专利名称：幽门螺杆菌脂多糖外部核心表位的制作方法幽门螺杆菌脂多糖外部核心表位之前申请信息本申请要求2009年7月31日提交的美国临时专利申请61/230，315的权益，将其通过引用整体并入本文。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)被识别为与人慢性胃炎，消化性溃疡和胃癌关联的最常见的细菌感染。幽门螺杆菌(H. pylori)感染具有约半个世界的人群的估计的流行，在发展中国家中达70%和在工业化的国家中达到20 30% (Durm等人，1997)。 绝大大多数个体在儿童时获取幽门螺杆菌(H. pylori)；发展中国家中儿童之中的感染的流行与低社会-经济状态和差的卫生相关(Cast i 11 o-Ro jas等人，2004)。幽门螺杆菌 (H. pylori)已由世界健康组织(WHO)鉴定为I类致癌物，由于其增加胃癌的相对风险至少 6倍。胃癌是世界死亡率的第2个最常见原因，及造成700，000每年死亡(Parkin等人， 2002)。幽门螺杆菌OLpylori)的当前根除策略基于质子泵抑制物和抗生素的使用。但是，化学治疗性干预的功效被幽门螺杆菌(H. pylori)分离物之中抗生素抗性的频度和针对再感染的免疫的缺乏限制。由此，需要新治疗来提供防止和根除幽门螺杆菌OLpylori) 感染的全局策略。而新近调查聚焦于幽门螺杆菌OLpylori)的发病机制中蛋白组分的作用和它们在保护性免疫中的作用(Ruggiero等人，2003 ；Rossi等人，2004)，相对少的研究探索了包括疫苗制剂中的蛋白之外的抗原的可能性(Angelakopoulos和Hohmarm，2000)。例如，基于多糖的缀合物疫苗已知防止系统性感染及抑制宿主定居(Anderson等人，1986 ；Chu等人， 1991 ；Pon等人，1997 ；Passwell等人，2001 ；Passwell等人，2003)。肠病原体的新近研究检查了基于作为用于人使用的候选疫苗的LPS缀合物的方法(Gu等人，1996 ；Mieszala等人，2003 ；Cox等人，2005 ；Yu和Gu，2007)。脂多糖(LPS)是幽门螺杆菌(H. pylori)的主要细胞表面组分。对许多幽门螺杆菌(H. pylori)分离物进行的结构研究(Monteiro，2001) 产生了由0-链和附接于脂质A部分的核心寡糖组成的LPS的结构模型。多数幽门螺杆菌 (H. pylori)株的0-链多糖主链的结构独特及显示模拟存在于人胃和肿瘤细胞的细胞表面的那些的2型和/或1型Lewis (Le)血型决定子(Wirth等人，1996)；这些可牵涉导致萎缩性胃炎的不利的自身免疫反应(Appelmelk等人，1996)。此外，幽门螺杆菌(H. pylori)LPS 的外部核心区含有2种罕见的聚合物组分DD_七聚糖和α 1，6-葡聚糖(Monteiro，2001)。 外部核心区幽门螺杆菌(H. pylori) LPS分离物中的α 1，6_葡聚糖聚合物由ΗΡ0159开放阅读框的产物合成。幽门螺杆菌(H. pylori)中HP0159基因的存在和表达是常见的。已表征许多幽门螺杆菌(H.pyl0ri)LPS生物合成基因及测定了发病机制和定居中它们的作用(Logan 等人，2000 ；Logan 等人，2005 ；Hiratsuka 等人，2005 ；Chandan 等人， 2007 ；Altman等人，2008)。构建了幽门螺杆菌(H. pylori) HP0826突变体及展示此突变导致缺少Le抗原的截短的LPS的形成(Logan等人，2000)。但是，未达到LPS的结构的全表征。尽管领域内的发展，但尚未触及跨多类型的幽门螺杆菌OLpylori)的免疫原性表位有效性。发明概述本发明涉及新的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)LPS外部核心表位。更特别是，本发明涉及新的幽门螺杆菌(H. pylori)外部核心表位，其合成，表征和缀合。本发明提供含有α 1，6-葡聚糖的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)化合物，其包含式I的结构KHGFECBAa-Glc"4-p-Gal-7-a-DDHep-2-a-Hep-3-a-Hep7PEtN-5-a-Kcb-6-p-GicN*-6-a-GlcN*lPEtN 1 |2 RR是由连接到a 1,3-DD-庚烷(h印tan)的α 1，6_葡聚糖取代的 α -DDH印-3- α -L-Fuc-3- β -GlcNAc三糖，及α 1，3-DD-庚烷的最后的DD-H印残基由 β-GlcNAc残基封头。在如上所述的化合物中，α 1，6_葡聚糖可包含约3 约12个α 1， 6-连接的葡萄糖残基，及al，3-DD_庚烷可包含约2 约6个α 1，3_连接的庚糖残基。上述化合物的R基可为庚烷(heptan )葡舉糖WPTYXVQZ
-tx^DDHep-3-fx-L-Fxic-3-{5 -GIcNAc NML其中β -GlcNAc残基L连接到H印G的0_2。在如上所述的化合物中，葡聚糖的残基Q和Z是α 1，6-连接的葡萄糖残基，及η可为约1 11的任何值；残基Τ，Y和X是 α 1,3-连接的庚糖残基，及m可为约0 4的任何值。上述化合物可分离或纯化自幽门螺杆菌(H. pylori)株HP0^6: :Kan。在上述化合物中，式I的结构可还包含共价附接到Kdo残基C的脂质A部分。月旨质A分子可为0-去酰化的或可通过Kdo残基的酮糖苷键的水解切割。本发明也提供缀合物，包含缀合于接头分子，蛋白载体，或其组合的含有基本上线性α 1，6-葡聚糖的化合物。含有基本上线性α 1，6-葡聚糖的化合物可为本文所述的化合物，其中式I的结构缀合于接头分子，蛋白载体或其组合。含有基本上线性al，6-葡聚糖的化合物可替代性地为葡聚糖，诸如葡聚糖Τ5。蛋白载体可为破伤风类毒素或牛血清白蛋白。本发明也包括组合物，其包含一种或多于一种上述化合物或缀合物。
本发明还包括针对本文所述的含有α 1，6-葡聚糖表位的化合物的抗体。抗体可为单克隆抗体1C4F9。本发明还包括杂交瘤细胞系1C4F9，其产生单克隆抗体1C4F9。上述单克隆抗体可用于在需求治疗的个体中导致表达al，6_葡聚糖的幽门螺杆菌(H. pylori)株的补体-介导的溶菌。本发明也提供有效量的上述组合物用于在个体中诱导针对幽门螺杆菌 (H. pylori)的免疫应答的用途。组合物中的化合物可缀合于适合的载体蛋白；额外地，组合物中的化合物可经脂多糖的2-酮基-3-脱氧-辛酮糖酸(Kdo)缀合于适合的载体蛋白。本发明还提供通过用本文所述的免疫原性组合物免疫哺乳动物来产生的免疫抗血清。免疫抗血清可包含识别同源和异源可分型的和非-可分型的突变体和野生型株幽门螺杆菌(H. pylori)中的α 1，6_连接的葡聚糖表位的IgG。IgG可导致突变体和野生型表达al，6-葡聚糖的幽门螺杆菌(H. pylori)株的补体-介导的溶菌。本发明的额外的方面和优势会通过以下说明显而易见。详述和实施例，在指示本发明的优选的实施方式的同时，仅通过例证方式给出，由于在本发明的范围之内的各种变化及修饰会由本领域技术人员通过本发明的教导而显而易见。

现在会参照附图例示本发明的这些和其他特征，其中图1以阳性离子模式显示自幽门螺杆菌(H. pylori)株沈695朋0拟6: :Kan的去脂的LPS的级分1中LPS糖型的CE-MS分析。图IA显示提取的质谱(m/z 1000-1500)，而图 IB显示以m/z 1266. 3的离子的产物离子谱。图2以阴性离子模式显示自幽门螺杆菌(H. pylori)株沈695朋0拟6: :Kan的0_去酰化的LPS的LPS糖型的CE-MS分析。图2A显示提取的质谱(m/z 600-2000)，而图2B显示以m/z 1597. 7的离子的产物离子谱。对应于脂质A部分的碎片离子用星号标记。图3A显示自幽门螺杆菌(H. pylori)株沈695朋0拟6: :Kan的主要LPS糖型的结构；未显示酰化。图3A的LPS的KOH脱酰基的产物显示于图3B(化合物1 4)。化合物 4的脱氨基的产物显示于图3C(化合物5和6)。化合物6的高碘酸氧化的产物显示于图 3D (化合物7和8)。也显示本领域就自株沈695的幽门螺杆菌(H. pylori) LPS (图3E)和自株沈695朋0拟6: :Kan突变体的幽门螺杆菌(H. pylori) LPS (图3F)的之前建议的结构(从 Logan等人，2000改造的)。PEtn =磷酸乙醇胺；Glc = D-吡喃葡萄糖；Gal = D-吡喃半乳糖；Kdo = 2-酮基-3-脱氧-辛酮糖酸；LDH印=L-甘油基-D-甘露糖型-庚糖；DDH印= D-甘油基-D-甘露糖型-庚糖；GlcNAc = 2-乙酰氨基_2_脱氧-D-葡萄糖；GlcN = 2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖；Fuc = L-岩藻糖；P =磷酸；及Gro =甘油。图4显示制备本发明的基于LPS的缀合物的反应方案。图5以阴性离子模式显示去脂的幽门螺杆菌(H. pylori) 0:3HP0826: :Kan LPS的主要级分的CE-MS分析。·侧链中含有1个H印残基的LPS糖型，R = Hex5_13, Hep, HexNAc, Fuc ；·侧链中含有 2 个 Hep 残基的 LPS 糖型，R = Hex8_13，Hep, Hep, HexNAc, Fuc0图 6 显示由通过用自 26695HP0479 Kan (图 6A)和 26695HP0826 Kan (图 6B) 的幽门螺杆菌(H.pyl0ri)LPS的抑制ELISA的dLPS-TT缀合物引发的兔抗体的特异性的确定的坐标图。包被LPS如下所示实心矩形-26695 ；实心菱形-26695HP0^6: :Kan ；实心圆形-26695HP0159: :Kan ；实心三角形-26695HP0479 :Kan ；空心圆形-SSl ；空心矩形-SS1HP0^6: :Kan ；空心三角形-SS1HP0159: :Kan ；空心倒三角形-SSl HP0479 :Kan ；图7显示描绘在⑶-1小鼠中的幽门螺杆菌(H. pylori)-特异性抗体应答的坐标图。小鼠经用1 μ g/小鼠霍乱毒素辅佐的25 μ g/小鼠dLPS-TT缀合物(实心条)，用1 μ g/ 小鼠霍乱毒素(斜线纹条)或盐水(空心条)辅佐的无PJ2细胞的超声处理物以每周间隔免疫接种4次。第1免疫之后4周，收集血清，粪便和阴道洗涤样品及测定幽门螺杆菌 (H. pylori)-特异性IgG和IgA。个体小鼠标绘于坐标图，水平条指示组平均值(n = 5/ 组)。通过单尾 Mann Whitney 测试的 *p < 0. 05，**p < 0· 01。图8是描绘⑶-1小鼠胃中的幽门螺杆菌(H. pylori)负荷的条形图。小鼠经用 1 μ g/小鼠霍乱毒素辅佐的25 μ g/小鼠dLPS-TT缀合物(实心条)，用1 μ g/小鼠霍乱毒素(斜线纹条)或盐水(空心条)辅佐的无PJ2细胞的超声处理物以每周间隔免疫接种4 次。第1免疫之后5周，小鼠每隔一天用 IO8Cfu幽门螺杆菌(H. pylori)，PJ2株经口管饲3次。4周后，杀小鼠及自它们的胃计数有活力的细菌。条代表4 5只小鼠士SEM的组。Y < 0. 05,单尾 Mann-Whitney 测试。实施方式本发明涉及新的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)LPS外部核心表位。更特别是，本发明涉及新的幽门螺杆菌(H. pylori)外部核心表位，其合成，表征和缀合。除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常明白的相同的含义。尽管类似或相当于本文所述的那些的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，现在描述优选的方法和材料。在下文提及的全部出版物通过引用并入本文。如本文所用，‘纯化的’不必表示绝对纯度而是作为相对定义。类似地，如本文所用，‘分离的’指称某物自其天然环境移出。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是通常与人慢性胃炎，消化性溃疡和胃癌关联的细菌病原体；作为与幽门螺杆菌(H. pylori)感染关联的胃癌的增加的风险的结果，其被分类为I类致癌物。脂多糖(LPQ是幽门螺杆菌OLpylori)的主要细胞表面组分。涉及幽门螺杆菌(H. pylori)LPS的结构研究的之前出版物导致建议的0-链多糖共价连接于核心寡糖，其进而附接于脂质A部分的模型。多数幽门螺杆菌OLpylori)株的0-链多糖主链独特和可显示2型和/或ISLewis(Le)血型决定子；此多糖组分是抗原性的。“可分型的”幽门螺杆菌(H. pylori)株具有可被抗-Lewis抗体(抗-Le)识别的Lewis表位(Le X和/或Le Y抗原)；该抗体可为可商购的及辅助分型。“非-可分型的”株不含有Lewis 结构。建立了进一步结构研究，幽门螺杆菌(H. pylori)LPS的外部核心区含有2种罕见的聚合物组分DD-七聚糖和α 1，6-葡聚糖侧链(Monteiro，2001)。Logan等人(2000)也提供了有关LPS结构的洞察。特别是，建议的结构(见图3E和3F)提供，侧链中的DD-庚糖(DD-Ifep)附接于主链中的DD-H印，而α 1，6_葡聚糖附接于此侧链DD-H印及形成另一分支。特别是，Logan等人Q000)基于FAB-MS谱(快原子轰击质量光谱法)测定了 0拟6突变LPS中葡聚糖链的长度是1 3个葡萄糖。也描述了幽门螺杆菌(H. pylori)株沈6951^3 中α 1，6_连接的葡萄糖的存在，及基于甲基化分析数据，但未测定葡聚糖的长度。额外地推荐，在株26695LPS中，3-取代的H印形成0-链的GIcNAC单元和核心之间的连接。也陈述了幽门螺杆菌(H. pylori) HP0^6: :Kan LPS中3-连接的庚糖的存在，但未描述α 1，3_庚烷的存在或其长度。未提供有关庚烷或葡聚糖侧链的结构或长度的进一步信息。本发明进一步确定了幽门螺杆菌(H. pylori)LPS的结构。本发明提供含有新α 1，6-葡聚糖的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)化合物，
其包含式I的结构


幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)，最常见的人病原体之一，相关于人慢性胃炎，消化性溃疡和胃癌的发展。本发明涉及含有α1，6-葡聚糖的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)化合物，其包含式I的结构其中R是由连接到α1，3-DD-庚烷的α1，6-葡聚糖取代的α-DDHep-3-α-L-Fuc-3-β-GlcNAc三糖，及其中α1，3-DD-庚烷的最后的DD-Hep残基由β-GlcNAc残基封头。也描述包含化合物的组合物，化合物的用途，及针对化合物产生的抗体。