专利名称：一种直投式枯草芽孢杆菌发酵剂及其制备方法直投式发酵剂是指一系列高度浓缩和标准化的冷冻干燥发酵剂菌种，可直接加入热处理的原料进行发酵，而无需对其进行活化、扩培等其他预处理工作。目前直投式枯草芽孢杆菌发酵剂的应用国内外未见报道。
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种操作简单、活菌含量很高， 活力高，接种量小的直投式枯草芽孢杆菌发酵剂及其制备方法。本发明实现目的的技术方案如下一种直投式枯草芽孢杆菌发酵剂的制备方法，包括枯草芽孢杆菌种子培养、枯草芽孢杆菌高密度放大培养、菌体浓缩、加入保护剂、冷冻干燥法制备菌体发酵剂，最后得到直投式枯草芽孢杆菌发酵剂，所述枯草芽孢杆菌种子培养及高密度放大培养的培养基重量百分比为蔗糖2，豆粕1，磷酸二氢钾0. 1，硫酸镁0. 05，加水至100%, ρΗ7· 0-7. 2，冷冻干燥法制备菌体发酵剂浓缩条件为离心转速5000r/min，离心lOmin，离心温度为4°C，所采用的保护剂为含有5%麦芽糊精、4%蔗糖、0. 8%海藻糖和0. 2%吐温的水溶液。而且，所述枯草芽孢杆菌的名称为TK-1，分类名称Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCC No. 4731，保藏日期2011年4月2日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。而且，所述种子培养条件为37士 1°C进行培养，培养时间为20h。而且，所述直投式枯草芽孢杆菌发酵剂中枯草芽孢杆菌的存活率为95. 3%，活菌数为 2. 69X1010cfu/go而且，所述直投式枯草芽孢杆菌发酵剂按1%。的接种量应用于液态发酵，最高活菌数为 1. 03X1010cfu/mLo而且，直投式枯草芽孢杆菌发酵剂按1%。的接种量应用于固态发酵，最高活菌数为 0. 985X 1010cfu/go一种直投式枯草芽孢杆菌发酵剂，其特征在于包括冻干保护剂和枯草芽孢杆菌， 所述冻干保护剂为5%麦芽糊精、4%蔗糖、0. 8%海藻糖、0. 2%吐温。而且，所述枯草芽孢杆菌的名称为TK-1，分类名称Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCC No. 4731，保藏日期2011年4月2日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的优点和积极效果是1、本发明中枯草芽孢杆菌TK-I菌株通过补料分批发酵高密度放大培养后，采用冷冻干燥法制备菌体发酵剂，用本方法生产的直投式枯草芽孢杆菌发酵剂的存活率为 95.3%，活菌数为2. 69X101(lCfU/g，按照1%。的接种量便可达到理想的液态和固态发酵效^ ο2、本发明首次采用冷冻干燥法制备直投式枯草芽孢杆菌发酵剂，与原液态种子接种相比，发酵剂接种量小，直接使用，节约劳动力，缩短生产周期，又可有效地防止菌种污染及退化；保存管理方便，产品品质稳定等优势。3、本发明确定了枯草芽孢杆菌在浓缩过程中采用离心转速5000r/min，4°C下离心 lOmin，离心得率为98. 83%。4、本发明确定了菌体冷冻干燥过程中保护剂为5%麦芽糊精、4%蔗糖、0. 8%海藻糖、0. 2%吐温，最终枯草芽孢杆菌冻干存活率为93%，活菌数为2. 69X 101(lCfU/g。5、采用本发明方法制备的直投式枯草芽孢杆菌发酵剂按1%。的接种量应用于液态发酵，最高活菌数为ι. 03X IOltlCfuAiL,采用本发明方法制备的直投式枯草芽孢杆菌发酵剂按1%。的接种量应用于固态发酵，最高活菌数为0. 985X101(lCfU/g。6、本发明制备的枯草芽孢杆菌发酵剂具有以下优点活菌含量很高，活力高，因而接种量小；能直接使用，避免了繁冗的扩大培养过程，既节约劳动力，缩短生产周期，又可有效地防止菌种污染及退化；保存管理方便；易于控制生产工艺，产品品质稳定；经简单复水处理后可直接作为种子菌株应用。图1为本发明进行菌体收集时间对发酵剂活菌数的影响；图2为冻干保护剂对发酵剂活菌数的影响，注1号10%麦芽糊精；2号10%蔗糖；3号10%海藻糖；4号10%吐温；5号5%麦芽糖+5%蔗糖；6号5%麦芽糊精+4%蔗糖 +0. 8 %海藻糖+0. 2 %吐温；7号5 %麦芽糊精+4 %蔗糖+1 %吐温；8号5 %麦芽糊精+4 %蔗糖+1%海藻糖；图3为枯草芽孢杆菌发酵剂与发酵液接种在液态培养基的效果比较。图4为枯草芽孢杆菌发酵剂与发酵液接种在固态培养基的效果比较。4.菌种收集菌种收集是整个工艺关键的一步，目前较为合适的方法是采用高速离心机进行离心分离然后进行真空冷冻干燥，它可以完全适应工业化生产要求，所以大都采用离心和真空干燥冷冻干燥的办法。5.菌体保护剂的选择在收集了大量的枯草芽孢杆菌菌体后必须添加菌种保护剂以使枯草芽孢杆菌免受外界有害因素的损伤。添加保护剂可以有效地提高枯草芽孢杆菌的存活率、存活时间、以及保持枯草芽孢杆菌原有的特性。6.冷冻干燥将收集的菌体与保护剂进行充分混合后进行预冻，预冻温度控制在_20°C -30°C，预冻时间随菌体量表面积而定，干燥温度大都在-20°C -30°C之间，干燥后的发酵剂水分含量低于3%为宜。7.测定活菌数—般采用平板计数法，操作步骤为称取制备好的发酵剂lg，溶于9ml的无菌生理盐水中，摇勻后用移液枪取Iml的菌液加进另一个9ml的无菌生理盐水中，进行稀释，依次做十倍梯度稀释。稀释完后，用移液枪分别取合适的稀释度Iml打进平板，倒入培养基混勻，依次做三个平行，放进38 V培养箱倒置静置培养。8.发酵剂的包装发酵剂活菌数需大于101(lCfU/g，最终粉末制剂产品必须进行真空封口包装，并于低温保藏，保质期大约为la。以下是对直投式枯草芽孢杆菌制备剂的生产方法的一些参数的确定，以及一些培养条件的优化。直投式枯草芽孢杆菌发酵剂制备条件的筛选1.枯草芽孢杆菌菌种收集时间的确定细菌生长分别经历了延滞期、对数生长期、平衡期和衰退期，在不同时期，生长情况不同，分别对其取样进行活菌计数。筛选实例一液态发酵培养基蔗糖2g，豆粕lg，磷酸氢二钾0. Ig,硫酸镁0. 05g, pH7. 0 7. 2 接种与培养条件接种量5% (v/w)，培养温度37士 1°C，培养时间18h。测得的活菌数为 3. 01X1010cfu/mL·筛选实例二液态发酵培养基蔗糖2g，豆粕lg，磷酸二氢钾0. Ig,硫酸镁0. 05g, pH7. 0 7. 2 接种与培养条件接种量5% (v/w)，培养温度37士 1°C，培养时间20h。测得的活菌数为 3. 43X1010cfu/mL·筛选实例三液态发酵培养基蔗糖2g，豆粕lg，磷酸二氢钾0. Ig,硫酸镁0. 05g, pH7. 0 7. 2接种与培养条件接种量5% (v/w)，培养温度37士 1°C，培养时间22h。测得的活菌数为 3. 36X1010cfu/mL·结果
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液态种子发酵液的最适培养时间为20h(见附图1)。2.液体菌剂收集时的离心转速与时间的确定将增菌培养后的枯草芽孢杆菌通过离心机收集的液体菌剂，离心时的转数和时间对菌体的影响较大，同等条件下，随着离心转数的增加，离心后菌的存活率降低，筛选实例1将发酵好的菌体液，在4000r/min的条件下，离心lOmin，离心前活菌数 3. 43X101QCfu/ml，离心后沉降液中活菌数为3. 25X 101(lCfu/ml，离心后沉降液菌体存活率为 94. 75%。筛选实例2将发酵好的菌体液，在4000r/min的条件下，离心15min，离心前活菌数 3. 43X101QCfu/ml，离心后沉降液中活菌数为3. 34X 101(lCfu/ml，离心后沉降液菌体存活率为 97. 38%。筛选实例3将发酵好的菌体液，在5000r/min的条件下，离心lOmin，离心前活菌数 3. 43X101QCfu/ml，离心后沉降液中活菌数为3. 39X 101(lCfu/ml，离心后沉降液菌体存活率为 98. 83%。结果离心的最适条件为5000r/min，离心时间为IOmin (见表1)。3.冻干保护剂的确定以下提及的保护剂的浓度均为对应物质的水溶液的重量百分比浓度。将菌体与灭好的冻干保护剂混勻后，使其完全冻结，然后进行真空冷冻干燥。须对样品进行预冻，本研究预冻的温度_25°C -30°C，预冻时间4hr，冻结厚度为0. 5mm,再进行冷冻干燥，条件为冷井温度_30°C、板温50°C、冻干时间20h。筛选实例1将菌体与冻干保护剂按一定比例混合，条件如上述，冻干保护剂成分为10%麦芽糊精，测得冷冻存活率为51. 3 %，冻干存活率为46. 1%，冻干粉活菌数为0. 83X1010cfu/go筛选实例2将菌体与冻干保护剂按一定比例混合，条件如上述，冻干剂保护成分为5%麦芽糊精、4%蔗糖、海藻糖，测得冷冻存活率为90. 1%，冻干存活率88.7%，冻干粉活菌数为 1. 22X1010cfu/go筛选实例3将菌体与冻干保护剂按一定比例混合，条件如上述，冻干剂保护成分为5%麦芽糊精、4%蔗糖、0.8%海藻糖、0.2%吐温，测得冷冻存活率为89.6%，冻干存活率为 88.4%，冻干粉活菌数为2. 69X1010cfu/go结果应采用的冻干剂保护成分为5%麦芽糊精、4%蔗糖、0.8%海藻糖、0.2%吐温 (见附图2)。结论本实验采用此方法生产直投式枯草芽孢杆菌发酵剂，此发酵剂含菌量高，活力强，活菌数达到2. 69X101QCfU/g。4.枯草芽孢杆菌发酵剂在液态发酵中的应用
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筛选实例1将枯草芽孢杆菌发酵剂加入已灭菌的0. 85%生理盐水中，常温复水20min，然后按0.1%的接种量接入灭过菌的液态发酵培养基，组成(％)蔗糖2，豆粕1，磷酸氢二钾 0. 1，硫酸镁0. 05，pH7.0 7.2，在37°C条件下进行发酵培养18h，测活菌数，测得活菌数为 9. 96X 109cfu/mL。筛选实例2将经液体活化后的枯草芽孢杆菌按5%的接种量接入灭过菌的液态发酵培养基， 组成(％)蔗糖2，豆粕1，磷酸氢二钾0. 1，硫酸镁0.05，pH7.0 7.2，在37°C条件下进行发酵培养18h，测活菌数。测得活菌数为8.53 X 109cfu/mL。结果使用直投式地衣芽胞杆菌发酵剂按接种量0. 与接种量5%液体接种于液态发酵培养基中对比，最高活菌数分别为1. 03X 101(lCfu/mL和0. 903X 109Cfu/mL(附图3)。明显降低接种量，并可达到更好的发酵效果。五、直投式枯草芽孢杆菌发酵剂在固态发酵中的应用筛选实例1将枯草芽孢杆菌发酵剂加入已灭菌的0. 85%生理盐水中，常温复水20min，然后按0. 的接种接入灭过菌的以豆粕为主的固态发酵培养基，组成豆粕麸皮玉米粉 =3:1: 1，在37°C恒温培养箱静置培养18h，测活菌数。测得活菌数为8.21 X 109cfu/g。筛选实例2将经液体活化后的枯草芽孢杆菌按5% (v/w)的接种量接入灭过菌的以豆粕为主的固态发酵培养基，组成豆粕麸皮玉米粉=3 1 1，在37°C恒温培养箱静置培养 18h，测活菌数。测得活菌数为7.4X 109cfu/g。结果使用直投式枯草芽孢杆菌发酵剂按接种量0. 与接种量5%液体接种于固态发酵培养基中对比，最高活菌数分别为9. 85X 109cfu/g和8. 43X 109cfu/g(附图4)。发酵剂接种后菌体存在约12h的迟滞期，而后生长快速，最终发酵效果理想，可明显降低接种量。结论通过对直投式枯草芽孢杆菌发酵剂生产工艺的研究，枯草芽孢杆菌浓缩采用最终枯草芽孢杆菌存活率达93.2%，发酵剂的活菌数为2. 69X101(lCfU/g，按1%。的接种量便可达到理想的液态或固态发酵效果，最高活菌数分别为1. 03X1010cfu/mL,9. 85X 109cfu/g。表1本发明离心时间与转速对发酵剂活菌数的影响


本发明涉及一种直投式枯草芽孢杆菌发酵剂及其制备方法，包括枯草芽孢杆菌种子培养、枯草芽孢杆菌高密度放大培养、冷冻干燥法制备菌体发酵剂，最后得到直投式枯草芽孢杆菌发酵剂，所述枯草芽孢杆菌种子培养及高密度放大培养的培养基重量百分比为蔗糖2，豆粕1，磷酸二氢钾0.1，硫酸镁0.05，加水至100％，pH7.0-7.2。冷冻干燥法制备菌体发酵剂浓缩条件为离心转速5000r/min，离心10min，离心温度为4℃，冻干保护剂为5％麦芽糊精、4％蔗糖、0.8％海藻糖、0.2％吐温。用本方法生产的直投式枯草芽孢杆菌发酵剂的存活率为95.3％，活菌数为2.69×1010cfu/g，按照1‰的接种量便可达到理想的液态和固态发酵效果。基于本菌株开发了一种新型高活性的直投式枯草芽孢杆菌发酵剂的制备方法应用于枯草芽孢杆菌相关产品的液态发酵和固态发酵。