专利名称：四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺的制作方法流行性脑脊髓膜炎是由脑膜炎双球菌引起的化脓性脑膜炎，简称流脑。流脑的流行早在16世纪即被发现，易感人群主要为儿童及青少年。发病症状分普通型和爆发型；普通型表现为剧烈头疼、频繁呕吐、烦躁不安和颈项强直凯尔尼格征和布鲁津斯基征阳性等脑膜刺激症状，伴有呼吸、循环衰竭或其它并发症；爆发型多见于儿童病人。起病急剧，病情凶险，如不及时抢救，常在M小时内危及生命。爆发型病死率最高可达40~60%。任何年龄都可发病，其中14岁以下年龄、尤其是7岁以下儿童发病率最高。脑膜炎双球菌隐藏于患者或带菌者的鼻咽分泌物中，主要通过咳嗽、打喷嚏、说话等由飞沫直接从空气传播，进入呼吸道而引起感染。从全球来看，流脑散发病例和地方性流行仍然在危害人类健康。其流行的地域分布极广，几乎遍及各大洲。各国之间流脑的发病水平差异很大，在发展中国家发病率相对较高，在非洲发病率最高。当今，全世界每年发生30万 35万流脑病例。高发地区依然是非洲、亚洲和南美洲。非洲撒哈拉以南的“脑膜炎地带“的发病率最高，在流行年度可高达 400 /十万 800 /十万。由于地理及气候原因，流行季节一般在11月底至次年6月底之间。这一地带向东已延伸至埃塞俄比亚，往西已扩大到塞内加尔，涉及18个国家，约有3亿人口，且还有扩大的趋势。自1980年起，这一地带呈有规律地暴发流行。近年来，流行性脑脊髓膜炎爆发流行由过去的A群为主，逐渐演变为A群与其他群并存。1996年，南撒哈拉非洲国家发生一次历史上最大的流脑流行，报道病例数达18万以上，死亡18000人，流行菌群以B群和C群为主。2000年与2001年沙特阿拉伯哈吉地区两次爆发流行性脑脊髓膜炎， 共发病500多例，其中230多例为W135群，其余均为A群。据WHO报告，2002年春季布基纳法索爆发流脑，发病12，587例，死亡1，447例，死亡率11.5%。也主要以W135群为主。 我国在1938年、1949年、1959年、1967年、1977年共发生过五次全国性流脑大流行，平均约 8 10年流行一次，主要以A群脑膜炎双球菌引起的流脑流行为主。1967年春季发病率达到最高峰，为403/10万，病死率5. 49%。80年代初我国研制的A群流脑多糖疫苗获准投入使用，预防效果良好，80年代以后我国未再发生全国性的大流行。1985年发病率为9. 9/10 万，1986年 1989年的发病率依次为7. 56/10万、3. 21/10万、1. 97/10万、1. 32/10万。疫苗的使用，有效地控制了流行高峰。但散发病例仍然存在。根据流行规律，推测近几年我国将是流行性脑脊髓膜炎的流行周期。近年来，流行性脑脊髓膜炎的流行还具有菌群漂移的特点，如美国从前为A群流行性脑脊髓膜炎流行，以后为B群流行性脑脊髓膜炎流行，再后来又转为C群流行性脑脊髓膜炎流行，目前则转为Y群流行。我国的流行性脑脊髓膜炎流行主要以A群为主。随着A群流脑多糖疫苗的广泛使用，人群对A群流脑双球菌具有一定的免疫力，由A群流脑双球菌引起的流行性脑脊髓膜炎比例呈逐年下降趋势，而由C群及其他群流脑双球菌引起的流行性脑脊髓膜炎病例逐年上升。最近几年C群流行性脑脊髓膜炎局部爆发偶有发生，去年12月至今年1月安徽省11市共发生C群流行性脑脊髓膜炎病例 60例，死亡8例。福建省去年底也发生4例C群流行性脑脊髓膜炎。从流行趋势看，C群流行性脑脊髓膜炎发病例数逐年增多，发病范围逐渐扩大。此外，也不排除非洲国家流行的 W135群流行性脑脊髓膜炎，美国流行的Y群等流行性脑脊髓膜炎输入我国的可能性。在非洲和亚洲都存在流行性脑脊髓膜炎流行带，过去也都以A群流行性脑脊髓膜炎流行为主， 但非洲流行性脑脊髓膜炎流行带已转为W135群流行为主，A群流行为辅的现象。随着国际间交流的增加，人员流动频繁，在国外流行的Y型和W135型流脑输入我国的可能性也在增加。因此，研制(A+C+Y+W135)四价脑膜炎球菌多糖疫苗具有重要意义。
本发明所要解决的技术问题是提供四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺，该制备工艺可以制备得到的四价脑膜炎球菌多糖疫苗，为四价疫苗，注射一针即有多种免疫效用； 并且该疫苗安全性和各项检定参数都符合标准。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤(1)选用菌种生产用菌种为A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种、C群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种、 Y群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种；(2)种子批的建立及传代将1支原始种子冻干菌种开启后，接种在10%羊血琼脂培养基上，放于35 37°C、5 10% 二氧化碳环境培养16 20小时传第二代，将第二代培养物采入无菌脱脂牛奶中，混勻冻干制备主代种子批；再将1支主种子批菌种开启后，接种在 10%羊血琼脂培养基上，放于35 37°C、5 10% 二氧化碳环境培养16 20小时传第二代，冻干为工作种子批；所述主种子批和所述工作种子批菌种冻干后进行生物学特性检定， 所述主种子批和所述工作种子批菌种的生物学特性与原始种子批菌种一致；(3)生产疫苗原液开启工作种子批菌种1支，接种于10%羊血琼脂培养基制备第一代， 将第1代菌种接种于改良半综合固体培养基，继续传代第2代，将第2代菌种接种于改良半综合固体培养基，继续传代第3代，将第3代菌种接种于改良半综合液体培养基，继续传代第4代，继续将第4代菌种接种至大罐培养，大罐培养为第5代，第5代的大罐培养为改良半综合液体培养基；第5代大罐培养的培养物生产疫苗原液，每1支工作种子用于1批疫苗原液生产；所述第5代大罐培养采用培养罐液体培养；(4)收获及杀菌于对数生长期的后期或静止期的前期收获终止培养，终止培养时取样进行纯菌试验，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液至终浓度按体积分数计为1%，杀菌 30分钟；(5)去菌体将已杀菌的培养液经HOOOrpm管式连续流离心机离心，离心流速为 1500 1600ml/min,收集上清液；
(6)沉淀、解离所述步骤(5)收集的上清液，加入10%十六烷基三甲基溴化铵至终浓度按体积分数计为0. 1%，充分混勻，A群静置3 5小时，Y群静置5 8小时，C、W135群静置8 12小时；以14000rpm管式连续流离心机离心，离心流速为2000 2500ml/min,离心后收集沉淀物；将收集的沉淀物用lmol/LCaCl2研磨均勻，得到混勻的多糖复合物；将所述混勻的多糖复合物收集于瓶中，放在磁力搅拌器上，搅拌1小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵充分解离；
(7)去核酸在多糖复合物中加入2 8°C冷却过的95%的乙醇至终浓度按体积分数计为25%，摇勻，2 8°C存放，A群多糖静置存放1 3小时，C群和W135群静置存放16 20小时，Y群多糖静置存放10 14小时；4000rpm离心30分钟，去沉淀，收集上清液；
(8)沉淀收集多糖于上述上清液中加入2 8°C冷却过95%乙醇至最终浓度为A群按体积分数计为80% ；C群、Y群及W135群按体积分数计为75%，充分振摇，待沉淀出现后静置1 2小时；4000rpm离心5分钟收集沉淀；用无水乙醇和丙酮洗涤2次以上，收集多糖沉淀，压缩空气风干；干燥沉淀物即为多糖粗制品；保存在-20°C或以下，待纯化；
(9)超滤膜过程去除杂蛋白和内毒素将所述步骤(8)得到的多糖粗制品溶解于1/ 10饱和中性乙酸钠溶液中，A群使其浓度达15 20mg / ml，C群、Y群和W135群使其浓度达10 15mg / ml ；用截留分子量为6000道尔顿的超滤膜进行超滤，使杂蛋白和内毒素被截留在超滤膜上从而被去除掉，收集超滤液为收获液；
(10)沉淀精多糖将步骤(10)收集的收获液中加入95%的乙醇至终浓度为A群按体积分数计为80%，C群、Y群及W135群按体积分数计为75% ；充分摇勻，置冷库2 8°C 1小时， 4000rpm 10分钟离心收集沉淀物；用无水乙醇和丙酮洗涤2次以上，收集多糖沉淀，压缩空气风干，干燥沉淀物即为精多糖，保存在-20°C或以下；提取过程在15°C以下进行。用无菌注射用水溶解精多糖，经除菌过滤后即为原液，要求过滤前后0. 2Mm滤膜完整性试验合格， 原液取样后进行检定；
(11)半成品配制合并单批或两批以上的原液后即为半成品，用无菌无热原乳糖和灭菌注射用水稀释至含A群、C群、Y群、W135群多糖分别为100.0yg/ml，乳糖为20mg/ml ；稀释后立即经0. 2μπι过滤，过滤抽样送检，于2 8°C保存；
(12)分装、冻干，制备疫苗成品上述半成品采用洗烘灌联动机组分装，玻璃管制注射剂瓶盛装，分装规格为0. 5ml/瓶，分装过程中自动加卤化丁基橡胶塞，分装完成后，在分装后6小时内冻干；冻干完成即进行真空压塞和轧盖；完成轧盖的制品进行透视检查及贴签；完成贴签的制品即冻干疫苗成品，送2 8°C冷库保存。进一步的，所述步骤(4)菌体培养达到对数生长期的后期或静止期的前期的判断方法为，细菌浓度不再增加，达到160亿/ml或pH开始回升至7. 0 7. 5。进一步的，所述步骤(3)大罐培养的培养条件培养基量为300 600L，通气量为 10 30m3/h，搅拌速度为200 ;350rpm,用20%Na0H溶液维持pH在6. 70 7. 40 ；在培养过程中，进行菌液浓度测定和革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，121°C，30min灭菌处理后废弃。进一步的，所述10%羊血琼脂培养基的配方为以IOOml计，含有羊血IOml ；琼脂培养基100 ml。进一步的，所述改良半综合固体培养基的配方为以IOOOml计，含有
50%盐酸酪素水解液或盐酸水解酪蛋白按总氮计算为1300mg ；洲盐酸酪素水解液按总氮计算为1300mg ；酵母透析液50ml ；淀粉5g ；磷酸二氢钾Ig ；硫酸镁0. 6g ；葡萄糖2g ；琼脂 26go进一步的，所述改良半综合液体培养基由甲液和乙液构成，以10000ml计的配方为所述甲液包括 50%盐酸酪素水解液或盐酸水解酪蛋白按总氮计算为13000mg ；酵母透析液IOOml ；氯化钾IOg ；L-谷氨酸钠IOg ；氯化铵12. 5g ；十二水合磷酸氢二钠7. 5g ；磷酸二氢钠2. 5g ； 10%胱氨酸溶液3ml ；所述乙液包括硫酸镁6g和葡萄糖55g。综上所述，本发明与现有技术相比，其优点在于本发明采用了超滤膜过程实现了一步法同时去除去除杂蛋白和内毒素的目的；不仅确保了本发明制备得到的ACYW135四价脑膜炎球菌多糖疫苗的纯度和免疫活性符合标准，减少了制备工艺的经济成本。

(1)选用菌种生产用菌种为A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种、C群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种、 Y群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种；
(2)种子批的建立及传代生产用菌种应建立种子批系统。原始种子批应验明其记录、 历史、来源和生物学特性。将1支原始种子冻干菌种开启后，接种在10%羊血琼脂培养基上， 放于35 37°C、5 10% 二氧化碳环境培养16 20小时，在35 37°C条件下传第二代， 将第二代培养物采入无菌脱脂牛奶中混勻冻干制备主代种子批。再将1支主种子批菌种开启后，采用上述相同条件培养传至第二代，扩增后冻干为工作种子批。主种子批和工作种子批菌种冻干后均必须进行生物学特性检定，主种子批和工作种子批菌种的各种生物学特性应与原始种子批菌种一致。主种子批菌种用于生产工作种子批，工作种子批用于生产疫苗。 主种子批由原始种子批开启后传2代制备，主种子批开启后传2代制备工作种子批；工作种子批开启后传4代制备生产用种子。工作种子批开启后至接种发酵罐培养传代次数不得超过5代。(3)生产疫苗原液开启工作种子批菌种1支，接种于10%羊血琼脂培养基2支， 放35 37°C、5 10% 二氧化碳环境培养16 20小时，涂片镜检合格，将第1代菌种接种于改良半综合固体培养基4 6瓶，继续传代第2代，于35 37°C、5 10% 二氧化碳环境培养10 18小时，涂片镜检合格后将第2代菌种接种于改良半综合固体培养基20 25 瓶，继续传代第3代，于35 37°C培养10 18小时，涂片镜检合格后将第3代菌种接种于改良半综合液体培养基30 40 L，继续传代第4代，继续将第4代，于35 37°C深层通气搅拌培养3 8小时，涂片镜检及细菌浓度测定合格后将将第4代菌种作为生产用种子接种至大罐培养。所述大罐培养的培养条件为采用培养罐液体培养，培养基为改良半综合液体培养基，培养基量为300 600L。于大罐培养基中接种第4代生产用种子后，深层通气搅拌培养。通气量为10 30m3/h，搅拌速度为200 350rpm。用20%Na0H溶液维持pH 在6. 70 7. 40范围。在培养过程中，进行菌液浓度测定和革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应121°C 30min灭菌处理后废弃。大罐培养的培养物生产疫苗原液，每1支工作种子用于1批疫苗原液生产。(4)收获及杀菌于对数生长期的后期或静止期的前期收获终止培养，终止培养时取样进行纯菌试验，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液至终浓度按体积分数计为1%， 杀菌30分钟；于对数生长期的后期或静止期的前期收获终止培养，A群、C群及W135群培养一般为6.5 士 1小时，Y群培养一般为11 士 3小时，当细菌浓度不再增加，达到160亿/ml或PH开始回升至7. 0 7. 5时即可终止培养，终止培养时取样进行纯菌试验，在收获的培养液中加入甲醛溶液至终浓度1% (V/V)，杀菌30分钟。(5)去菌体将已杀菌的培养液经HOOOrpm管式连续流离心机离心，离心流速为 1500 1600ml/min,收集上清液。(6)沉淀、解离所述步骤(5)收集的上清液，加入10%十六烷基三甲基溴化铵至终浓度按体积分数计为0. 1%，充分混勻，A群静置3 5小时，Y群静置5 8小时，C、W135 群静置8 12小时；以HOOOrpm管式连续流离心机离心，离心流速为2000 2500ml/min， 离心后收集沉淀物；将收集的沉淀物用lmol/LCaCl2研磨均勻，得到混勻的多糖复合物；将所述混勻的多糖复合物收集于瓶中，放在磁力搅拌器上，搅拌1小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵充分解离。(7)去核酸在多糖复合物中加入2 8°C冷却过的95%的乙醇至终浓度按体积分数计为25%，摇勻，2 8°C存放，A群多糖静置存放1 3小时，C群和W135群静置存放 16 20小时，Y群多糖静置存放10 14小时；4000rpm离心30分钟，去沉淀，收集上清液；
(8)沉淀收集多糖于上述上清液中加入2 8°C冷却过95%乙醇至最终浓度为A群按体积分数计为80% ；C群、Y群及W135群按体积分数计为75%，充分振摇，待沉淀出现后静置1 2小时；4000rpm离心5分钟收集沉淀；用无水乙醇和丙酮洗涤2次以上，收集多糖沉淀，压缩空气风干；干燥沉淀物即为多糖粗制品；保存在-20°C或以下，待纯化。(9)超滤膜过程去除杂蛋白和内毒素将所述步骤(8)得到的多糖粗制品溶解于 1 / 10饱和中性乙酸钠溶液中，A群使其浓度达15 20mg / ml，C群、Y群和W135群使其浓度达10 15mg / ml ；用截留分子量为6000道尔顿的超滤膜进行超滤，使杂蛋白和内毒素被截留在超滤膜上从而被去除掉，收集超滤液为收获液。所述超滤运行压力为200kPa，超滤膜过程实现了一步法去除杂蛋白和内毒素的效果，因此工艺步骤较少，并且减少了对抗原的破坏。经超滤膜过程处理后A、C群多糖中杂蛋白含量分别< 10mg/g，Y群多糖中杂蛋白含量<35.6mg/g，W135群多糖中杂蛋白含量 < 35. 2mg/g, A、C、Y及W135群多糖内毒素含量分别< 12 EU/μ g，抗原回收率A群多糖 > 65. 2%, C群多糖> 75. 5%, Y及Wl!35群多糖分别> 80%。(10)沉淀精多糖将步骤(10)收集的收获液中加入95%的乙醇至终浓度为A群按体积分数计为80%，C群、Y群及W135群按体积分数计为75%;充分摇勻，置冷库2 8°C 1 小时，4000rpm，10分钟离心收集沉淀物；用无水乙醇和丙酮洗涤2次以上，收集多糖沉淀， 压缩空气风干，干燥沉淀物即为精多糖，保存在-20°C或以下；提取过程在15°C以下进行。 用无菌注射用水溶解精多糖，经除菌过滤后即为原液，要求过滤前后0. 2Mm滤膜完整性试验合格，原液取样后进行检定；
(11)半成品配制合并单批或两批以上的原液后即为半成品，用无菌无热原乳糖和灭菌注射用水稀释至含A群、C群、Y群、W135群多糖分别为100.0yg/ml，乳糖为20mg/ml ；稀释后立即经0. 2μπι过滤，过滤抽样送检，于2 8°C保存；
(12)分装、冻干，制备疫苗成品上述半成品采用洗烘灌联动机组分装，玻璃管制注射剂瓶盛装，分装规格为0. 5ml/瓶，分装过程中自动加卤化丁基橡胶塞，分装完成后，在分装后6小时内冻干；冻干完成即进行真空压塞和轧盖；完成轧盖的制品进行透视检查及贴签；完成贴签的制品即冻干疫苗成品，送2 8°C冷库保存。所述透视检查采用目测法逐瓶透检，剔除脱盖、装量、空瓶、破瓶、异物、萎缩等外观不合格产品。透视检查环境温度不得高于 30°C，检查完成及时进行贴签。采用贴标机进行贴签，每瓶疫苗贴上(ACYW13Q四价脑膜炎球菌多糖疫苗标签1张，完成贴签的制品及时送2 8°C冷库保存待包装。整个透视检查及贴签过程环境温度不得高于30°C。本发明疫苗制备工艺的原液生产收率开启1支工作种子按每100L大罐培养量计可制造出粗制多糖A群16 51g、(群9 四8、￥群2 6g、W1!35群3 9g。本发明疫苗制备工艺每批精多糖的收率=(收得精多糖量)/ (精制前投入的粗多糖量)X 100%，从粗多糖至精多糖的提取纯化过程的收率各群分别为A群35 59%、C群 41 57%、Y 群 35 79%、W135 群 29 77%。实施例2 生产用培养基
上述制备工艺过程使用的培养基如下
生产用种子的制备第1代为10%羊血琼脂培养基，第2代至第3代为改良半综合固体培养基，第4代的生产用种子菌种制备以及第5代的大罐培养为改良半综合液体培养基。生产用的改良半综合液体培养基不含有能与加入的十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成分， 不含有对人体有害或其他过敏原物质。a 10%羊血琼脂培养基
物料名称配方(以IOOml为例计)羊血IOml琼脂培养基IOOml
b改良半综合固体培养基的配方(以IOOOml为例计)见下表
物料名称配方(以IOOOml为例计)50%盐酸酪素水解液或盐酸水解酪蛋白I3OOmg(按总氮计算)2%盐酸酪素水解液I3OOmg(按总氮计算)酵母透析液50ml淀粉5g磷酸二氢钾Ig硫酸镁0.6g葡萄糖2g琼脂26g
c流脑半综合液体培养基的配方(以10000ml为例计)见下表


本发明公开四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺，包括如下步骤选用菌种；种子批的建立及传代；生产疫苗原液；收获及杀菌;去菌体；沉淀、解离；去核酸；沉淀收集多糖；超滤膜过程去除杂蛋白和内毒素；沉淀精多糖；半成品配制；分装、冻干，制备疫苗成品。该制备工艺可以制备得到的四价脑膜炎球菌多糖疫苗为四价疫苗，注射一针即有多种免疫效用；并且该疫苗安全性和各项检定参数都符合标准。