专利名称：温度敏感性乙型肝炎疫苗的制作方法根据世界卫生组织(WHO)的统计，占世界人口三分之一以上的人曾感染过乙型肝炎病毒(h印atitis B virus、HBV)，且慢性乙型肝炎病毒带原者约有三亿五千万人，其中 15%至25%病患处于由乙型肝炎病毒所并发之肝疾病风险中，甚至演变为肝硬化或肝癌， 每年因为乙型肝炎死亡者约有一百万人。用来防止乙型肝炎病毒感染及传播的主要对策系为乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)的预防注射。目前市售标准的三剂式乙型肝炎病毒疫苗(来自于HBV带原者之血浆或藉由基因重组技术制造)可使约九成的接种者藉由免疫反应成功产生乙型肝炎病毒表面抗体(anti-HBs)。乙型肝炎病毒抗原疫苗的免疫成功率系由国家HBV免疫计划对台湾新生儿进行预防接种所统计得出，对于HBV慢性带原者的成功率由10%至小于1 %，而对于 12-14岁儿童的成功率降低至75%。然而，少部份(约5-10% )正常的疫苗接种者以及约40-50%接受常规血液透析的患者(肾功能衰竭患者)对于目前HBsAg疫苗没有产生免疫反应。目前对HBsAg疫苗没有产生反应的机制并未完全确认，不过由基因研究的证据指出，HLA-DR等位基因与疫苗的低反应有紧密的关连性，而不同种族人种则有不同的HLA-DR 等位基因。基于上述，发展出新颖的乙型肝炎疫苗，来增强疫苗产生的免疫反应及克服对疫苗的不反应性，是当前免疫技术所期盼的。
本发明提供一种温度敏感性乙型肝炎疫苗，该乙型肝炎疫苗主要包含一生物可分解温度敏感性水凝胶共聚物(hydrogelcopolymer)之水相溶液；至少一乙肝抗原(HBsAg)； 以及至少一生物活性成分。以下藉由数个实施例并配合所附图式，以更进一步说明本发明之方法、特征及优点，但并非用来限制本发明之范围，本发明之范围应以所附之申请专利范围为准。图1系绘示分别施以不同乙型肝炎疫苗的老鼠其所量测到的乙型肝炎病毒表面抗原效价。图2系绘示分别施以本发明所述之乙型肝炎疫苗(由实施例2所制备)及目前市售疫苗(H-B-Vax II)的老鼠其所量测到的乙型肝炎病毒表面抗原效价。图3系绘示分别施以本发明所述之乙型肝炎疫苗(由实施例2所制备)的不同品种老鼠其所量测到的乙型肝炎病毒表面抗原效价。图4系绘示分别施以不同乙型肝炎疫苗的BIO. M品种老鼠其第1次注射及第2次注射后所量测到的乙型肝炎病毒表面抗原效价。图5系绘示分别施以不同乙型肝炎疫苗的老鼠(以HBs及BSA分别测式)其所量测到的刺激指数。
以下藉由数个实施例并配合所附图式，以更进一步说明本发明之方法、特征及优点，但并非用来限制本发明之范围，本发明之范围应以所附之申请专利范围为准。生物可分解温度敏感性水凝胶共聚物之水相溶液的制备实施例1组装设备为一枝冷凝管，将此冷凝管包裹加热带装置，可以把反应过程中析出的单体回熔，反应器为一 250mL之柱状玻璃器(8cmX8CmX10Cm)，加热器和温控器各一台， 使用机械搅拌进行聚合反应，聚合前先升温至100°C以上，并通氮气30分钟，以除去杂质、水气。^g甲氧基聚乙二醇(mPEG，分子量550g/mol)、50g丙交酯及17g乙交酯依序加入反应器中，缓慢升高温度，直至完全溶解。温度计序升高至110°C，此时加入催化剂 6tannous2-ethyl-Hexanoate，2-乙基己酸亚锡)37μ 1，反应温度为150°C。聚合反应进行 8小时，产物以乙醚/正己烷(v/v= 1 1)沉淀，为半透光胶质，重复清洗残留单体3次， 在40°C温度下，真空干燥M小时，得到二嵌段共聚物mPEG55C1-PLGA14(15(生物可分解温度敏感性水凝胶共聚物)。接着，将15g所得之生物可分解温度敏感性水凝胶共聚物HIPEG55ci-PLGA14ci5加入 85ml之水中，配置成生物可分解温度敏感性水凝胶共聚物之水相溶液(该共聚物之重例百分比系为15wt% )0溫度敏感件乙型肝炎疫苗的制备实施例2将HBsAg(yeast-derived recombinant) (2 μ g)、及老鼠 GM_CSF(由毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris yeast)培养而得)(5. 4 μ g 或 4. 5xl04U))与 0. 2ml 实施例 1 所制备之水相溶液(包含生物可分解温度敏感性水凝胶共聚物mPEG55(l-PLGA14(l5)混合，得到温度敏感性乙型肝炎疫苗。乙型肝炎抗体程度测量实施例3将实验对象老鼠分为6组，并分别对每组实验对象施以下述疫苗(1) 2 μ g HBsAg 置于生理食盐水(saline)中，(2) 2 μ g HBsAg+5. 4 μ gGM-CSF置于生理食盐水中，(3) 2 μ g HBsAg置于实施例1所制备之水相溶液中，(4)实施例2所述之温度敏感性乙型肝炎疫苗O μ gHBsAg+5. 4 μ g GM-CSF置于实施例1所制备之水相溶液中)，(5)分开注射2 μ g HBsAg(其置于实施例1所制备之水相溶液中)及5.4yg GM-CSF(其置于实施例1所制备之水相溶液中)，以及(6) 2 μ gH-B-Vax II (Merck Sharp & Dohme West Point, PA)(市售疫苗，以氢氧化铝作为辅剂)。所使用的BALB/c老鼠其鼠龄介于6至8周间。接着，收集每组实验对象老鼠的血清并计算HBs抗体。请参照图1，第1组老鼠 (注射HBsAg(于生理食盐水中(以下简称HBs)))产生较低的乙型肝炎病毒表面抗原效价 (14士 13U/ml，mean士SD)；而第2组老鼠(注射HBsAg+GM-CSF (于生理食盐水中(以下简称 HBs+GM)))产生的乙型肝炎病毒表面抗原效价约为第1组的两倍( 士 10U/ml)；此外，第3 组老鼠(注射HBsAg(其置于实施例1所制备之水相溶液中(以下简称Gel/HBs)))产生的乙型肝炎病毒表面抗原效价约为第1组的6倍之多；而在所有实验组中最显著的结果系为第4组(使用实施例2所述之乙肝疫苗(HBs及GM-CSF配置于实施例1所制备之水相溶液中，以下简称Gel/HBs+GM)，所产生的乙型肝炎病毒表面抗原效价达到773士227U/ml (约为第 1 组(P = 0. 0008)的 56 倍、第 2 组(p = 0. 0009)的 27 倍、以及第 3 组(p = 0. 0008)。此外，在第5组可观察到，当分开注射HBsAg/Gel以及GM_CSF/Gel时(以下简称Gel/HBs+Gel/ GM)，GM-CSF的辅助活性会丧失，导致较低的乙型肝炎病毒表面抗原效价(45士6U/ml)。进一步将本发明所述之乙型肝炎疫苗与市售疫苗比较，请参照图2，第4组老鼠(注射本发明实施例2所述之疫苗)所产生之乙型肝炎病毒表面抗原效价(1040士660U/ml)远高于第6 组老鼠(注射市售H-B-VAXII疫苗)所产生之乙型肝炎病毒表面抗原效价(182士63U/ml， p = 0. 014)。为了确认增加抗体的效果不会仅发生于BALB/c (haplotypeH-2d)老鼠上，其他的几个品种的老鼠 C57BL/6 (haplotype H_2b) ,C3H/HeN(haplotype H_2k)、以及远交系 ICR老鼠亦被用来重复上述第2组(注射HBs+GM)及第4组实验(实施例2所制备的疫苗(Gel/ HBs+GM))。请参照图3，无论是何品种，被施以本发明实施例2所制备的疫苗(Gel/HBs+GM) 的老鼠其乙型肝炎病毒表面抗原效价皆高于第2组注射HBs+GM (于生理食盐水中)的老鼠 (对于C3H/HeN品种，第4组的老鼠其产生的乙型肝炎病毒表面抗原效价系为第2组老鼠的 4倍；对于C57BL/6品种，第4组的老鼠其产生的乙型肝炎病毒表面抗原效价系为第2组老鼠的34倍；对于ICR品种，第4组的老鼠其产生的乙型肝炎病毒表面抗原效价系为第2组老鼠的6倍)。接着，为确认本发明所述之疫苗是否可进一步加强T细胞(Tcell)的免疫反应，将 BALB/c老鼠分别注射上述第1至4组所述的疫苗两次(间隔时间为两周)。在完成第二次注射的一个星期后，各组老鼠之脾细胞被取出并进行培养以观察对专一性(HBsAg)及非专一性(牛血清白蛋白(BSA)，作为对照组)抗原的刺激反应，实验结果请参表1。由第一组老鼠的脾脏淋巴细胞可得知其对使用的HBsAg的增加量具有剂量依存性增生反应，其平均峰值刺激指数约可达7. 0 (当HBsAg的剂量为10 μ g/ml)。与第1组相比，第2组及第3组经由免疫反应所产生的细胞增生反应相对较高，其平均峰值刺激指数分别达到9. 1及11. 0 (当HBsAg的剂量为10 μ g/ml)。不意外的，第4组被观察到具有最显著的T细胞增生反应，其平均峰值刺激指数接近43. 3 (当HBsAg的剂量为10 μ g/ml)。此外， 在1-4组的对照组中，所有牛血清白蛋白并不会使老鼠产生T细胞增生反应(即使将牛血清白蛋白BSA的浓度提高至30 μ g/ml)，因此T细胞(T cell)增生反应只有对于HBsAg具有单一性。表

本发明提供一种温度敏感性乙型肝炎疫苗，该乙型肝炎疫苗主要包含一生物可分解温度敏感性水凝胶共聚物之水相溶液；至少一乙肝抗原(HBsAg)；以及至少一生物活性成分。由于本发明所述之乙型肝炎疫苗包含具有生物可分解温度敏感性水凝胶共聚物的水相溶液，可加强乙型肝炎抗原的免疫反应，非常适合施予对目当前乙型肝炎疫苗具有低反应性或不反应性之患者，诱发其体内的乙型肝炎免疫反应，达到预防乙型肝炎的目的。