专利名称：3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与2-莰醇组合物的新应用的制作方法右旋龙脑又称为(+) -2-莰醇，左旋龙脑又称为(_) -2-莰醇。H. Nakazawa等研究了依达拉奉在心肌缺血再灌注损伤的应用(Free RadicalResearch, 1996,24(5),361-367)。CN1015M352公开了依达拉奉与冰片组合物以及所述组合物在治疗缺血性脑血管病中的应用，但该文献未公开依达拉奉与龙脑组合物在心血管疾病治疗中的应用。本发明发现依达拉奉和龙脑的组合物可以更加有效的预防和治疗心肌缺血再灌注损伤，可以在较少的使用量达到良好的治疗效果。
本发明的目的是提供一种依达拉奉与龙脑药物组合物在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。优选地，将上述药物组合物用于制备预防和治疗心肌梗塞、冠心病、心绞痛、心脏血栓药物中的应用。所述依达拉奉与龙脑药物组合物配合使用时具有协同作用，可以提高使用效果。本发明中依达拉奉与龙脑的质量比为20 1 1 4，优选为10 1 1 2，更优选的为8 1 1 1。进一步的优选质量比选自8 1或7 1或6 1或17 3或 21 4或 5 1 或4 1 或 19 6或3 1 或 18 7 或7 3 或 17 8 或2 1 或13 7或16 9或3 2或14 11或11 9或13 12或1 1 ；更加进一步的优选为选自8 1或7: 1或6: 1或5: 1或4: 1或3: 1或2: 1或1 1。更加进一步的优选为4 1。本发明中所述的龙脑可以选自天然冰片、艾片和合成龙脑。优选使用天然冰片。本发明中所述的龙脑还可以使用经过纯化的2-莰醇，所述的2-莰醇的纯度不低于96. 0%，优选地为不低于98. 0%，更优选地为不低于99. 0%。本发明中所述的经过纯化的2-莰醇优选单一构型的(+)-2-莰醇或(-)-2-莰醇。所述的(+)-2-莰醇的纯度不低于96.0%，优选地为不低于98.0%，更优选地为不低于99.0%。所述的(-)-2-莰醇的纯度不低于96.0%，优选地为不低于98.0%，更优选地为不低于99. 0%。本发明中所述的龙脑最优选的为纯度不低于99.0%的(+)-2-莰醇。上述的药物组合物中还可以含有溶剂，可以使得依达拉奉与龙脑更好地混合。所述溶剂可以选用水溶性有机溶剂、或者水溶性有机溶剂与水的混合物。常用的水溶性有机溶剂主要有醇类溶剂、醚类溶剂、酮类溶剂等。本发明中优选水、水溶性有机溶剂与水的混合物。常用的醇类溶剂有乙醇、异丙醇、乙二醇、丙二醇等；常用的醚类溶剂有乙二醇单乙基醚、乙二醇单丁基醚等；常用的酮类溶剂有丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮。水溶性有机溶剂优选使用丙二醇。本发明中在大鼠心肌缺血再灌注损伤后，分别给予依达拉奉与龙脑组合物、依达拉奉、(+)-2-莰醇、(-)-2-莰醇，均可以通过减少梗死范围、降低TNF-α、IL-I β的含量，对心肌缺血具有保护作用。其中与依达拉奉组、(+)-2-莰醇组、(-)-2-莰醇组相比，依达拉奉与龙脑组合物组能显著减少梗死范围。并且依达拉奉与冰片的组合物相对于单独使用时可以在较低的治疗使用量达到更好的治疗效果。在家兔心肌缺血再灌注损伤后，分别给予依达拉奉与龙脑组合物、依达拉奉、(+)-2-莰醇、(-)-2-莰醇，均可以通过减少梗死范围、升高SOD、降低MDA的含量，对心肌缺血具有保护作用。其中与依达拉奉组、(+)-2-莰醇组、(-)-2-莰醇组相比，依达拉奉与龙脑组合物组能显著减少梗死范围。并且依达拉奉与冰片的组合物相对于单独使用时可以在较低的治疗使用量达到更好的治疗效果。下面以实施例的方式对本发明作进一步说明，给出本发明的实施细节，但是并不是旨在限定本发明的保护范围。称取938mg依达拉奉和3iang(+)-2-莰醇，溶于80ml 1，2_丙二醇，加入注射用水稀释至1L，得到浓度为1. 25mg/ml的依达拉奉龙脑复方注射液Fl。称取750mg依达拉奉和250mg(+)-2-莰醇，溶于80ml 1，2-丙二醇，加入注射用水稀释至1L，得到浓度为lmg/ml的依达拉奉龙脑复方注射液F2。称取750mg依达拉奉和250mg(+)-2-莰醇，溶于80ml 1，2-丙二醇，加入注射用水稀释至0. 5L，得到浓度为2mg/ml的依达拉奉龙脑复方注射液F3。称取833mg依达拉奉和417mg(+)-2-莰醇，溶于80ml 1，2-丙二醇，加入注射用水稀释至1L，得到浓度为1. 25mg/ml的依达拉奉龙脑复方注射液Gl。称取667mg依达拉奉和33;3mg(+)-2-莰醇，溶于80ml 1，2-丙二醇，加入注射用水稀释至1L，得到浓度为lmg/ml的依达拉奉龙脑复方注射液G2。称取667mg依达拉奉和33;3mg(+)-2-莰醇，溶于80ml 1，2-丙二醇，加入注射用水稀释至0. 5L，得到浓度为2mg/ml的依达拉奉龙脑复方注射液G3。称取625mg依达拉奉和625mg(+)-2-莰醇，溶于80ml 1，2-丙二醇，加入注射用水稀释至1L，得到浓度为1. 25mg/ml的依达拉奉龙脑复方注射液Hl。称取500mg依达拉奉和500mg(+)-2-莰醇，溶于80ml 1，2-丙二醇，加入注射用水稀释至1L，得到浓度为lmg/ml的依达拉奉龙脑复方注射液H2。称取500mg依达拉奉和500mg(+)-2-莰醇，溶于80ml 1，2_丙二醇，加入注射用水稀释至0. 5L，得到浓度为2mg/ml的依达拉奉龙脑复方注射液H3。(+)-2-莰醇注射液称取500mg (+)-2-莰醇，溶于80ml 1，2_丙二醇，加入注射用水稀释至1L，得到浓度为0. 5mg/ml的(+)-2-莰醇注射液。(-)-2-莰醇注射液称取500mg (-)-2-莰醇，溶于80ml 1，2_丙二醇，加入注射用水稀释至1L，得到浓度为0. 5mg/ml的(-)-2-莰醇注射液。依达拉奉注射液为市售产品(商品名必存，规格10mg/5mL，南京先声东元制药有限公司生产)。实施例2大鼠心肌缺血再灌注实验2. 1大鼠心肌缺血再灌注模型的制备SD大鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)于普通级环境检疫，体重280g-300g,以戊巴比妥腹腔注射麻醉(30mg/kg)，仰位固定，以标准II导联监测动物心电图；切开气管，插入气管插管，接动物人工呼吸机行人工呼吸(90次/min，呼吸比值(115 1)。于左侧第4 5肋间开胸，破开心包膜，暴露心脏，除1组外其他各组均于冠状动脉前降支根部穿线(3/8弧带针缝合线，0/3尼龙线)，备结扎用；穿线后稳定lOmin，将两个细塑料环套入结扎线的两端(与血管并行)，结扎(无sT段及T波改变者淘汰)，30min后，解开结扎线，使前降支实现再灌注；缝合胸壁，恢复自然呼吸。再灌注后Ih后终止实验。尾静脉建立静脉通路给药，再灌注后立即给药，假手术组、模型组给予0. 2ml/kg生理盐水，其余组分别尾静脉注射给予指定的注射液。缺血的标志为sT段抬高和R波增高，左室发绀。再灌的标志为以sT段下降> 1/2，发绀区变红为再灌注成功标志。有下列情况之一的大鼠将退出实验(1)当灌注染色后，缺血质量(AAR)不足心脏重的15% ;(幻结扎冠状动脉失败或未发现再灌注者；(3)过度出血并致血压下降者；(4)呼吸心跳停止超过30s者。2. 2实验过程SD大鼠制备心肌缺血模型后，将动物机率均等单盲分配至各组，每组10只。所有组于再灌注后立即尾静脉注射给药1次，共给药1次。实验过程中记录心电图，再灌注后1小时，经颈静脉取血，离心分离血清，应用ELISA法检测IL-I β，放免法检测血浆TNF-a，均按试剂盒要求进行检测。肿瘤坏死因子(TNF-a)试剂盒南京建成生物工程研究所；白介素-1 β试剂盒南京建成生物工程研究所。尔后处死大鼠，取出心脏，生理盐水洗去余血，沿冠状沟剪去心房及大血管，沿心脏结扎线以下横切6片，置于0. N-BT液中，37°C恒温水裕染色15min正常心肌为暗蓝色，梗死心肌不着色，用刀片切下染色区，剩下的为梗死区，称量梗死区心肌质量和未梗死区心肌质量，计算梗死区心肌占全心脏质量百分率。统计学处理用SPSS 10. 0软件包进行统计学分析，数据用(χ士SD)表示，组间比较应用方差分析。2. 3大鼠实验结果1实验分为假手术组、模型组、依达拉奉龙脑复方注射液Dl组(0. 75mg/kg,下文简称复方依达拉奉注射液组)、依达拉奉注射液组(3. Omg/kg)、(+)-2-莰醇组(0. 4mg/kg)。对心肌梗死范围的影响各给药组全心脏的重量与模型组比较无显著差异(P >0. 05)；假手术组各动物心肌染色后未见明显梗塞区；模型组心肌梗塞区占全心脏重的百分比(33. 18士4. 87)% ；复方依达拉奉注射液组、依达拉奉注射液组及(+)-2-莰醇组梗塞程度明显减轻，梗塞区重占全心脏的百分比与模型组比较均有显著性差异(P < 0. 05)，以复方依达拉奉注射液组为优(P < 0. 01)，见表1。对血清中TNF-a、IL-I β的影响放免法检测血浆TNF_a含量的结果显示，模型组TNF-a数值较假手术组升高，各给药组给药后均有不同程度的降低，但无统计学差异。模型组IL-I β含量较假手术组升高，各给药组给药后均有有不同程度的下降，其中以复方依达拉奉注射液组为优(P < 0. 01)，见表2。2. 4大鼠实验结果2实验分为假手术组、模型组、复方依达拉奉注射液组(0. 75mg/kg)、依达拉奉注射液组(3. Omg/kg)、(-)-2-莰醇组(0. 4mg/kg)。对心肌梗死范围的影响各给药组全心脏的重量与模型组比较无显著差异(P >0. 05)；假手术组各动物心肌染色后未见明显梗塞区；模型组心肌梗塞区占全心脏重的百分比(35. 48士6. 87)% ；复方依达拉奉注射液组、依达拉奉注射液组及(_)_2_莰醇组梗塞程度明显减轻，梗塞区重占全心脏的百分比与模型组比较均有显著性差异(P < 0. 05)，以复方依达拉奉注射液组为优(P < 0. 01)，见表3。对血清中TNF-a、IL-I β的影响放免法检测血浆TNF_a含量的结果显示，模型组TNF-a数值较假手术组升高，各给药组给药后均有不同程度的降低，但无统计学差异。模型组IL-I β含量较假手术组升高，各给药组给药后均有有不同程度的下降，其中以复方依达拉奉注射液组为优(P < 0. 01)，见表4。实施例3家兔心肌缺血再灌注实验3. 1家兔心肌缺血再灌注模型的制备家兔(上海斯莱克实验动物有限责任公司)于普通级环境检疫，体重2. 2 3. 0kg，雌雄兼用，以1.5%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉(30mg/kg)，仰位固定，以标准II导联监测动物心电图；切开气管，插入气管插管，接动物人工呼吸机行人工呼吸(90次/min，呼吸比值(115 1)。于左侧第4 5肋间开胸，破开心包膜，暴露心脏，除1组外其他各组均于冠状动脉前降支根部穿线(3/8弧带针缝合线，0/3尼龙线)，备结扎用；穿线后稳定lOmin，将两个细塑料环套入结扎线的两端(与血管并行)，结扎(无sT段及T波改变者淘汰)，30min后，解开结扎线，使前降支实现再灌注；缝合胸壁，恢复自然呼吸。再灌注后Ih后终止实验。耳缘静脉建立静脉通路给药，再灌注后立即给药，假手术组、模型组给予0. 2ml/kg生理盐水，其余组分别耳缘静脉注射给予指定的注射液。缺血的标志为sT段抬高和R波增高，左室发绀。再灌的标志为以sT段下降> 1/2，发绀区变红为再灌注成功标志。有下列情况之一的动物将退出实验(1)当灌注染色后，缺血质量(AAR)不足心脏重的15% ； (2)结扎冠状动脉失败或未发现再灌注者；(3)过度出血并致血压下降者；呼吸心跳停止超过30s者。3. 2实验过程家兔制备心肌缺血模型后，将动物机率均等单盲分配至各组，每组6只。所有组于再灌注后立即耳缘静脉注射给药1次，共给药1次。实验过程中记录心电图，再灌注后1小时，经股静脉取血，离心分离血清，测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的含量，均按试剂盒要求进行检测。超氧化物歧化试剂盒南京建成生物工程研究所；丙二醛试剂盒南京建成生物工程研究所。尔后处死家兔，取出心脏，生理盐水洗去余血，沿冠状沟剪去心房及大血管，将心室称重，然后将心肌切成若干片，每片厚度0. 4cm左右，置于0. 1 % N-BT液中，37°C恒温水裕染色15min正常心肌为暗蓝色，梗死心肌不着色，用刀片切下染色区，剩下的为梗死区，称量梗死区心肌质量，计算梗死区心肌占全心脏质量百分率。统计学处理用SPSS 10. 0软件包进行统计学分析，数据用(i ±SD)表示，组间比较应用方差分析。3. 3家兔实验结果1实验分为假手术组、模型组、复方依达拉奉注射液组(0. 75mg/kg)、依达拉奉注射液组(3. Omg/kg)、(+)-2-莰醇组(0. 4mg/kg)。对心肌梗死范围的影响假手术组各动物心肌染色后未见明显梗塞区；模型组心肌梗塞区占全心脏重的百分比(32. 3士2. 1) % ；复方依达拉奉注射液组、依达拉奉注射液组及(+)-2-莰醇组梗塞程度明显减轻，梗塞区重占全心脏的百分比与模型组比较均有显著性差异(P < 0. 05)，以复方依达拉奉注射液组为优(P < 0. 01)，见表5。对血清中SOD、MDA的影响结果显示，模型组SOD数值较假手术组降低，各给药组给药后均有不同程度的降低(P <0.05)。模型组MDA含量较假手术组升高，各给药组给药后均有有不同程度的升高，其中以复方依达拉奉注射液组为优(P <0.01)，见表6。3. 4家兔实验结果2实验分为、假手术组、模型组、复方依达拉奉注射液组(0. 75mg/kg)、依达拉奉注射液组(3. Omg/kg)、(-)-2-莰醇组(0. 4mg/kg)。对心肌梗死范围的影响假手术组各动物心肌染色后未见明显梗塞区；模型组心肌梗塞区占全心脏重的百分比(31. 7士3. 1) % ；复方依达拉奉注射液组、依达拉奉注射液组及(+)-2-莰醇组梗塞程度明显减轻，梗塞区重占全心脏的百分比与模型组比较均有显著性差异(P < 0. 05)，以复方依达拉奉注射液组为优(P < 0. 01)，见表7。对血清中S0D、MDA的影响结果显示，模型组SOD数值较假手术组降低，各给药组给药后均有不同程度的降低(P <0.05)。模型组MDA含量较假手术组升高，各给药组给药后均有有不同程度的升高，其中以复方依达拉奉注射液组为优(P <0.01)，见表8。表1复方依达拉奉注射液对心肌梗死范围的影响(i±SD)
本发明涉及依达拉奉与龙脑药物组合物在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。