一种仿细胞外层膜结构基因载体及其制备方法【技术领域】，具体涉及一种仿细胞外层膜结构基因载体及其制备方法。[0002]基因治疗是采用正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的，已成为一种治疗各种基因疾病(包括传染病、癌症等)的有效途径。在众多的基因载体中，特别是非病毒基因载体中低毒性的聚阳离子基因载体(Langmuir, 2009, 25(9):5199-5208)备受各国学者的重视，具有重要的学术价值和巨大的应用前景。[0003]壳聚糖具有可降解性、抗菌性、无毒、无刺激、pH响应性等优点(CarbohydratePolymers, 2010, 79(3):724-730),已经被广泛应用于生物医学等领域。壳聚糖是天然聚阳离子，可以和聚阴离子通过静电相互作用，使二者分子链相互缠绕，最终形成纳米级聚集体(Carbohydrate Polymers, 2005, 62 (2): 142-158)。在基因治疗领域，壳聚糖作为聚阳离子，与带负电荷的DNA通过静电相互作用，在负载药物的同时，形成表面带正电荷的纳米颗粒。该纳米颗粒通过减缓DNA降解、失活，黏附细胞膜提高胞吞作用，凭借质子海绵效应逃离内涵体,从而达到提高转染率的目的(Biomacromolecules, 2009, 10(9): 2436-2445)。因此，这类壳聚糖复合聚电解质纳米颗粒已经成为纳米载药体系在基因治疗方面研究的重点之一。 [0004]然而，聚阳离子与DNA形成的聚电解质复合物表面带有部分的正电荷，在体内循环中易吸附蛋白，继而引发血小板、细胞黏附，导致形成血栓和免疫反应(Biomaterials, 2009，30(34): 6655-6664)，易被单核巨噬细胞吞噬，从而降低药效。因此设计稳定的生物相容性纳米材料是药物载体设计的关键课题。[0005]磷酰胆碱(phosphoryIcholine, PC)是组成细胞膜基本单元卵磷脂的亲水端基，是细胞外层膜中的外层官能团，同时带有正、负异种电荷，具有较强的结合水的能力和亲水性能，这种结构和组成的表面与生理环境相互作用不仅不会吸附和沉积蛋白质，也不会引发血小板激活、导致凝血等不良反应，具有良好生物相容性。近几年来的研究表明，采用磷酰胆碱在壳聚糖表面构建具有仿细胞外层膜结构，可以显著改善材料的生物相容性。然而，这些改性方式均是采用磷酰胆碱小分子接枝的途径(Carbohydrate Polymers, 2007, 70(1):82-88;ZL200410054022.2;Biomacromolecules, 2007, 8(10), 3169-3176;Biomacromolecules, 2006, 7(11):3151-3156;Journal of Applied Polymer Science, 2003，88(2):489-493;Polymer International, 2003，52(I):81-85;Journal of biomaterials science, Polymeredition, 2002, 13(5):501-510;Colloids and Surfaces B:Biointerfaces, 2009, 71 (2):268-274)，往往在材料表面的磷酰胆碱基团的密度不高，且接枝改性受基材组成、形状及设备的影响，限制了其在生物医用材料改性领域的应用和生物相容性的进一步提高。[0006]日本 Ishihara 和英国 Lewis 的研究小组(Biomaterials, 2009, 30(28):4930-4938;Biomaterials, 2004, 25(19):4785-4796)对用含有阳离子、中性、阴离子的磷酰胆碱聚合物修饰材料表面的蛋白吸附和细胞粘附进行了研究。结果表明，带电荷的磷酰胆碱类聚合物均可用于改善材料的生物相容性。聚苯乙烯磺酸钠/聚丙烯胺盐酸盐(PSS/PAH)多层膜与最外层带相反电荷的磷酰胆碱类二元随机聚合物通过静电吸附构建的仿细胞外层膜结构涂层，均显著改善了静电自组装涂层表面的蛋白吸附、细胞黏附等生物相容性问题(Langmuir, 2009，25 (6):3610-3617;Soft Matter, 2010，6(7):1503-1512)。[0007]用甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-甲基丙烯酸丁酯二元共聚物(poly (MPC-co-BMA)，PMB30)修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒子表面，可以抑制对蛋白的吸附，使其不易被巨噬细胞吞噬，达到提高药效的作用(智能高分子材料.北京:化学工业出版社，2004，281-282)。张静等人将含有磷酰胆碱基团的随机共聚物制备成了具有仿细胞膜结构纳米胶束(专利申请号:201010192087.9)。Mansouri等人将含有磷酰胆碱基团的壳聚糖自组装体系用于包裹红细胞，有效地避免了红细胞被抗体A识别、溶血，提高了其生物相容性(Langmuir，2009，25(24): 14071-14078)。Goda 等人(Biomaterials, 2010，31 (8): 2380-2387)研究发现表面含有磷酰胆碱聚合物制备的纳米颗粒可以直接穿透细胞膜，为提高药效开辟了新的途径。


[0008]本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种仿细胞外层膜结构基因载体。该仿细胞外层膜结构基因载体由含有两性离子亲水性基团的乙烯基单体、苯胺类单体和聚阳离子通过溶液自由基聚合法制成，对蛋白吸附、血小板黏附明显降低，生物相容性显著提高，从而延长结构基因在体内的循环时间，提高药效。
[0009]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:一种仿细胞外层膜结构基因载体，由单体和聚阳离子通过自由基聚合法制成，其特征在于，所述单体为含有两性离子亲水性基团的乙烯基单体和苯胺类单体；所述聚阳离子为壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸或树枝状聚氨酯；所述苯胺类单体为苯胺或对苯二胺。
[0010]上述的一种仿细胞外层膜结构基因载体，所述乙烯基单体为甲基丙烯酸类、丙烯酸类、甲基丙烯酰胺类或丙烯酰胺类单体。
[0011]上述的一种仿细胞外层膜结构基因载体，所述两性离子亲水性基团为磷酰胆碱基团。
[0012]上述的一种仿细胞外层膜结构基因载体，所述单体的质量为单体和聚阳离子总质量的60%~70% ;所述单体中含有两性离子亲水性基团的乙烯基单体与苯胺类单体的质量比为2~8:1。
[0013]上述的一种仿细胞外层膜结构基因载体，所述含有两性离子亲水性基团的乙烯基单体为甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱，苯胺类单体为苯胺，聚阳离子为壳聚糖。
[0014]另外，本发明还提供了一种制备上述的仿细胞外层膜结构基因载体的方法，其特征在于，该方法为:将聚阳离子溶解于溶剂中，得到聚阳离子溶液；然后向所述聚阳离子溶液中加入单体和引发剂，在氮气保护下进行聚合反应；待聚合反应结束后，对反应体系进行抽滤得到滤液，调节滤液pH值至5.5 后离心，弃去上清，向离心后的固体中加入蒸馏水反复离心分离三次，将反复离心分离后的固体冷冻干燥，得到仿细胞外层膜结构基因载体。
[0015]上述的方法，所述溶剂为体积百分比浓度为1%~5%的醋酸水溶液。
[0016]上述的方法，所述引发剂为过硫酸钾，引发剂的质量为单体和聚阳离子总质量的0.5% ~2%O
[0017]上述的方法，所述聚合反应的反应温度为60V~80°C，反应时间为3h~5h。
[0018]本发明与现有技术相比具有以下优点:
[0019]1、本发明的仿细胞外层膜结构基因载体由含有两性离子亲水性基团的乙烯基单体、苯胺类单体和聚阳离子通过溶液自由基聚合法制成，对蛋白吸附、血小板黏附明显降低，生物相容性显著提高，从而延长结构基因在体内的循环时间，提高药效。
[0020]2、本发明的仿细胞外层膜结构基因载体的粒径较小，约为300nm~600nm。
[0021]3、本发明的仿细胞外层膜结构基因载体表面Zeta电位较高，可显著提高其对DNA的负载能力。
[0022]4、本发明的仿细胞外层膜结构基因载体的制备方法简单、条件温和，为获得表面具有仿细胞外层膜结构的基因载体体系提供了一种新的途径。
[0023]5、本发明的仿细胞外层膜结构基因载体在组织工程、药物控释、基因治疗及生物传感器等领域具有巨大的学术价值和广阔的应用前景。
[0024]下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细说明。



[0025]图1为本发 明实施例1制备的仿细胞外层膜结构基因载体的粒径分布图。
[0026]图2为pH值对本发明实施例1制备的仿细胞外层膜结构基因载体平均粒径的影响。
[0027]图3为pH值对本发明实施例1制备的仿细胞外层膜结构基因载体表面Zeta电位的影响。

[0028]MPC可按文献报道的方法(Polymer Journal, 1990, 22(5):355-360;Colloids andSurfaces B:Biointerfaces, 2011, 85 (I):48-55)合成。苯胺(AN)等均可从国内生产公司购买或Sigma公司购买。
[0029]实施例1
[0030]本实施例的仿细胞外层膜结构基因载体，由2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)、苯胺和树枝状聚氨酯通过自由基聚合法制成，其中单体(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和苯胺)的质量为单体和聚阳离子(树枝状聚氨酯)总质量的60%，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱与苯胺的质量比为2:1。
[0031]本实施例的制备方法为:将0.1g树枝状聚氨酯溶解于50mL体积百分比浓度为1%的醋酸水溶液中，搅拌24h，得到树枝状聚氨酯溶液；然后向树枝状聚氨酯溶液中加入
0.1g2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)、0.05g苯胺和5mg的过硫酸钾(K2S2O8, KPS)，在氮气保护下，温度为70°C的条件下聚合反应4h ;待聚合反应结束后，用G3漏斗对反应体系进行抽滤得到滤液，调节滤液pH值至5.5后在2°C~4°C、9000rpm条件下离心10min,弃去上清，向离心后的固体中加入蒸馏水反复离心分离三次，将反复离心分离后的固体在_50°C下冷冻干燥，得到仿细胞外层膜结构基因载体，其粒径范围约为380nm~600nm。
[0032]本实施例的仿细胞外层膜结构基因载体对蛋白吸附、血小板黏附明显降低，生物相容性显著提高，从而延长基因载体在体内的循环时间，提高药效，在组织工程、药物控释、基因治疗及生物传感器等领域具有巨大的学术价值和广阔的应用前景。
[0033]实施例2
[0034]本实施例的仿细胞外层膜结构基因载体，由2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)、苯胺和壳聚糖通过自由基聚合法制成，其中单体(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和苯胺)的质量为单体和聚阳离子(壳聚糖)总质量的65%，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱与苯胺的质量比为4:1。
[0035]本实施例的制备方法为:将0.35g壳聚糖溶解于50mL体积百分比浓度为5%的醋酸水溶液中，搅拌24h，得到壳聚糖溶液；然后向壳聚糖溶液中加入0.52g2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、0.13g苯胺和0.02g的过硫酸钾(K2S2O8, KPS)，在氮气保护下，温度为80°C的条件下聚合反应3h ;待聚合反应结束后，用G3漏斗对反应体系进行抽滤得到滤液，调节滤液pH值至5.5后在2°C~4°C、9000rpm条件下离心10min,弃去上清，向离心后的固体中加入蒸馏水反复离心分离三次，将反复离心分离后的固体在_50°C下冷冻干燥，得到仿细胞外层膜结构基因载体，其粒径范围约为300nm~500nm。
[0036]本实施例的仿细胞外层膜结构基因载体对蛋白吸附、血小板黏附明显降低，生物相容性显著提高，从而延长基因载体在体内的循环时间，提高药效，在组织工程、药物控释、基因治疗及生物传感器等领域具有巨大的学术价值和广阔的应用前景。
[0037]实施例3
[0038]本实施例的仿细胞外层膜结构基因载体，由2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)、苯胺和壳聚糖通过自由基聚合法制成，其中单体(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和苯胺)的质量为单体和聚阳离子(壳聚糖)总质量的70%，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱与苯胺的质量比为6:1。
[0039]本实施例的制备方法为:将0.3g壳聚糖溶解于50mL体积百分比浓度为3%的醋酸水溶液中，搅拌12h，得到壳聚糖溶液；然后向壳聚糖溶液中加入0.6g2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)、0.1g苯胺和5mg的过硫酸钾(K2S2O8, KPS)，在氮气保护下，温度为70°C的条件下聚合反应3h ;待聚合反应结束后，用G3漏斗对反应体系进行抽滤得到滤液，调节滤液pH值至5.5后在2°C~4°C、9000rpm条件下离心10min,弃去上清，向离心后的固体中加入蒸馏水反复离心分离三次，将反复离心分离后的固体在_50°C下冷冻干燥，得到仿细胞外层膜结构基因载体，其粒径范围约为400nm~600nm。
[0040]本实施例的仿细胞外层膜结构基因载体对蛋白吸附、血小板黏附明显降低，生物相容性显著提高，从而延长基因载体在体内的循环时间，提高药效，在组织工程、药物控释、基因治疗及生物传感器等领域具有巨大的学术价值和广阔的应用前景。
[0041]实施例4
[0042]本实施例的仿细胞外层膜结构基因载体，由丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、苯胺和聚赖氨酸通过自由基聚合法制成，其中单体(丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和苯胺)的质量为单体和聚阳离子(聚赖氨酸)总质量的60%，丙烯酰氧乙基磷酰胆碱与苯胺的质量比为2:1。
[0043]本实施例的制备方法为:将0.2g聚赖氨酸溶解于50mL体积百分比浓度为1%的醋酸水溶液中，搅拌15h，得到聚赖氨酸溶液；然后向聚赖氨酸溶液中加入0.2g丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、0.1g苯胺和5mg的过硫酸钾(K2S2O8, KPS)，在氮气保护下，温度为60°C的条件下聚合反应5h ;待聚合反应结束后，用G3漏斗对反应体系进行抽滤得到滤液，调节滤液pH值至5.5后在2°C~4°C、9000rpm条件下离心10min,弃去上清，向离心后的固体中加入蒸懼水反复离心分离三次，将反复离心分离后的固体在_50°C下冷冻干燥，得到仿细胞外层膜结构基因载体，其粒径范围约为400nm~550nm。
[0044]本实施例的仿细胞外层膜结构基因载体对蛋白吸附、血小板黏附明显降低，生物相容性显著提高，从而延长基因载体在体内的循环时间，提高药效，在组织工程、药物控释、基因治疗及生物传感器等领域具有巨大的学术价值和广阔的应用前景。
[0045]实施例5[0046]本实施例的仿细胞外层膜结构基因载体，由2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)、对苯二胺和聚乙烯亚胺通过自由基聚合法制成，其中单体(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和对苯二胺)的质量为单体和聚阳离子(聚乙烯亚胺)总质量的63%，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱与对苯二胺的质量比为8:1。
[0047]本实施例的制备方法为:将0.37g聚乙烯亚胺溶解于50mL体积百分比浓度为3 %的醋酸水溶液中，搅拌2 4 h，得到聚乙烯亚胺溶液；然后向聚乙烯亚胺溶液中加入
0.56g2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、0.07g对苯二胺和0.02g的过硫酸钾(K2S2O8,KPS)，在氮气保护下，温度为70°C的条件下聚合反应4h ;待聚合反应结束后，用G3漏斗对反应体系进行抽滤得到滤液，调节滤液pH值至5.5后在2°C~4°C、9000rpm条件下离心10min,弃去上清，向离心后的固体中加入蒸馏水反复离心分离三次，将反复离心分离后的固体在_50°C下冷冻干燥，得到仿细胞外层膜结构基因载体，其粒径范围约为400nm~600nm。
[0048]本实施例的仿细胞外层膜结构基因载体对蛋白吸附、血小板黏附明显降低，生物相容性显著提高，从而延长基因载体在体内的循环时间，提高药效，在组织工程、药物控释、基因治疗及生物传感器等领域具有巨大的学术价值和广阔的应用前景。
[0049]实施例6
[0050]本实施例的仿细胞外层膜结构基因载体，由2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)、对苯二胺和壳聚糖通过自由基聚合法制成，其中单体(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和对苯二胺)的质量为单体和聚阳离子(壳聚糖)总质量的70%，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱与对苯二胺的质量比为6:1。
[0051]本实施例的制备方法为:将0.3g壳聚糖溶解于50mL体积百分比浓度为5%的醋酸水溶液中，搅拌20h，得到壳聚糖溶液；然后向壳聚糖溶液中加入0.6g2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、0.1g对苯二胺和0.01g的过硫酸钾(K2S2O8, KPS)，在氮气保护下，温度为80°C的条件下聚合反应3h ;待聚合反应结束后，用G3漏斗对反应体系进行抽滤得到滤液，调节滤液pH值至5.5后在2°C~4°C、9000rpm条件下离心10min,弃去上清，向离心后的固体中加入蒸馏水反复离心分离三次，将反复离心分离后的固体在_50°C下冷冻干燥，得到仿细胞外层膜结构基因载体，其粒径范围约为290nm~500nm。
[0052]本实施例的仿细胞外层膜结构基因载体对蛋白吸附、血小板黏附明显降低，生物相容性显著提高，从而延长基因载体在体内的循环时间，提高药效，在组织工程、药物控释、基因治疗及生物传感器等领域具有巨大的学术价值和广阔的应用前景。
[0053]对本发明实施例1至实施例6制备的仿细胞外层膜结构基因载体的粒径分布进行检测，结果见图1，从图中可以看出，本发明的仿细胞外层膜结构基因载体的粒径较小，约为300nm ~GOOnm。
[0054]在不同pH条件下，对本发明实施例1制备的仿细胞外层膜结构基因载体的粒径和Zeta电位进行检测，结果分别见图2和图3。从图2可以看出，仿细胞外层膜结构基因载体的粒径随pH值的升高逐渐降低,但仍维持在300nm~600nm范围内。从图3中可以看出，在酸性条件下，仿细胞外层膜结构基因载体保持较高的Zeta电位，Zeta电位最高可达42mV，在pH=4.5的条件下，其Zeta电位达到38mV左右，明显高于申请号为201210415034.8，发明名称为“具有仿细胞外层膜结构的纳米颗粒及其制备方法”的专利申请的Zeta电位。
[0055]将申请号为201210415034.8，发明名称为“具有仿细胞外层膜结构的纳米颗粒及其制备方法”的专利申请的实施例1制备的纳米颗粒与本发明实施例1至实施例6制备的基因载体分别配制成等浓度的PH值为4.5的溶液，用动态光散射仪在25.(TC下测试溶液的Zeta电位，取15次测定的平均值，结果见下表:
[0056]表1纳米颗粒和基因载体表面的Zeta电位(pH=4.5)
[0057]