专利名称：四价轮状病毒灭活疫苗的制备及应用的制作方法 轮状病毒属于肠病毒科的双链RNA病毒，其外壳蛋白是型特异性抗原，根据其抗原性的不同，将轮状病毒分A、B两群，其中引起人类腹泻的主要是A群。A群轮状病毒又依据外壳蛋白VP7的不同分为14个血清型，即G1-G14型，而引起婴幼儿腹泻的主要是G1、G2、G3、G4型轮状病毒。目前有关四价轮状病毒灭活疫苗的制备未见报道。
本发明的目的是提供一种四价轮状病毒灭活疫苗的制备。本发明的另一目的是提供一种四价轮状病毒灭活疫苗的应用。本发明的目的可以通过以下措施实现一种四价轮状病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下工艺步骤①细胞的制备将小牛肾细胞或Vero细胞用胰酶消化分散，加入D-MEM完全培养液在37℃培养至细胞成片，再用无血清D-MEM培养液清洗细胞，用于接种轮状病毒。②病毒接种和培养将G1型、G2型、G3型、G4型轮状病毒毒种加入10～15ug/ml胰酶，37℃消化45分钟，以感染复数为5～10将G1型、G2型、G3型、G4型轮状病毒分别接种到步骤①制备的细胞，并在36.5-37.5℃吸附40～60分钟后吸弃病毒液，再用含1～1.5ug/ml胰酶的无血清D-MEM培养液于33～35℃培养至细胞出现明显病变时终止；③病毒收集、浓缩和纯化将上述接种的各病变细胞冻融，高速离心后收集上清液得各病毒原液；通过超滤浓缩上述病毒原液，并以蔗糖密度梯度离心或柱层析纯化病毒后即为各单价病毒原液。④病毒灭活采用0.05％福尔马林或1∶4000β-丙内酯灭活上述各单价病毒，除菌过滤后即为单价疫苗原液；⑤混合上述各单价疫苗原液；⑥成品的配制将经混合的单价疫苗原液加入适量的氢氧化铝，即为成品。本发明制备的四价轮状病毒灭活疫苗经动物(检定用动物小鼠、豚鼠应符合清洁级标准)实验已证明具有良好的免疫原性。
本发明制备的四价轮状病毒灭活疫苗，用于预防婴幼儿轮状病毒感染性疾病。

实施例一一种四价轮状病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下工艺步骤1、细胞的制备将小牛肾细胞(新生小牛肾细胞的牛肾来源为健康的初生小牛。牛群应符合《中华人民共和国动物防疫法》的要求。原代牛肾细胞应符合《生物制品生产用动物细胞制备及检定规程》)用胰酶消化分散，加入D-MEM完全培养液在37℃培养至细胞成片后，再用无血清D-MEM培养液清洗细胞3次，用于轮状病毒接种。
2、病毒接种和培养将G1型、G2型、G3型、G4型轮状病毒毒种(病毒经轮状病毒G血清型检定、轮状病毒基因组核酸电泳试验、轮状病毒VP7基因核苷酸序列测定、病毒滴定、无菌检查、病毒外源因子检查、免疫原性检查，各相检定应符合要求。)加入10～15ug/ml胰酶，37℃消化45分钟，以感染复数为5～10将G1型、G2型、G3型、G4型轮状病毒分别接种到步骤①制备的细胞，并在36.5-37.5℃吸附40～60分钟后吸弃病毒液，再用含1～1.5ug/ml胰酶的无血清D-MEM培养液于33～35℃培养(一般感染复数为5～10，培养3～5天)至细胞出现明显病变时终至。
3、病毒收集将终至培养的病变细胞冻融3次，于10000rpm，4℃高速离心，30分钟后收集上清液。
4、病毒的浓缩及纯化通过超滤浓缩上述病毒原液，并以蔗糖密度梯度离心或柱层析纯化病毒后即为各单价病毒原液。
5、病毒灭活采用0.05％福尔马林或1∶4000β-丙内酯灭活病毒。用福尔马林灭活病毒应在病毒纯化前进行；采用β-丙内酯灭活病毒可在病毒纯化后进行。灭活后立即进行灭活试验，结果应为阴性。灭活后可加入适量人白蛋白作稳定剂及一定量硫柳汞作防腐剂，除菌过滤后即为单价疫苗原液。无菌试验合格后即可配制疫苗原液。
6、G1型、G2型、G3型、G4型疫苗混合将无菌试验、病毒灭活试验合格的G1型、G2型、G3型、G4型单价疫苗原液等量混合即为四价疫苗原液。
7、半成品配制合并后的四价疫苗原液加入适量的氢氧化铝，即为半成品。分装后制成成品疫苗。
实施例二、一种四价轮状病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下工艺步骤1、细胞的制备将Vero细胞用胰酶消化分散，加入D-MEM完全培养液在37℃培养至细胞成片后，再用无血清D-MEM培养液清洗细胞3次，用于轮状病毒接种。
其余工艺步骤与实施例一完全相同。
疫苗的检定1、原液检定本发明的各单价疫苗原液经无菌试验、病毒滴定、灭活试验、牛血清蛋白残留量、总蛋白含量检定均为合格。
2、成品检定本发明四价轮状病毒灭活疫苗的成品经鉴别试验、外观、pH值、硫柳汞含量、氢氧化铝含量、效力测定、热稳定性试验、异常毒性检查、细菌内毒素检查等检定完全合格。
实施例三、免疫原性实验BALB/C小鼠，14～16克，免疫接种前尾静脉采血，分离血清冻存于-20℃。小鼠肌肉注射接种四价轮状病毒灭活疫苗，4周后采血，分离血清，用中和试验测定免疫前后小鼠血清中和抗体滴度。小鼠免疫后抗体阳转率为96～100％(以免疫后抗体4倍以上增长为抗体阳转。)


本发明涉及一种四价轮状病毒灭活疫苗的制备方法，该方法将胰酶消化分散的小牛肾细胞或Vero细胞培养成片后以不同的感染复数分别接种G1、G2、G3、G4型轮状病毒，用无血清D一MEM培养液至细胞出现明显病变后收获病毒液并经浓缩、纯化、灭活、混合后加入适量的氢氧化铝制备而成。本发明制备的四价轮状病毒灭活疫苗经动物实验证明具有良好的免疫原性；经无菌试验、病毒滴定、灭活试验、总蛋白含量、硫柳汞含量、氢氧化铝含量、效力测定、热稳定性试验、异常毒性检查、细菌内毒素检查等检定完全合格，主要用于预防婴幼儿轮状病毒感染性疾病。