专利名称：C－吡唑a的制作方法图1为本发明化合物18在离体大鼠灌注心脏中产生的A1腺苷受体(AdoR)-介导的负性变传导(AV传导时间)作用和A2AAdoR-介导的血管扩张(增加冠脉传导)作用的浓度反应曲线。符号和误差线代表分别由四个心脏测定得到结果的平均值±SEM。EC50(效力)为化合物18引起50％最大反应的浓度；图2为本发明化合物18在离体猪灌注心脏中产生的A1腺苷受体(AdoR)-介导的负性变传导(AV传导时间)作用和A2AAdoR-介导的血管扩张(增加冠脉传导)作用的浓度反应曲线。符号和误差线代表分别由四个心脏测定得到结果的平均值±SEM。EC50(效力)为化合物18引起50％最大反应的浓度；并且图3为CVT510(A1腺苷受体激动剂)和本发明化合物18(A2A腺苷受体激动剂)在离体大鼠灌注心脏中产生的对房室(AV)传导时间的效应图。现有实施方案的描述本发明化合物包括下式2-腺苷C-吡唑化合物 其中R1为-CH2OH，和-C(＝O)NR5R6；R2选自氢、C1-15烷基、C2-15链烯基、C2-15链炔基、杂环基、芳基和杂芳基，其中烷基、链烯基、链炔基、芳基、杂环基和杂芳基是由1-3个取代基可任选地取代，所述取代基独立地选自卤素、NO2、杂环基、芳基、杂芳基、CF3、CN、OR20、SR20、N(R20)2、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、SO2NR20COR22、SO2NR20CO2R22、SO2NR20CON(R20)2、N(R20)2NR20COR22、NR20CO2R22、NR20CON(R20)2、NR20C(NR20)NHR23、COR20、CO2R20、CON(R20)2、CONR20SO2R22、NR20SO2R22、SO2NR20CO2R22、OCONR20SO2R22、OC(O)R20、C(O)OCH2OC(O)R20和OCON(R20)2并且其中各可任选的杂芳基、芳基和杂环基取代基是由取代基可任选地取代，所述取代基选自卤素、NO2、烷基、CF3、氨基、一或二烷基氨基、烷基或芳基或杂芳基酰胺、NCOR22、NR20SO2R22、COR20、CO2R20、CON(R20)2、NR20CON(R20)2、OC(O)R20、OC(O)N(R20)2、SR20、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、CN或OR20；R3和R4独立地选自氢、C1-15烷基、C2-15链烯基、C2-15链炔基、杂环基、芳基和杂芳基、卤素、NO2、CF3、CN、OR20、SR20、N(R20)2、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、SO2NR20COR22、SO2NR20CO2R22、SO2NR20CON(R20)2、N(R20)2NR20COR22、NR20CO2R22、NR20CON(R20)2、NR20C(NR20)NHR22、COR20、CO2R20、CON(R20)2、CONR20SO2R22、NR20SO2R22、SO2NR20CO2R22、OCONR20SO2R22、OC(O)R20、C(O)OCH2OC(O)R20和OCON(R20)2，其中烷基、链烯基、链炔基、芳基、杂环基和杂芳基取代基是由1-3个取代基可任选地取代，所述取代基独立地选自卤素、NO2、杂环基、芳基、杂芳基、CF3、CN、OR20、SR20、N(R20)2、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、SO2NR20COR22、SO2NR20CO2R22、SO2NR20CON(R20)2、N(R20)2NR20COR22、NR20CO2R22、NR20CON(R20)2、NR20C(NR20)NHR22、COR20、CO2R20、CON(R20)2、CONR20SO2R22、NR20SO2R22、SO2NR20CO2R22、OCONR20SO2R22、OC(O)R20、C(O)OCH2OC(O)R20和OCON(R20)2，并且其中各可任选的杂芳基、芳基和杂环基取代基是由取代基可任选地取代，所述取代基选自卤素、NO2、烷基、CF3、氨基、一或二烷基氨基、烷基或芳基或杂芳基酰胺、NCOR22、NR20SO2R22、COR20、CO2R20、CON(R20)2、NR20CON(R20)2、OC(O)R20、OC(O)N(R20)2、SR20、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、CN或OR20；R5和R6各独立地为氢、由1-2个取代基取代的C1-15烷基，所述取代基独立地选自卤素、NO2、杂环基、芳基、杂芳基、CF3、CN、OR20、SR20、N(R20)2、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、SO2NR20COR22、SO2NR20CO2R22、SO2NR20CON(R20)2、N(R20)2NR20COR22、NR20CO2R22、NR20CON(R20)2、NR20C(NR20)NHR23、COR20、CO2R20、CON(R20)2、CONR20SO2R22、NR20SO2R22、SO2NR20CO2R22、OCONR20SO2R22、OC(O)R20、C(O)OCH2OC(O)R20和OCON(R20)2，并且其中各可任选的杂芳基、芳基和杂环基取代基是由取代基可任选地取代，所述取代基选自卤素、NO2、烷基、CF3、氨基、一或二烷基氨基、烷基或芳基或杂芳基酰胺、NCOR22、NR20SO2R22、COR20、CO2R20、CON(R20)2、NR20CON(R20)2、OC(O)R20、OC(O)N(R20)2、SR20、S(O)22、SO2R22、SO2N(R20)2、CN或OR20；R20选自H、C1-15烷基、C2-15链烯基、C2-15链炔基、杂环基、芳基和杂芳基，其中烷基、链烯基、链炔基、杂环基、芳基和杂芳基取代基是由1-3个取代基可任选地取代，所述取代基独立地选自卤素、烷基、一或二烷基氨基、烷基或芳基或杂芳基酰胺、CN、O-C1-6烷基、CF3、芳基和杂芳基；并且R22选自C1-15烷基、C2-15链烯基、C2-15链炔基、杂环基、芳基和杂芳基，其中烷基、链烯基、链炔基、杂环基、芳基和杂芳基取代基是由1-3个取代基可任选地取代，所述取代基独立地选自卤素、烷基、一或二烷基氨基、烷基或芳基或杂芳基酰胺、CN、O-C1-6烷基、CF3和杂芳基；并且，其中R1＝CH2OH，R3为H，R4为H，吡唑环通过C4连接，并且R2不为H。当所述化合物选自下式化合物时 优选地R1为-CH2OH；R2选自氢、C1-8烷基，其中烷基为由一个独立地选自芳基、CF3、CN的取代基可任选地取代的，并且其中各可任选的芳基取代基是由卤素、烷基、CF3或CN可任选地取代的；R3和R4各独立地选自氢、甲基并且更优选地R3和R4各为氢。当所述化合物选自下式化合物时 优选地R1为-CH2OH；R2选自氢和由苯基可任选地取代的C1-8烷基。更优选地，R2选自苄基和戊烷基；R3选自氢、C1-6烷基、芳基，其中烷基和芳基取代基是由1-2独立地选自卤素、芳基、CF3、CN的取代基可任选地取代的，并且其中各可任选的芳基取代基是由卤素、烷基、CF3或CN可任选地取代的；R4选自氢和C1-6烷基，并且更优选地，R4选自氢和甲基。最优选地，本发明化合物选自(4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-苄基吡唑-4-基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇，(4S，2R，3R，5R)-2-[6-氨基-2-(1-戊基吡唑-4-基]嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇，(4S，2R，3R，5R)-2-[6-氨基-2-[1-甲基吡唑-4-基]嘌呤-9-基]-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇，(4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-(甲基乙基)吡唑-4-基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇，(4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-(3-苯基丙基)吡唑-4-基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇，(4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-(4-叔丁基苄基)吡唑-4-基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇，(4S，2R，3R，5R)-2-(6-氨基-2-吡唑-4-基嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇，(4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-戊-4-烯基吡唑-4-基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇，(4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-癸基吡唑-4-基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇，(4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-(环己基甲基)吡唑-4-基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇，(4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-(2-苯基乙基)吡唑-4-基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇，(4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-(3-环己基丙基)吡唑-4-基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇，(4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-(2-环己基乙基)吡唑-4-基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇及其混合物。下列定义适用于本文所使用的术语。独立的或组合的“卤”或“卤素”是指卤素，即氯(Cl)、氟(F)、溴(Br)、碘(I)。
“羟基”是指基团-OH。
“巯基”是指基团-SH。
独立的或组合的“烷基”是指链烷烃衍生的含1-20，优选1-15个碳原子(除非特别定义)的基团。所述烷基是直链烷基、支链烷基或环烷基。优选包含1-15，更优选1-8，甚至更优选1-6，还更优选1-4并且最优选1-2个碳原子的直链或支链烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基等。本文使用术语“低级烷基”来描述上述直链烷基。优选地，环烷基为每个环上含有3-8，更优选3-6个环成员的单环、二环或三环系统，如环丙基、环戊基、环己基、金刚烷基等。烷基也包括含有环烷基或由环烷基部分间断的直链或支链烷基。直链或支链烷基可在任何有效点连接以便产生稳定的化合物。其实例包括但不限制于4-(异丙基)-环己基乙基或2-甲基-环丙基戊基。取代的烷基为先前定义的、独立地由1-3个取代基取代的直链烷基、支链烷基或环烷基，其中所述取代基选自卤素、羟基、烷氧基、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、酰氧基、芳氧基、杂芳氧基、由烷基、芳基或杂芳基可任选地一取代或二取代的氨基、脒基、由烷基、芳基、杂芳基或制剂可任选地取代的脲、由烷基、芳基或杂芳基N-一取代或N，N-二取代的氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基等。
单独或组合的“链烯基”是指含有2-20，优选2-17，更优选2-10，甚至更优选2-8，最优选2-4个碳原子并且至少含有一个，优选1-3，更优选1-2，最优选一个碳碳双键的直链、支链或环状烃。在环烷基情况下，一个以上碳碳双键共轭不能为该环提供芳香性。碳碳双键也可以包含在环烷基部分中，环丙基除外，或包含在直链或支链部分中。链烯基的实例包括乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、环己烯基、环己烯基烷基等。取代的链烯基为先前定义的、独立地由1-3个取代基取代的直链链烯基、支链链烯基或环烯基，其中所述取代基选自卤素、羟基、烷氧基、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、酰氧基、芳氧基、杂芳氧基、由烷基、芳基或杂芳基可任选地一取代或二取代的氨基、脒基、由烷基、芳基、杂芳基或杂环基可任选地取代的脲、可任选地由烷基、芳基或杂芳基N-一取代或N，N-二取代的氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基、羧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基等，这些取代基可在任何有效点连接以便产生稳定的化合物。
单独的或组合的“链炔基”是指含有2-20，优选2-17，更优选2-10，甚至更优选2-8，最优选2-4个碳原子并且至少含有一个，优选1一个碳碳三键的直链或支链烃。链炔基的实例包括乙炔基、丙炔基、丁炔基等。取代的链炔基是指先前定义的、独立地由1-3个取代基取代的直链链炔基或支链链炔基，其中所述取代基选自卤素、羟基、烷氧基、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、酰氧基、芳氧基、杂芳氧基、可任选地由烷基、芳基或杂芳基一取代或二取代的氨基、脒基、可任选地由烷基、芳基、杂芳基或杂环基取代的脲、可任选地由烷基、芳基或杂芳基N-一取代或N，N-二取代的氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基等，这些取代基可在任何有效点连接以便产生稳定的化合物。
“烷基链烯基”是指基团-R-CR’＝CR’’’R’’’’，其中R为低级烷基或取代的低级烷基，R’、 R’’’、R’’’’可以独立地为氢、卤素、低级烷基、取代的低级烷基、下文所定义的酰基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。
“烷基链炔基”是指基团-RC≡CR’，其中R为低级烷基或取代的低级烷基，R’为氢、低级烷基、取代的低级烷基、下文所定义的酰基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。
“烷氧基”是指基团OR，其中R为低级烷基、取代的低级烷基、下文所定义的酰基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、杂烷基、杂芳烷基、环烷基、取代的环烷基、环杂烷基或取代的环杂烷基。
“烷硫基”是指基团-S(O)n＝1-2-R，其中R为低级烷基、取代的低级烷基、本文所定义的芳基、取代的芳基、芳烷基、或取代的芳烷基。
“酰基”是指基团-C(O)R，其中R为氢、低级烷基、取代的低级烷基、本文所定义的芳基、取代的芳基等。
“芳氧基”是指基团-OAr，其中Ar为本文所定义的芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。
“氨基”是指基团NRR’，其中R和R’可以独立地为氢、低级烷基、取代的低级烷基、本文所定义的芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基或酰基。
“酰氨基”是指-C(O)NRR’，其中R和R’可以独立地为氢、低级烷基、取代的低级烷基、本文所定义的芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基。
“羧基”是指基团-C(O)OR，其中R为氢、低级烷基、取代的低级烷基、本文所定义的单一的芳基、杂芳基和取代的杂芳基。
单独的或组合的“芳基”是指未稠合的或由优选含有5-7，更优选5-6个环成员的环烷基稠合的和/或由1-3个取代基可任选地取代苯基或萘基，其中所述取代基选自卤素、羟基、烷氧基、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、酰氧基、芳氧基、杂芳氧基、可任选地由烷基、芳基或杂芳基一取代或二取代的氨基、脒基、可任选地由烷基、芳基、杂芳基或杂环基取代的脲、可任选地由烷基、芳基或杂芳基N-一取代或N，N-二取代的氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基等。
“取代的芳基”是指可任选地由一个或多个官能团取代的芳基，其中所述官能团选自卤素、低级烷基、低级烷氧基、烷硫基、双亚乙基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等。
“杂环基”是指具有单环(例如吗啉基、吡啶基或呋喃基)或多个稠合环(例如萘基吡啶基、喹喔啉基、喹啉基、吲嗪基或苯并[b]噻吩基)并且环内至少具有一个杂原子如N、O或S的饱和的、不饱和的或芳族碳环基团，该基团可以是由取代基可任选地取代，所述取代基选自卤素、低级烷基、低级烷氧基、烷硫基、双亚乙基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等。
单独的或组合的“杂芳基”是指含有一个或多个，优选1-3，甚至更优选1-2个独立地选自O、S和N杂原子并且是由1-3个取代基可任选地取代具有5或6个环原子的单环芳族环结构，或具有8-10个环原子的二环芳族基团，所述取代基选自卤素、羟基、烷氧基、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、酰氧基、芳氧基、杂芳氧基、可任选地由烷基、芳基或杂芳基一取代或二取代的氨基、脒基、可任选地由烷基、芳基、杂芳基或杂环基取代的脲、可任选地由烷基、芳基或杂芳基N-一取代或N，N-二取代的氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基等。杂芳基也包含氧化的S或N，如亚磺酰基、磺酰基和环上叔氮的N-氧化物。碳或氮原子是杂芳环结构的连接点，这样可以保留稳定的芳环。杂芳基的实例为吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、喹唑啉基、嘌呤基、吲哚基、喹啉基、嘧啶基、吡咯基、恶唑基、噻唑基、噻吩基、异恶唑基、氧杂噻二唑基、异噻唑基、四唑基、咪唑基、三嗪基、呋喃基、苯并呋喃基、吲哚基等。取代的杂芳基包含在有效的碳或氮上连接以便产生稳定化合物的取代基。
单独的或组合的“杂环基”是指具有5-10个原子的，环上的1-3个碳原子被O、S或N取代的，并且是未稠合或与苯稠合的或者与具有5-6个环成员的杂芳基稠合的和/或如环烷基中所述是未取代或取代的非芳族环烷基。杂芳基也包含氧化的S或N，如亚磺酰基、磺酰基和环上叔氮的N-氧化物。连接点在碳或氮原子上。杂环基的实例为四氢呋喃基、二氢吡啶基、哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基、二氢苯并呋喃基、二氢吲哚基等。取代的杂环基包含在有效的碳或氮上连接以便产生稳定化合物的取代基。
“取代的杂芳基”是指可任选地由一个或多个官能团一取代或多取代的杂环，所述官能团选自卤素、低级烷基、低级烷氧基、烷硫基、双亚乙基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等。
“芳烷基”是指基团-R-Ar，其中Ar为芳基并且R为低级烷基或取代的低级烷基。芳基可以是由取代基可任选地取代所述取代基的卤素、低级烷基、烷氧基、烷硫基、双亚乙基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等。
“杂烷基”是指基团-R-Het，其中Het为杂环基并且R为低级烷基。杂烷基可以是由取代基可任选地取代，所述取代基选自卤素、低级烷基、低级烷氧基、烷硫基、双亚乙基、氨基、酰氨基、羧基、芳基、芳氧基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等。
“杂芳基烷基”是指基团-R-HetAr，其中Ar为杂芳基并且R为低级烷基或取代的低级烷基。杂芳基烷基可以是由取代基可任选地取代，所述取代基选自卤素、低级烷基、取代的低级烷基、烷氧基、烷硫基、双亚乙基、芳基、芳氧基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等。
“环烷基”是指含有3-15个碳原子的二价环或多环烷基。
“取代的环烷基”是指包含一个或多个取代基的环烷基，所述取代基选自卤素、低级烷基、取代的低级烷基、烷氧基、烷硫基、双亚乙基、芳基、芳氧基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等。
“环杂烷基”是指其中一个或多个环上碳原子被杂原子(例如N、O或S)取代的环烷基。
“取代的环杂烷基”是指本文所定义的包含一个或多个取代基的环杂烷基，所述取代基选自卤素、低级烷基、低级烷氧基、烷硫基、双亚乙基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等。
“烷基环烷基”是指基团-R-环烷基，其中环烷基为为环烷基并且R为低级烷基或取代的低级烷基。环烷基可以是由取代基可任选地取代，所述取代基选自卤素、低级烷基、低级烷氧基、烷硫基、双亚乙基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等。
“烷基环杂烷基”是指基团-R-环杂烷基，其中R为低级烷基或取代的低级烷基。环杂烷基可以是由取代基可任选地取代，所述取代基选自卤素、低级烷基、低级烷氧基、烷硫基、氨基、酰氨基、羧基、双亚乙基、羟基、芳基、芳氧基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等。
本发明化合物可如合成方案1-5所述制备。通式II化合物
可通过钯介导的化合物1与式VIII表示的卤代-吡唑在铜盐存在或不存在下偶联(合成方案4)(K.Kato等人，J.Org.Chem.1997，62，6833-6841；Palladium Reagents and Catalysts-Innovations in Organic Synthesis，Tsuji，John Wiley and Sons，1995)，然后用TBAF或NH4F脱保护(Markiewica等人，Tetrahedron Lett.(1988)，29，1561)制备。化合物1的制备先前已经描述过(K.Kato等人，J.Org.Chem.1997，62，6833-6841)并且在合成方案5中描述。
通式VI化合物可如合成方案2所述制备。II与2，2-二甲氧基丙烷在酸存在下反应得到的化合物III合成方案2
可用高锰酸钾或氯铬酸吡啶翁等氧化为羧酸IV(以结构上类似的化合物为基础)(Jones等人，J.Am.Chem.Soc.(1949)，71，3994；Hudlicky，Oxidations in organic chemistry，American Chemical Society，Washington D.C.，1990)，得到化合物IV。式NHR5R6伯胺或仲胺和化合物IV可通过使用DCC(Fujino等人，Chem.Pharm.Bull.(1974)，22，1857)，PyBOP(J.Martinez等人，J.Med.Chem.(1988)，28，1967或PyBrop(J.Caste等人，Tetrahedron，(1991)，32，1967)偶联条件反应，得到化合物V。化合物V的脱保护可通过与80％乙酸水溶液(T.W.Green and P.G.M.Wuts，(1991)，Protective Group in Organic Synthesis，A，Wiley-Interscience publication)或与无水HCl(4N)一起加热进行，得到通式VI化合物。
合成方案3
或者，通式II化合物也可以通过合成方案3所示的Suzuki偶联反应制备。2-碘腺苷6可按照文献方法，从鸟苷开始经过4步反应制备(M.J.Robins等人，Can.J.Chem.(1981)，59，2601-2607；J.F.Cerster等人，Org.Synthesisi，---242-243；V.Nair等人，J.Org.Chem.，(1988)，53，3051-3057)。钯介导的6与适宜取代的吡唑-硼酸XVII在碱存在下进行Suzuki偶联反应可提供通式II最终化合物(A.Suzuki，Acc.Chem.Res(1982)，15，178)。如果需要，在6上的2’，3’，5’羟基可在Suzuki偶联前保护为TBDMS醚。
通式VIII化合物可通过商业渠道获得或按照合成方案4所示的步骤制备。式IX 1，3-二酮化合物与肼在适宜的溶剂中缩合可提供通式X吡唑(R.H.Wiley等人，Org.Synthesis，Coll.Vol IV(1963)，351)。这些吡唑可用各种烷基卤进行N-烷基化，得到式XI化合物，该化合物碘化后得到通式VIII 4-碘衍生物(R.Huttel等人，Justus Liebigs Ann.Chem.(1955)，593，200)。
合成方案4 通式XV 5-碘吡唑可按照合成方案5所述的步骤制备。
合成方案5 式XII 1，3-二酮化合物与肼在适宜的溶剂中缩合可提供通式XIII吡唑。这些吡唑可用各种烷基卤进行N-烷基化，得到式XIV化合物。用强碱夺取5-H，然后用碘中止反应，得到通式XV 5-碘衍生物(F.Effenberger等人，J.Org.Chem.(1984)，49，4687)。
4-或5-碘吡唑可如合成方案6所示转化为相应的硼酸。用n-buLi进行金属转移，然后用硼酸三甲酯处理可得到通式XVI化合物，该化合物水合成方案6 解可提供通式XVII硼酸(F.C.Fischer等人，RECUEIL(1965)，84，439)。
2-甲锡烷基腺苷1可按照文献方法，从通过商业渠道获得的6-氯嘌呤核苷开始，经过3步反应制备(K.Kato等人，J.Org.Chem.(1997)，62，6833-6841)。Tri TBDMS衍生物可通过在DMF中用TBDMSCl和咪唑处理8得到。用LTMP锂化，然后用氯化正丁基锡中止反应，得到单一的2-甲锡烷基衍生物10。在2-丙醇中氨解得到2-甲锡烷基腺苷1。1与1-苄基-4-碘吡唑在Pd(PPh3)4和CuI存在下进行Stille偶联得到11(K.Kato等人，J.Org.Chem.(1997)，62，6833-6841)。将2′，3′和5′羟基上的甲硅烷基在甲醇中用0.5M氟化铵脱保护，得到较高收率的12(合成方案7)。化合物18-23用类似的方法制备。用于制备本发明化合物的方法不受上述方法限制。其他方法可在下列原始资料中发现并且引入本供参考(J.March，AdvancedOrganic Chemistry；Reaction Mechanisms and Studies(1992)，A WileyInterscience Publications；and J.Tsuji，Palladium reagents andcatalysts-Innovations in organic synthesis，John Wiley and Sons，1995)。
合成分案7
本发明化合物与放射性显像剂联合使用使冠脉活动显像。与心房和AV结中的腺苷A1受体和/或外周血管中的A2B受体截然不同，本发明化合物是确信在冠脉血管中特异性激活血管A2A受体的A2A激动剂，因此避免了不需要的副作用。当给予治疗量时，本发明化合物引起冠脉血管扩张，诱导冠脉窃血，其中健康的冠脉血管从非健康的血管窃血，导致心脏组织血流不足。通过冠脉显像来确定具有健康和不健康血流的冠脉区域。较低剂量的A2A激动剂可以在慢性CAD治疗中提供有益的冠脉血管扩张(不太严重)。
与A2A激动剂一样，本发明化合物也用于血管成形术的辅助治疗以便引起扩张，抑制血小板聚集和作为一般的抗炎剂。A2A激动剂如本发明化合物可通过阻止中性白细胞激活提供上述治疗效益(Purinergic Approachesin Experimental Therapeutics K.A. Jacobson and M.F. Jarvis 1997 Wiley，New York)。本发明化合物对血小板和中性白细胞聚集并阻断血管的不再流状况也是有效的。与A2A激动剂一样，本发明化合物通过阻止中性白细胞和血小板激活有效地治疗不再流状况(例如，确信所述化合物可阻止中性白细胞释放过氧化物)。与A2A激动剂一样，本发明化合物通过它们对中性白细胞的抗炎作用也可以用作心脏保护剂。因此，当心脏将经历局部缺血状态如移植时，它们是有用的。
本发明也包括上述A2A激动剂的前药。前药是一种经过化学修饰并且在其作用部位可能是无生物活性的，但可通过一种或多种酶过程或体内过程降解或修饰成生物活性形式的药物。本发明前药应该具有与母化合物不同的药动学特征，因为它能够改善跨粘膜上皮的吸收、是更好的盐制剂和/具有更好的溶解性并且能够改善系统的稳定性。优选地，上述化合物可在一个或多个羟基上进行修饰。所述修饰可以是(1)例如，可以由酯酶或脂肪酶裂开的酯或氨基甲酸酯衍生物；(2)可由特异性或非特异性蛋白酶识别的肽；或(3)通过膜选择作用在作用部位蓄积的衍生物或前药形式或修饰的前药形式，或者上述(1)-(3)的任一组合。
所述组合物可通过口服、静脉内、表皮或本领域已知的给予治疗剂的任何其他方法给予。治疗方法包括给予优选分散在药用载体中的有效量所选择化合物。活性组分的剂量单位通常为0.01-100mg/kg，而且本领域技术人员很容易根据给药途径、病人的年龄和疾病状况确定。典型地，在冠脉显像前大约5分钟至大约1小时或更长时间，给予该剂量的化合物溶液。当给予治疗量本发明化合物时，预期没有任何无法接受的毒理学作用。
如果本发明最终化合物包含碱性基团，可制备酸加成盐。化合物的酸加成盐可按照标准方法，在适宜的溶剂中，由母化合物和过量的酸如盐酸、氢溴酸、流速、磷酸、乙酸、马来酸、琥珀酸或甲磺酸制备。盐酸是特别有用的。如果最终化合物包含酸性基团，可制备阳离子盐。典型地，将母化合物用过量的碱性试剂如包含适宜阳离子的氢氧化物、碳酸盐或醇化物处理。阳离子如Na+、K+、Ca+2和NH4+是可药用盐中存在的阳离子的实例。某些化合物形成内盐或两性离子，它们也可能是适宜的。
包含本发明化合物的药物组合物，和/或其衍生物可以配制成用于非肠道给药的溶液剂或冻干粉剂。粉剂可以在使用前通过加入适宜的稀释剂或其它可药用载体重新配制。如果以液体形式使用，本发明组合物优选地配制成缓冲、等渗的水溶液。适宜的稀释剂的实例为标准的等渗盐溶液、标准的5％葡萄糖水溶液和缓冲的醋酸钠或醋酸铵溶液。所述液体制剂适用于非肠道给药，但也可以用于口服给药。包含本发明化合物的药物组合物中可能需要加入赋形剂如聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟基纤维素、阿拉伯胶、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化钠、枸橼酸钠或本领域技术人员已知的任何其他赋形剂。或者，所述药物组合物可以制备成用于口服给药的胶囊剂、片剂或乳剂或糖浆剂。可以加入可药用固体或液体载体来增强或稳定所述组合物，或促进所述组合物的制备。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水、醇或水。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙、二水合物、teffaalba、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石粉、果胶、阿拉伯胶、琼脂或明胶。所述载体也可以包括持续释放材料如单一的或与蜡混合的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。固体载体的量可以改变，但优选地，每剂量单位含大约20mg至大约1g。药用配料可使用常规技术配制，如通过碾磨、混合、制粒和压片(如果需要)来制备片剂，；或者通过碾磨、混合和填充制备来硬明胶胶囊。当使用液体载体时，所述制剂可以是糖浆剂、酏剂、乳剂或含水或不含水的悬浮液形式。所述液体制剂可以直接给予或填充到软明胶胶囊中。优选地，本发明组合物以溶液剂形式通过口服给予或者通过连续输注或以浓缩药团形式静脉内给予。
下列实施例用于说明本发明。所述实施例并不以任何方式限制本发明范围，而是为了显示如何制备和使用本发明化合物。在实施例中，所有温度为摄氏度。
实施例1 4-碘-1-苄基吡唑(13)在0℃下，向4-碘吡唑(400mg，2mmol)的DMF(4ml)溶液中加入氢化钠(80mg，60％的矿物油分散体，2mmol)，然后加入苄基溴(342mg，2mmol)并将该反应混合物搅拌2小时。将反应混合物真空浓缩，残渣通过柱色谱层析纯化，得到几乎定量收率的N-苄基吡唑。1H NMR 5.29(s，2H)，7.18-7.28(m，2H)，7.28-7.40(m，4H)，7.53(s，1H)。
实施例2 9-{(2R，3R，4R，5R)-3，4-双(1，1，2，2，-四甲基-lsilapropoxy)-5-[(1，1，2，2，-四甲基-1-silapropoxy)甲基]oxolan-2-基}-2-[1-苄基吡唑-4-基]嘌呤-6-基胺(11)将化合物1(50mg，0.056mmol)、N-苄基-4-碘吡唑13(50mg，0.183mmol)、Pd(PPh3)4(20mg(15mol％)和CuI(40mg，0.2mmol)的DMF(1ml)混合物在90℃下搅拌16小时。将反应混合物真空浓缩，残渣通过制备薄层色谱层析(二氯甲烷∶甲醇10∶1)纯化，得到化合物111H NMR(CDCl3)δ0.00(s，3H，CH3)，0.01(s，3H，CH3)，0.04(s，3H，CH3)，0.07(s，3H，CH3)，0.11(s，3H，CH3)，，0.14(s，3H，CH3)，0.78(s，9H，t-bu)，0.83(s，9H，t-bu)，0.91(s，9H，t-bu)，3.80(d，1H)，4.05(d，1H)，4.11-4.12(m，1H)，4.33(d，1H)，4.50-4.52(m，1H)，5.35(m，2H)，5.65(bs，2H，D2O exchangeable)，6.05(d，1H)，7.28-7.40(m，5H)，7.98(s，1H)，8.18(s，1H)，8.22(s，1H)。 9-{(2R，3R，4R，5R)-3，4-双(1，1，2，2，-四甲基-lsilapropoxy)-5-[(1，1，2，2，-四甲基-1-silapropoxy)甲基]oxolan-2-基}-2-[1-戊基吡唑-4-基]嘌呤-6-基胺(14)以制备化合物11的方式制备化合物14，但用4-碘戊基吡唑代替4-碘苄基吡唑，得到化合物141H NMR(CDCl3)0.00(s，3H，CH3)，0.01(s，3H，CH3)，0.04(s，3H，CH3)，0.07(s，3H，CH3)，0.11(s，3H，CH3)，，0.14(s，3H，CH3)，0.78(s，9H，t-bu)，0.80(t，3H)，0.83(s，9H，t-bu)，0.91(s，9H，t-bu)，1.25-1.40(m，4H)，1.85-1.95(m，2H)，3.82(d，1H)，4.08(d，1H)，4.20-4.28(m，3H)，4.32-4.34(m，1H)，4.55-4.57(m，1H)，5.35(m，2H)，5.70(bs，2H，D2O exchangeable)，6.08(d，1H)，7.28-7.40(m，5H)，8.05(s，1H)，8.15(s，1H)，8.20(s，1H)。 9-{(2R，3R，4R，5R)-3，4-双(1，1，2，2，-四甲基-1silapropoxy)-5-[(1，1，2，2，-四甲基-1-silapropoxy)甲基]oxolan-2-基}-2-[1-甲基吡唑-4-基]嘌呤-6-基胺(15)以制备化合物11的方式制备化合物15，但用4-碘甲基吡唑代替4-碘苄基吡唑，得到化合物151H NMR(CDCl3)0.00(s，3H，CH3)，0.01(s，3H，CH3)，0.04(s，3H，CH3)，0.07(s，3H，CH3)，0.11(s，3H，CH3)，0.14(s，3H，CH3)，0.78(s，9H，t-bu)，0.83(s，9H，t-bu)，0.91(s，9H，t-bu)，3.8(d，1H)，3.90(s，3H，N-CH3)4.05(d，1H)，4.08-4.12(m，1H)，4.30-4.32(m，1H)，4.55-4.60(m，1H)，5.60(bs，1H，D2O exchangeable)，6.00-6.05(m，1H)，7.99(s，1H)，8.05(s，1H)，8.15(s，1H) 9-{(2R，3R，4R，5R)-3，4-双(1，1，2，2，-四甲基-lsilapropoxy)-5-[(1，1，2，2，-四甲基-1-silapropoxy)甲基]oxolan-2-基}-2-[1-(1-甲基乙基)吡唑-4-基]嘌呤-6-基胺(16)以制备化合物11的方式制备化合物16，但用4-碘-(1-甲基乙基)吡唑代替4-碘苄基吡唑，得到化合物161H NMR(CDCl3)0.00(s，3H，CH3)，0.01(s，3H，CH3)，0.04(s，3H，CH3)，0.07(s，3H，CH3)，0.11(s，3H，CH3)，，0.14(s，3H，CH3)，0.78(s，9H，t-bu)，0.83(s，9H，t-bu)，0.91(s，9H，t-bu)，1.55(d，6H，C(CH3)2)，3.8(d，1H)，4.05(d，1H)，4.08-4.15(m，1H)，4.30-4.32(m，1H)，4.44-4.56(m，2H)，5.55(bs，1H，D2O exchangeable)，6.05(s，1H)，8.05(s，1H)，8.10(s，1H)，8.2(s，1H) 9-{(2R，3R，4R，5R)-3，4-双(1，1，2，2，-四甲基-1silapropoxy)-5-[(1，1，2，2，-四甲基-1-silapropoxy)甲基]oxolan-2-基}-2-[1-(4-叔丁基苄基)吡唑-4-基]嘌呤-6-基胺(17)以制备化合物11的方式制备化合物17，但用4-碘-(4-叔丁基苄基)吡唑代替4-碘苄基吡唑，得到化合物171H NMR(CDCl3)0.00(s，3H，CH3)，0.01(s，3H，CH3)，0.04(s，3H，CH3)，0.07(s，3H，CH3)，0.11(s，3H，CH3)，，0.14(s，3H，CH3)，0.78(s，9H，t-bu)，0.83(s，9H，t-bu)，0.91(s，9H，t-bu)，1.30(s，9H，t-bu)，3.8(d，1H)，4.05(d，1H)，4.08-4.15(m，1H)，4.30-4.32(d，1H)，4.47-4.49(dd，1H)，5.44(bs，1H，D2O exchangeable)，6.01(d，J＝3.6Hz，1H)，7.2(d，J＝2.0Hz，2H)，7.35(d，J＝2.0Hz，2H)，7.99(s，1H)，8.14(s，1H)，8.20(s，1H)实施例3 (4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-苄基吡唑-4-基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇(12)将在0.5M NH4F甲醇(5ml)溶液中的triTBDMS衍生物溶液(25mg，0.035mmol)回流16小时。将反应混合物浓缩，残渣通过制备TLC(甲醇-二氯甲烷9∶1)纯化得到12；1H NMR(CD3OD)3.65(d，J＝11.2Hz，1H)，3.81(d，J＝11.2Hz，1H)，4.18-4.19(m，1H)，4.26(d，J＝5.2Hz，1H)，4.78(dd，1H)，5.23(s，2H)，5.72(d，J＝7.2 Hz，1H)，7.15-7.17(m，2H)，7.17-7.27(m，3H)，7.80(s，1H)，8.10(s，2H). (4S，2R，3R，5R)-2-[6-氨基-2-(1-戊基吡唑-4-基)嘌呤-9-基]-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇(18)以制备化合物12的方式制备化合物18；1H NMR(CD3OD)4 0.8(t，J＝3.6Hz，3H)，1.20-1.26(m，4H)，1.76-1.80(m，2H)，3.67(d，J＝12.0Hz，1H)，3.85(d，J＝12.0Hz，1H)，4.03(t，J＝7.2Hz，2H)，4.19-4.20(m，1H)，4.28(d，J＝1.2Hz，1H)，4.78(dd，1H)，5.73(d，J＝7.2Hz，1H)，7.80(s，1H)，8.05(s，1H)，8.07(s，1H). (4S，2R，3R，5R)-2-[6-氨基-2-(1-甲基吡唑-4-基)嘌呤-9-基]-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇(19)以制备化合物12的方式制备化合物19；1H NMR(CD3OD)3.60(d，J＝9.2Hz，1H)，3.78(s，3H，N-CH3)，3.80(d，J＝9.2Hz，1H)，4.10-4.12(m，1H)，4.24(d，J＝1.4Hz，1H)，4.78(dd，1H)，5.69(d，J＝7.0Hz，1H)，7.80(s，1H)，7.98(s，1H)，8.01(s，1H). (4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-(甲基乙基)吡唑-4-基)嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇(20)以制备化合物12的方式制备化合物20；1H NMR(CD3OD)1.41(d，J＝6.8Hz，6H)，3.66(d，J＝9.0Hz，1H)，3.80(d，J＝9.0Hz，1H)，4.16-4.18(m，1H)，4.25(d，J＝4.8Hz，1H)，4.40(septet，1H)，4.77(dd，1H)，5.71(d，J＝7.2Hz，1H)，7.80(s，1H)，8.03(s，1H)，8.13(s，1H)。 (4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-(3-苯基丙基)吡唑-4-基)嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇(21)以制备化合物12的方式制备化合物21；1H NMR(CD3OD)2.10(t，J＝6.7Hz，2H，CH2)，2.51(t，J＝6.7Hz，2H，CH2)，3.65(d，J＝9.2Hz，1H)，3.80(d，J＝9.2Hz，1H)，4.04(t，J＝6.7Hz，1H)，4.16-4.17(m，1H)，4.25(d，J＝1.2Hz，1H)，4.79(dd，1H)，5.71(d，J＝7.2Hz，1H)，7.05-7.07(m，2H)，7.16-7.24(m，3H)，7.80(s，1H)，8.06(s，1H)，8.08(s，1H)。 (4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-(4-叔丁基苯基)吡唑-4-基)嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇(22)以制备化合物12的方式制备化合物22；1H NMR(CD3OD)1.15(s，9h，t-bu)3.55(d，J＝11.2Hz，1H)，3.75(d，J＝11.2Hz，1H)，4.18-4.19(m，1H)，4.26(d，J＝5.2Hz，1H)，4.65(dd，1H)，5.12(s，2H)，5.65(d，J＝7.2Hz，1H)，7.05(d，2H)，7.17(d，3H)，7.75(s，1H)，8.05(s，2H)。 (4S，2R，3R，5R)-2-(6-氨基-2-吡唑-4-基嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇(23)以制备化合物12的方式制备化合物23；1H NMR(CD3OD)3.75(d，1H，5`-CH)，3.90(d，1H，，5`-CH)，4.15(d，2H，4`-CH)4.35(m，1H，3`-CH)，4.85(m，1H，2`-CH)，5.95(d，1H，1`-CH)，8.20(s，1H，8-H)，8.25(s，2H，Ar). (4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-戊-4-烯基吡唑-4-基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇(24)以制备化合物12的方式制备化合物24；[MS 402(M+1)] (4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-癸基吡唑-4-基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇(25)以制备化合物12的方式制备化合物25；[MS 430(M+1)] (4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-(环己基甲基)吡唑-4-基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇(26)以制备化合物12的方式制备化合物26；[MS 474(M+1)] (4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-(2-苯基乙基)吡唑-4-基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇(27)以制备化合物12的方式制备化合物27；[MS 438(M+1)] (4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-(3-环己基丙基)吡唑-4-基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇以制备化合物12的方式制备化合物28；[MS 458(M+1)] (4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[1-(2-环己基乙基)吡唑-4-基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇(29)以制备化合物12的方式制备化合物29；[MS 444(M+1)]实施例4测定本发明化合物以确定其与猪纹状体膜制剂中A2A受体的亲和性。简而言之，0.2mg的猪纹状体膜用腺苷脱氨基酶和50mMTris缓冲液(pH＝7.4)处理然后混合。在猪纹状体膜中加入2μL浓度范围在100μM到10nM浓度的本发明化合物系列稀释的DMSO储备溶液或加入2μL只含有DMSO的对照，然后加入氚拮抗剂ZM241385的Tris缓冲液(50mM，pH7.4)，得到2nM的最终浓度。在23℃温度下保温2小时后，用膜收获剂和多次洗涤的膜(3×)过滤溶液。在闪烁液中记录滤板以获得由本发明化合物竞争结合置换的氚代ZM的量。使用超过5点的曲线产生IC50并在下表所表示的栏中显示实验序号。
表1
实施例5本实验的目的是确定本发明化合物与A1、A2A、A2B和A3腺苷受体的亲和性和受体结合的选择性。分子克隆法已经确定并证实存在4个亚型的腺苷受体(AdoRs)，指定为A1、A2A、A2B和A3AdoRs(Linden，1994)。这些AdoRs亚型具有不同的解剖学分布、药理特性和生理功能(Shryock和Belardinelli，1997)。A1和A3AdoRs偶合来抑制G蛋白(Gi/o)并且减少腺苷酰环化酶的活性，而A2A和A2BadoRs通过偶合来刺激G蛋白质(Gs)而增加细胞内cAMP含量。
对不同的腺苷受体亚型具有高效力和组织/器官选择性的配体具有治疗和诊断各种疾病(如心律不齐、局部缺血心脏病、哮喘和帕金森氏病)的能力并且是学术界和工业上努力进行研究的焦点。这里我们报告使用表达内皮AdoRs或重组人AdoRs的哺乳动物细胞系确定的本发明一系列新的腺苷类似物的药理和功能特性。
材料腺苷脱氨酶购自Boehringer Manheim Biochemicals Indianapolis，IN，U.S.A)。[3H]ZM241385(LotNo.1)购自Tocris Cookson Ltd(Langford，Bristol，UK)。[3H]CPX(Lot No.3329207)购自New England Nuclear(Boston，MA，USA)。CGS21680(Lot No.SW-3R-84和89H4607)、NECA(LotNo.OXV-295E)、R-PIA(Lot No.WY-V-23)、Rolipram和HEK-hA2AAR膜从Sigma-RBI(Natick，MA)处获得。WRC-0470按文献(K.Niiya等人，J.Med.Chem.354557-4561(1992))中所述方法来制备。合成本发明化合物18和化合物12并制备成DMSO的储备溶液(10mmol/L)。
细胞培养和膜制备PC12细胞从美国典型物培养中心获得并在具有5％胎牛血清、10％马血清、0.5mmol/L L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素和2.5μg/mL两性霉素的DMEM中生长。稳定表达重组人A2BadoRs(HEK-hA2BAdoR)的HEK-293细胞在补充有10％胎牛血清和0.5mg/mL G-418的DMEM中生长。稳定表达重组人A1adoRs(CHO-hA1AdoR)和A3adoRs(CHO-hA3AdoR)的CHOK1细胞以单层于150-mm塑料培养板上在补充有10％胎牛血清并存在0.5mg/mLG-418的Ham’s F-12介质中生长。细胞在保持37℃下的5％CO2/95％空气的环境下培养。
为了制备膜，将细胞从培养板中分离到冰冷的50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中。细胞悬浮液用设定在4的Polytron匀化30秒并以48000g的转速旋转15分钟。所得团状物通过重新悬浮在冰冷的Tris-HCl缓冲液中并离心来洗涤3次。最终团状物重新悬浮在小体积的Tris-HCl中、等量分装并在-80℃冷冻以备受体结合测定使用。以牛血清作为标准来用Bradford方法(Bio-Rad)确定膜悬浮液的蛋白质浓度。
竞争性结合测定进行竞争性测定来确定下列未标记化合物(竞争剂)的亲和力(Ki)化合物WRC-0470、化合物18、化合物12、NECA、CGS21680和R-PIA对A1AdoRs(CHO-hA1AdoR细胞膜上的[3H]DPCPX结合部位)、A2AAdoRs(PC12和HEK-hA2AAR细胞膜上的[3H]ZM241385结合部位)、A2BAdoRs(HEK-hA2BAdoR细胞膜上的[3H]DPCPX结合部位)和A3AdoR(CHO-hA3AdoR细胞膜上的[125I]ABMECA结合部位)。膜悬浮液在含有ADA(1U/mL)、Gpp(NH)p(100μM)、放射配体{或者[3H]ZM241385(-1.5-5nmol/L)、[3H]DPCPX(对A1为～2.5-3.0nmol/L并且对A23为30nM)或[125I]ABMECA(1nM)}和浓度逐渐增高竞争剂的50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4)中于室温下培养2小时。培养结束时，使用Brandel组织收获器(Gaithersburg，MD)经Whatman GF/C玻璃纤维滤器过滤来分离结合和游离的放射配体。对每个浓度的竞争剂重复测定3次。
研究设计(实验方法)各种CVT化合物对A1和A2A腺苷受体的亲和力(Ki)通过其竞争由CHO-hA1AdoR、PC12或HEK-HA2AAdoR细胞衍生的膜上的[3H]CPX(A1)或[3H]ZM241385(A2A)结合部位的能力来测定。R-PIA和CGS21680(分别是A1和A2A的选择性激动剂)和NECA(非选择性AdoR激动剂)用作对照。为了便于比较和避免因受体与G-蛋白质偶合而并发多个亲和状态，在选化合物对A2B和A3受体的亲和性通过其分别竞争由HEK-HA2BAdoR和CHO-hA3AdoR细胞衍生的膜上的[3H]CPX(A2B)或[125I]ABMECA(A3)结合部位的能力来评价。
这些药物对A2A和A2BAdoRs的功能强弱和选择性通过测定其分别对PC12和HEK-293细胞中A2A或A2B介导的cAMP积累的影响来评价。在这些实验中，CGS21680和NECA用作阳性对照。
结果通过竞争结合研究测定的WRC-0470、化合物18和化合物12对人A1、鼠和人A2AAdoRs的亲和力(Ki)概括在下表2中。除化合物12外，所有化合物都对人A2A与A1受体显示中度的选择性。
表2腺苷受体激动剂对A2AAdoRs和A1AdoRs的结合亲和力Ki/nmol/L(pKi±SEM)
该实验结果显示化合物16是低亲和力的A2A激动剂。
实施例6本实施例的目的是确定本发明化合物12和18对冠状动脉传导作用的药理性特性。具体来说，设计该实验来确定化合物12和18的能力并将其能力与腺苷和其它选择的A2AAdoR激动剂进行比较。
在心脏中，A2A腺苷受体介导由腺苷引起的冠脉血管扩张，而A1受体介导腺苷的心抑制作用，如负性变时性作用和变传导(AV阻滞)作用。
已经合成了A1和A2AAdoRs的一些强效的和选择性配体(包括激动剂和拮抗剂)。已经提出，A1AdoRs激动剂可在心脏中用作抗心律失常药物，而A2AAdoRs激动剂正被开发为选择性冠脉血管扩张剂。
为了开发冠脉血管扩张剂而合成了一系列以选择性激活A2A腺苷受体(A2AAdoR)为靶向的腺苷衍生物。更具体来说，在该研究中我们报告了一系列新的A2AAdoRs激动剂在大鼠和豚鼠离体灌注心脏中对冠状动脉传导力的影响(血管扩张作用)。
材料大鼠(Sprague Dawley)和豚鼠(Hartley)分别购自simonsen和CharlesRivers。WRC-0470按文献(K.Niiya等人，J.Med.Chem.354557-4561(1992))中所述方法来制备。本发明的化合物12和化合物18按上文所述方法来制备。CGS21680(Lot No.89H4607)和腺苷(Lot No.123HO94)购自Sigma。按Standard Methods制备Krebs-Henseleit溶液，并且0.9％盐水购自McGraw，Inc(Lot No.J8B246)。
方法在本研究中使用体重分别为230到260克和300到350克的任性别的成年Sprague Dawley大鼠和Hartley豚鼠。通过腹膜注射含有氯胺酮和甲苯噻嗪(氯胺酮100mg，甲苯噻嗪20mg/ml)的混合液来麻醉动物。打开胸腔并快速取出心脏。在冰冷却的Krebs-Henseleit溶液中简单地漂洗心脏(参见下文)，并在主动脉中插入套管。然后以10ml/分钟的流速用含有NaCl117.9、KCl 4.5、CaCl22.5、MgSO41.18、KH2PO41-18、丙酮酸盐2.0mmol/L的改良的Krebs-Henseleit(K-H)溶液灌注心脏。K-H溶液(pH7.4)连续用95％O2和5％CO2通气并且温热到35±0.50℃。使用放置在左心房上的双极电极使心脏以340ms(250次/分钟)d固定周期作电搏动。电刺激是由Grass刺激器(Model S48，W.Warwick，RI)产生的并且通过Stimuli IsolationUnit(Model SIU5，Astro-Med，Inc.，NY)以3毫秒周期的方形波脉冲和扩大至少两倍阈值强度来传递。
压力转换器通过位于心脏上约3em的T-连接器与主动脉插管连接，用来测量冠脉灌注压(CPP)。在整个实验中监测冠脉灌注压并在图表记录器(Gould Recorder 2200S)或计算机记录系统(PowerLab/4S，AdinstrumentsPty Ltd，澳大利亚)上记录。在研究中仅仅使用CPP在60-85mmHg范围(不存在药物)的心脏。以冠脉灌注速度(10ml/分钟)和冠脉灌注压之比来计算冠脉传导性(ml/分钟/mmHg)。
在实验中，测量了A1腺苷受体介导的负性变传导作用，记录了动脉恒定搏动期间心房和心室表面的电描记图。按以前Jenkins和BelardinelliCirc.Res.6397-116(1988)所描述的方法测定灌注腺苷受体激动剂对房室传导时间的影响。
在购自Aldrich，PS04253MS的二甲基亚砜(DMSO)中制备本发明化合物(5mM)和CGS 21680(5mM)的储备液。在盐水中制备腺苷的储备溶液(1mg/ml)。通过盐水稀释储备溶液产生2×10-4或2×10-5M溶液来产生各个浓度。这些溶液以20μl浓缩药团形式注射到装置的灌注管线中。在某些实验中，将溶液放置在30ml玻璃注射器中并将药物以获得所需灌注液浓度(如，10/100nM等)。需要的速度输入。
A2A腺苷受体激动剂的冠脉血管扩张作用获得本发明化合物(0.1-400nM)和CGS21680(0.1-10nM)增加冠脉传导性作用的量效关系。记录对照的冠脉灌注压后，给予浓度逐渐增加的腺苷受体激动剂直到观察到最大的冠脉血管扩张作用。记录腺苷受体激动剂各个浓度的稳态反应。在该组(每个激动剂需要4-6个心脏)的各个心脏中，仅获得一个激动剂和一个量效关系。
结果在动脉恒定搏动期为340毫秒的离体灌注心脏(n＝36只大鼠和18只豚鼠)中，腺苷、CGS21680、WRC0470和本发明化合物12和18产生浓度依赖性的冠脉传导增加。CGS21680和WRC是该系列中最强的激动剂。化合物12和18在增加冠脉传导方面与腺苷几乎一样强。值得注意的是所有激动剂在大鼠中的冠脉血管扩张作用比在豚鼠心脏中强数倍。
表3腺苷和A2A腺苷受体激动剂在大鼠和豚鼠离体灌注心脏中增加冠脉传导的能力
实施例7本实施例的目的是确定化合物18引起冠脉血管扩张的功能选择性。具体来说，在大鼠和豚鼠心脏中确定了化合物18引起冠脉血管扩张(A2AAdoR反应)的能力和A-V结传导时间的延长作用(A1AdoR反应)。
材料Sprague Dawley大鼠购自simonsen。Hartley豚鼠购自Charles Rivers。化合物18按上文所述方法来制备。按美国专利579416(该文献引入本文供参考)所公开的合成方法来制备CVT-510(2-{6-[((3R)oxolan-3-基)氨基]嘌呤-9-基}(4S，3R，5R)-5-(羟基甲基)oxolane-3，4-二醇)。氯胺酮购自FortDodge Animal Health(Lot No.440444)并且甲苯噻嗪购自Bayer(Lot No.26051A)。按Standard Methods制备Krebs-Henseleit溶液，并且0.9％氯化钠购自McGraw，Inc(Lot No.J8B246)。
离体灌注心脏在本研究中使用体重分别为230到260克和300到350克的任一性别的成年Sprague Dawley大鼠和Hartley豚鼠。通过腹膜注射含有氯胺酮和甲苯噻嗪(氯胺酮100mg，甲苯噻嗪20mg/ml)的混合液来麻醉动物。打开胸腔并快速取出心脏。在冰冷却的Krebs-Henseleit溶液中简单地漂洗心脏(参见下文)，并在主动脉中插入套管。然后以10ml/分钟的流速用含有NaCl117.9、KCl 4.5、CaCl22.5、MgSO41.18、KH2PO41.18、丙酮酸盐2.0mmol/L的改良的Krebs-Henseleit(K-H)溶液灌注心脏。K-H溶液(pH7.4)连续用95％O2和5％CO2通气并且温热到35±0.50℃。使用放置在左心房上的双极电极使心脏以340毫秒(250次/分钟)的固定周期作电搏动。电刺激是由Grass刺激器(Model S48，W.Warwick，RI)产生的并且通过Stimuli IsolationUnit(Model SIU5，Astro-Med，Inc.，NY)以3毫秒周期的方形波脉冲和扩大至少两倍阈值强度来传递。
压力转换器通过位于心脏上约3cm的T-连接器与主动脉插管连接，用来测量冠脉灌注压(CPP)。在整个实验中监测冠脉灌注压并在图表记录器(Gould Recorder 2200S)或计算机记录系统(PowerLab/4S，ADInstrumentsPty Ltd，澳大利亚)上记录。在研究中仅仅使用60-85mmHg(不存在药物)CPP范围的心脏。以冠脉灌注速度(10ml/分钟)和冠脉灌注压之比来计算冠脉传导性(ml/分钟/mmHg)。
测量A1腺苷受体介导的对A-V结传导时间的抑制作用(负性变传导作用)。记录了动脉恒定搏动期间心房和心室表面的电描记图。按以前Jenkins和Belardinelli(1988)所描述的方法测定化合物18对房室传导时间和对His-束的刺激(S-H间隔)的影响。
然后确定化合物18对冠脉传导性(A2A作用)和房室传导时间或对His-束间隔刺激(A1作用)的作用。心脏用仪器连续记录冠脉灌注压(A2A反应)和房室(A-V)传导时间或S-H间隔(A1反应)。在各实验中，确定化合物18对增加冠脉传导性和延长A-V传导时间或S-H间隔的量效关系(n＝5只大鼠，5只豚鼠)。测量对照CPP和A-V传导时间或S-H间隔后，给予浓度逐渐增加的化合物18直到产生最大的冠脉血管扩张作用和A-V结传导时间或S-H间隔延长作用。在离体大鼠心脏(n＝4)中，确定各种浓度(100-400nM)的CVT510(插入化学名称)、A1腺苷激动剂(Snowdy等人1999)对A-V结传导时间的作用并与化合物18(0.1-30μM)进行比较。
化合物18增加冠状动脉传导和延长A-V结传导时间或S-H间隔的量效曲线显示在附图1和2中。在大鼠和豚鼠中，化合物18以浓度依赖性方式增加冠脉传导性。化合物18增加大鼠心脏冠脉传导性的能力(EC50值)是68.9±9.6nM，在豚鼠心脏中是203±22nM。相反地，该激动剂对S-H间隔的作用在大鼠和豚鼠心脏之间有某些改变。在大鼠心脏中，化合物18不延长A-V结传导时间(附图1)，而A1AdoR激动剂CVT510明显延长A-V结传导时间(附图3)。50μM浓度的化合物18不延长豚鼠心脏的S-H间隔(附图2)。
结果表明化合物18在大鼠心脏中是一种无负性变传导作用(A1AdoR介导的作用)的冠脉血管扩张剂(A2AAdoR介导的作用)。在豚鼠心脏中，化合物18不产生负性变传导作用。在两种动物(大鼠和豚鼠)中，化合物在不引起A-V结传导时间延长，即没有负性变传导作用的浓度下产生最大的冠脉血管扩张作用。也观察到化合物18对A2A的亲和力大于A1AdoR(即，＞2-/＞-13-倍)并且对A2AAdoR介导的冠脉血管扩张作用的受体保留明显大于对A1AdoR介导的神经传导阻滞作用的受体保留。
实施例8设计本研究来试验A2A腺苷受体(AdoR)的亲和力(Ki或pKi)和作用持续时间之间有相反关系的假设。具体来说，研究的目的是确定大鼠离体心脏和麻醉猪中由所选择的一系列高和低亲和力的A2AAdoR激动剂引起的冠脉血管扩张作用持续时间和这些激动剂在猪纹状体中与A2AAdoR的亲和力之间的关系。
材料大鼠(Sprague Dawley)购自simonsen。农场猪从Division ofLaboratory Animal Resources，University of Kentucky处获得。本发明化合物12、化合物18、化合物21和化合物13按上文所述方法来制备。按美国专利4956345(该文献引入本文供参考)所述方法来制备YT-0146。WRC-0470按文献(K.Niiya等人，J.Med.Chem.354557-4561(1992))中所述方法来制备。CGS21680购自Research Biochemicals，Inc.和Sigma并且R-PLA(Lot No.WY-V-23)购自Research Biochemicals，Inc.。HENECA由Camerino(Italy)大学的Gloria Cristalli教授馈赠。
麻醉剂氯胺酮购自Fort Dodge Animal Health。甲苯噻嗪购自Bayer。戊巴比妥钠购自Butler Co.处。苯福林购自Sigma。DMSO购自Sigma和美国典型物保藏中心。按常规方法制备Krebs-Henseleit溶液，并且0.9％盐水购自McGraw，Inc。
大鼠离体灌注心脏样本在本研究中使用体重分别为230到260克的任一性别的成年SpragueDawley大鼠。通过腹膜注射含有氯胺酮和甲苯噻嗪(氯胺酮100mg，甲苯噻嗪20mg/ml)的混合液来麻醉动物。打开胸腔并快速取出心脏。在冰冷却的Krebs-Henseleit溶液中简单地漂洗心脏(参见下文)，并在主动脉中插入套管。然后以10ml/分钟的流速用含有NaCl 117.9、KCl 4.5、CaCl22.5、MgSO41.18、KH2PO41.18、丙酮酸盐2.0mmol/L的改良的Krebs-Henseleit(K-H)溶液灌注心脏。K-H溶液(pH7.4)连续用95％O2和5％CO2通气并且温热到35±0.50℃。使用放置在左心房上的双极电极使心脏以340毫秒(250次/分钟)的固定周期作电搏动。电刺激是由Grass刺激器(Model S48，W.Warwick，RI)产生的并且通过Stimuli IsolationUnit(Model SIU5，Astro-Med，Inc.，NY)以3毫秒周期的方形波脉冲和扩大至少两倍阈值强度来传递。
压力转换器通过位于心脏上约3cm的T-连接器与主动脉插管连接，用来测量冠脉灌注压(CPP)。在整个实验中监测冠脉灌注压并在图表记录器(Gould Recorder 2200S)或计算机记录系统(PowerLab/4S，ADInstrumentsPty Ltd，澳大利亚)上记录。在研究中仅仅使用CPP在60-85mmHg范围(不存在药物)的心脏。以冠脉灌注速度(10ml/分钟)和冠脉灌注压之比来计算冠脉传导性(ml/分钟/mmHg)。
麻醉下开胸的猪标本在本研究中使用体重为22-27kg的农场猪。所有动物都按“ThePrinciples of Laboratory Animal Care”(由National Society for Medicalresearch制定)和“guide for the Care and Use of Laboratory Anomals”(由Institute of Laboratory Animal Resources编著并由National Institutes ofHealth(NIH公开号为86-23，1996年修订))所述的方法接受人道的饲养。另外，按University of Kentucky Institutional Animal Car and Use Protocol的指导原则使用动物。
用氯胺酮(20mg/kg，肌注)和戊巴比妥钠(15-18mg/kg，静注)来进行麻醉。另外每15-20分钟用戊巴比妥钠(1.5-2mg/kg，静注)保持麻醉。使用室内空气和100％O2的混合物并通过气管切开术来保持气流通畅。调节潮流气量、呼吸速率和吸入空气的O2分数来保持正常的动脉血气(ABG)和pH值。用食管温度探针检测体内温度并通过在37.0-37.5℃下加热衬垫来保持。在开始给予300-400ml后，通过耳或股静脉以5-7ml/kg/分钟的量给予乳酸盐林格溶液。将插管插入股动脉以检测动脉血压并获得ABG样。
通过正中胸骨切开术暴露心脏并悬浮在心包支架中。用尖端放置在左心房腔中并用金线(purse string)缝合固定的5F高保真度压力敏感的末端传感器(Millar Instruments，Houston，TX)测量左心房压力(LVP)。从周围组织中剥离一段左前下行冠状动脉(LAD)(邻近最早斜线分支的起端)。将转变时间的血管周流动探针(Transonic Systems Inc.，Ithaca，NY)放置在该段血管周围来测量冠脉血流(CBD)。在邻近流动探针处，插入24g改性的血管插管用于冠脉内输注。所有血液动力学数据被连续显示在计算机检测器中并通过32位模拟数字转化器输入具有定制软件的在线数据获得计算机(Augury，Coyote Bay Instruments，Manchester，NH)中。将A2AAdoR激动剂溶解在DMSO中以产生1-5mM的储备浓度，在0.9％盐水中稀释并以1-1.5ml/分钟的速度输入。冠脉内给予A2AAdoR激动剂。为了保持血压的恒定，静脉内给予苯福林。在蒸馏水中制备苯福林储备溶液(30mM)。
离体灌注心脏为了测定由腺苷和腺苷受体激动剂引起的A2A腺苷受体介导的冠脉血管扩张的持续时间，通过浓缩药团注射液静脉内给予所述激动剂。试验方案浓缩药团注射液。将腺苷(20μl，2×10-4M)、本发明化合物(20-40μl，2×10-5M)和其他腺苷受体激动剂的浓缩药团注射到该组(每个激动剂需要3-11个心脏)每个心脏的灌注管线中。测定CPP降低逆转50％(t0.5)和90％(t0.9)的时间。给予每个心脏最大量的三个血管扩张剂。
各种A2A腺苷受体激动剂的亲和力与其增加冠脉传导作用逆转时间的关系进行这些实验以便研究各种A2A腺苷受体激动剂的亲和力与其对冠脉传导作用持续时间的关系。将各种激动剂的浓缩药团注射到大鼠离体灌注心脏(对于各激动剂来说，n＝4-6)的灌注管线中并测定CPP降低逆转90％(t0.9)的时间。如上所述，在猪纹状体膜中测定各种A2A腺苷受体激动剂的亲和力。将CPP降低逆转时间(t0.9)与其A2A腺苷受体亲和力(pKi)绘图。
开胸的猪在实验开始前，当所有的设备测试完成后稳定30分钟。获得基线血液动力学数据后，开始第一次冠脉内输注A2AADOR激动剂。输注持续4-5分钟以便使LAD CBF达到稳态，然后结束输注。记录基线CBF逆转50％(t0.5)和90％(t0.9)的时间。CBF恢复到给药前数值后10-15分钟，开始第二次输注不同的激动剂。在预试研究中发现，冠脉内输注腺苷激动剂引起不同程度的系统性低血压，因此在后来的所有实验中，静脉内给予苯福林。在开始以1μg/kg/min的剂量输注苯福林之前和输注后进行血液动力学测定。在输注腺苷激动剂期间和输注后调节苯福林的输注速度以保持动脉压在输注前的5mmHg内。在各实验中测定三种不同激动剂作用的最大值。
结果将腺苷、本发明化合物和其他腺苷衍生物的浓缩药团以引起冠脉传导增加相同或接近相同的浓度注入灌注管线中。尽管腺苷和所述激动剂引起最大的冠脉传导增加相同，但其作用时间是明显不同的。腺苷作用的持续时间是最短的，接下来是化合物18、化合物12和化合物21，而CGS21680、YH-146、HENECA和WRC0470是最长的。以冠脉传导增加逆转50％和90％(分别为t0.5和t0.9)的时间表示的由腺苷、本发明化合物和其他激动剂引起的冠脉血管扩张的持续时间概括于表4中。
表4腺苷和腺苷受体激动剂在大鼠离体灌注心脏中冠脉血管扩张作用的逆转时间
由腺苷和腺苷受体激动剂引起的冠脉传导增加逆转50％和90％(分别为t0.5和t0.9)的时间(分钟)。该值是各标本(n)单独测定的平均值±SEM。
冠脉血管扩张作用的逆转时间依赖于腺苷衍生物与脑纹状体A2A受体的亲和力。激动剂与A2AAdoR的亲和力(PKi)和由该激动剂引起的冠脉血管扩张作用的逆转时间(t0.9)之间具有明显(P＜0.05)的反比关系。
开胸猪样本中的冠脉血管扩张作用在开胸并麻醉的猪样本原位心脏中，本发明的化合物12和18以及CGS21680和其他A2AAdoR激动剂(即，WRC-0470和YT-146)使冠脉血流(CBF)明显增加。如下表4所述，连续(4-5分钟)冠脉内输注所选剂量的这些化合物使CBF增加3.1-3.8倍。一旦所有激动剂使CBF产生几乎相同的增大(即，“成倍增加”)并使心率和平均动脉血压产生类似的改变被建立，就测定其各自冠脉血管扩张作用的逆转时间。
表4各种腺苷受体激动剂在开胸并麻醉的猪中使冠脉血流增加的大小
各种腺苷受体激动剂引起的基线上冠脉血流(CBF)的最大“成倍增加”。数据表示各个猪(n)一次或两次测量的平均值±SEM。
如表5所述，由各种A2AAdoR激动剂和“CVT-化合物”产生的冠脉血管扩张作用的t0.5和t0.9是可变的。本发明化合物12和18产生的CBF增加的逆转时间比CGS21680、WRC-0470或YT-146短。更重要的是，在大鼠离体灌注心脏中，A2AAdoR激动剂与猪脑纹状体A2A受体的亲和力(PKi)和冠脉血管扩张作用的逆转时间(t0.9)之间成明显(P＜0.05)的反比关系(r＝0.93)。所选的激动剂在大鼠离体灌注心脏和麻醉并开胸的猪样本中产生的冠脉血管扩张作用的逆转时间之间有极好的一致性