薄层色谱法(TLC)、HPCL、红外(IR)、MS或NMR分析确定；(x)在干燥溶液时，硫酸镁是干燥剂；(xi)如下缩写可用于上文或下文
DCM二氯甲烷；
DMFN，N-二甲基甲酰胺；
DMSO 二甲基亚砜；
NMPN-甲基吡咯烷-2-酮；
THF四氢呋喃；和(xii)为避免重复，在描述“前体胺”时，该胺含有超过1个的氮，形成的实施例不是季铵化合物。实施例14-苯氨基-5-氯-2-{4-{N-[3-(咪唑-1-基)丙基]氨基甲酰基}苯氨基}嘧啶
将4-苯氨基-2-(4-羧基苯氨基)-5-氯嘧啶(方法1；170mg，0.5mmol)加入在反应管中的1-(3-氨基丙基)咪唑(93.9mg，0.75mmol)中，加入1-羟基苯并三唑(101mg，0.75mmol)，随后加入在DCM(4ml)中的N，N-二异丙基乙胺(130mg，0.75mmol)。混合物用氩气冲洗，随后搅拌1小时。加入在DCM(3ml)中的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(105mg，0.55mmol)，混合物搅拌16小时。混合物用饱和碳酸氢钠溶液(10ml)、水(10ml)和饱和氯化钠溶液(10ml)洗涤，有机相加入Varian Mega Elut柱，用在DCM中的0-10％2.0M甲醇氨溶液洗脱得到产物(11.6mg，5.2％)。
NMR2.0-2.15(m，2H)，3.0-3.1(m，2H)，4.25(t，2H)，7.25(t，1H)，7.4(t，2H)，7.6(d，4H)，7.7(s，1H)，7.75(d，2H)，7.85(d，1H)，8.3(s，1H)，8.6(br t，1H)，9.25(d，1H)，9.6(br s，1H)，10.3(br s，1H)；LCMS(MH+)448；HPLC(RT，System A)6.16.实施例2-10
如下化合物通过类似于实施例1中的方法，使用Zymate XP机器人，使用4-苯氨基-2-(4-羧基苯氨基)-5-氯嘧啶(方法1)和合适的胺制备
1体系A2如US3856783中所述得到的前体胺3如J.Med.Chem.(1974)，17，1232-4所述得到的前体胺实施例11-20
如下化合物通过类似于实施例1中的方法，使用Zymate XP机器人，使用4-苯氨基-5-溴-2-(3-羧基苯氨基)嘧啶(方法4)和合适的胺制备
1体系A2如US3856783中所述得到的前体胺3如J.Med.Chem.(1974)，17，1232-4所述得到的前体胺实施例21-30
如下化合物通过类似于实施例1中的方法，使用Zymate XP机器人，使用5-溴-2-(4-羧基苯氨基)-4-(4-甲氧基苯氨基)嘧啶(方法5)和合适的胺制备
1体系A2如US3856783中所述得到的前体胺3如J.Med.Chem.(1974)，17，1232-4所述得到的前体胺实施例31-40
如下化合物通过类似于实施例1中的方法，使用Zymate XP机器人，使用5-溴-2-(4-羧基苯氨基)-4-(4-甲氧基苯氨基)嘧啶(方法26)和合适的胺制备
1体系A2如US3856783中所述得到的前体胺3如J.Med.Chem.(1974)，17，1232-4所述得到的前体胺实施例41-58
如下化合物通过类似于实施例1中的方法，使用Zymate XP机器人，使用4-苯氨基-5-溴-2-(4-羧基苯氨基)嘧啶(方法6)和合适的胺制备
1体系B2如Heterocycl.Commun.(1996)，2，241-246中所述得到的前体胺3如Recl.Trav.Chim.Pays-Bas(1992)，111，371-8所述得到的前体胺4如Eur.J.Med.Chem.-Chim.Ther.(1975)，10，171-7所述得到的前体胺实施例595-溴-4-(4-氟苯氨基)-2-(4-{N-[3-(2-氧代吡咯烷-1-基)丙基]氨基甲酰基}苯氨基)嘧啶
1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(52mg，0.27mmol)加入5-溴-2-(4-羧基苯氨基)-4-(4-氟苯氨基)嘧啶(方法7；100mg，0.25mmol)，N-(3-氨基丙基)-2-吡咯烷酮(38mg，0.27mmol)和1-羟基苯并三唑(44mg，0.32mmol)在DMF(0.5ml)中的混合物中。混合物搅拌16小时，随后加入饱和氯化钠溶液和水的1∶1混合物(10ml)，过滤收集沉淀的固体，在真空烘箱中在40℃下干燥至恒重得到产物灰白色固体(98mg，75％)。MS(MH+)528；HPLC(RT)4.01。实施例60-85
如下化合物通过类似于实施例59中描述的方法，使用合适的4-苯氨基-5-溴-2-(4-羧基苯氨基)嘧啶(方法7-13)和合适的胺制备
1在得到的实施例的2-苯氨基的4-位上的取代基是N-(2-异丙基氨基乙基)氨基甲酰基。实施例86-90
如下化合物通过类似于实施例59中描述的方法，使用合适的2-(4-羧基苯氨基)-5-氟-4-(4-甲氧基苯氨基)嘧啶(方法27)和合适的胺制备
实施例91-98
如下化合物通过类似于实施例59中描述的方法，使用合适的5-溴-2-(4-羧基苯氨基)-4-(2-吡啶基氨基)嘧啶(方法30-31)和合适的胺制备
1在得到的实施例的2-苯氨基的4-位上的取代基是N-(2-异丙基氨基乙基)氨基甲酰基。实施例99-100
如下化合物通过类似于实施例59中描述的方法，使用合适的4-苯氨基-5-溴-2-[4-(羧基甲基)苯氨基]嘧啶(方法32)和合适的胺制备
实施例1014-苯氨基-5-溴-2-{4-[3-(二甲基氨基)丙酰氨基]苯氨基}嘧啶
将二甲胺在四氢呋喃中的溶液(2.0M；4ml)加入4-苯氨基-5-溴-2-[4-(3-氯丙酰氨基)苯氨基]嘧啶(方法37；60mg；0.135mmol)在DMF(0.2ml)中的溶液中，溶液在80℃下加热1小时，用DCM(4ml)稀释，加入Varian Mega Bond Elut柱中，用0-10％在DCM中的2.0M甲醇氨溶液洗脱，得到产物(5.4mg，9％)。MS(MH+)455，457；HPLC(RT)2.70。实施例1024-苯氨基-5-溴-2-{4-[3-(异丙基氨基)丙酰氨基]苯氨基}嘧啶
采用类似于实施例101中描述的方法，但由4-苯氨基-5-溴-2-[4-(3-氯丙酰氨基)苯氨基]嘧啶(方法37)和异丙胺开始，得到产物。MS(MH+)469，471；HPLC(RT)3.70。实施例1034-苯氨基-2-{4-{N-[3-(咪唑-1-