专利名称：一种预防幽门螺杆菌感染的药物制剂的制作方法幽门螺杆菌是定居于人胃内的一种革兰氏阴性螺旋状杆菌，自1982年Warren和Marshall发现Hp以来，大量研究表明，Hp感染是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因，与胃恶性肿瘤的发生密切相关，并于1996年被世界卫生组织确认为一级致癌原。根除Hp对上述疾病的预防及治疗至关重要，目前的主要方法是药物根除(抗生素加质子泵抑制剂或铋剂)，但是副作用大、复发率高特别是耐药菌株的出现使得药物疗效大受影响，另外，由于人群中Hp自然感染率较高，在我国达50％以上，而Hp具有口-口、粪-口等多种传播途径，难以人为切断。因此，应用常规药物很难在人群中大规模防治Hp。近年来许多学者提出了免疫防治Hp的策略，并取得了积极的进展。研究表明，口服Hp成份抗原及佐剂能够激发有效的免疫保护反应，具有应用于临床治疗及预防Hp感染的前景。目前已发现了多种Hp成份抗原与不同佐剂的有效组合。通过基因工程技术可获得大量有效、无毒的抗原，而通过动物实验证实有效的佐剂仅有霍乱毒素(CT)、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)，但是二者的毒性作用制约其进一步应用于人体。
本发明的目的在于提供一种预防幽门螺杆菌感染的药物制剂，所述的药物制剂包括尿素酶B亚单位、空泡毒素、外膜蛋白OMP27和药用佐剂，进一步的，所述的佐剂采用一种新型粘膜佐剂CpG-寡核苷酸，所述的CpG-寡核苷酸具有如下的序列5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’。本发明的目的还在于提供所述的预防幽门螺杆菌感染的药物制剂在预防和治疗幽门螺杆菌感染的药物中的应用。本发明的所述的药物可以通过鼻腔的方式或其他免疫学可行的给药途径对机体进行免疫。本发明的制备方法是将三种抗原蛋白与CpG-ODN在4℃下加入无菌双蒸水溶解、混合，即可制成本发明所述的药物制剂。采用本发明对病人进行治疗时，将液体制剂通过鼻道滴入，进入鼻腔，可被鼻粘膜迅速吸收，激发机体的免疫反应而产生保护作用。本发明所述的药物也可以通过皮内给药的方式对机体进行免疫。本发明和已有技术相对照由于本发明由三种纯化的抗原蛋白质与CpG-ODN组成，安全、无毒，而且不会与机体发生交叉反应。尤其是佐剂CpG-ODN的使用，既具有较强的免疫刺激作用，又无其它佐剂的毒性作用，而且本发明方法工艺简单，操作方便，易在实验室中完成，也适宜于工厂化生产。


图1为本发明所述的药物分别采用粘膜佐剂CpG-寡核苷酸和其它佐剂治疗用于治疗感染动物后，血清中IgG2a水平的比较图。

实施例2尿素酶B亚单位(UreaB)基因的制备尿素酶B亚单位(UreaB)基因从EMBL sequence No.M60398中得到该基因全序列。利用GCG基因分析软件系统，对目的基因进行的酶切位点、阅读框、mRNA二级结构分析，引物设计如下sense5’-AGGAAGATGCACGAAGACTGGGGCACC-3’；antisense5’-GAAGATCTGGACGAAAATGCTAAATAGTTG-3’。PCR反应条件94℃热变性4min，94℃ 30sec、45℃ 30sec和72℃ 1.5min 30个循环，72℃延伸10min。PCR产物用1％Agarose电泳鉴定后，进行割胶回收。
实施例3外膜蛋白(OMP27)基因的制备以分离纯化的H.pylori基因组DNA作模板。核酸序列设计引物如下sense 5’-AAAAAAGGTACCGAAGAGAGCGCGGCTTTTGTGGGA-3’；antisense5’-AAAAAAAAGCTTTCATTAAAAATCCCTCAAGTAACTGAT-3’。PCR反应条件94℃热变性3min，94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃°1min，共30个循环，72℃延伸5min。PCR产物用1％Agarose电泳鉴定后，进行割胶回收。
实施例4空泡毒素VacA基因的制备从Genebank获得H.pylori NCTC11637 vacA的全基因序列，基因登录号为AF049653。vacA基因全长4544bp，编码约140kDa的VacA前毒素蛋白，本实验克隆其中编码成熟VacA毒素的DNA片段(389bp-2942bp)，表达约95kDa毒素蛋白。利用DNAStar和GeneRunner基因分析软件对目的基因进行阅读框、酶切位点、mRNA二级结构分析，针对此序列设计引物如下sense 5’-CAAAGTCCCATGGCCTTTTTCACAAC-3’，antisense 5’-TTCAAACTGCAGCTCAATAGTGCC-3’；克隆位点为Nco I和Pst I。PCR反应条件为94℃热变性4min，94℃ 30sec、55℃ 1min、72℃ 2.5min共30个循环，72℃延伸10min。PCR产物用1％Agarose电泳鉴定后，进行割胶回收。
实施例5UreaB基因与载体的酶切与连接用限制性内切酶Sal I酶和BamH I分别对扩增的目的基因片段UreaB和载体质粒pQE-30(购自QIAGEN公司)进行双酶切。
酶切反应的反应体系为50μl，其中目的基因或载体质粒的DNA 25μl，10 X Buffer 5μl，两种限制性内切酶各1μl，37℃下消化3小时。酶切产物用1％Agarose凝胶电泳分离鉴定。切胶回收目的基因，与载体质粒分别用T4 DNA连接酶连接，连接反应体系为10μl，含10 X Bufer 1μl，T4连接酶1μl，目的基因和载体DNA按4∶1混匀，16℃连接16小时。
实施例6OMP27基因与载体的酶切与连接用限制性内切酶Kpn I和Hind III分别对扩增的目的基因片段OMP27和载体质粒pQE-30进行双酶切。酶切反应的反应体系为50μl，其中目的基因或载体质粒的DNA 25μl，10 X Buffer 5μl，两种限制性内切酶各1μl，37℃下消化3小时。酶切产物用1％Agarose凝胶电泳分离鉴定。切胶回收目的基因，与载体质粒分别用T4 DNA连接酶连接，连接反应体系为10μl，含10 X Bufer 1μl，T4连接酶1μl，目的基因和载体DNA按4∶1混匀，16℃连接16小时。
实施例7VacA P95基因与载体的酶切与连接用限制性内切酶Nco I和Pst I分别对目的基因片段VacA P95和载体质粒pQE-TriSystem进行双酶切。为防止载体质粒自身环化，用Shrimp碱性磷酸酶处理酶切后的质粒DNA。
酶切反应的反应体系为50μl，其中目的基因或载体质粒的DNA 25μl，10 X Buffer 5μl，两种限制性内切酶各1μl，37℃下消化3小时。酶切产物用1％Agarose凝胶电泳分离鉴定。切胶回收目的基因，与载体质粒分别用T4 DNA连接酶连接，连接反应体系为10μl，含10 X Bufer 1μl，T4连接酶1μl，目的基因和载体DNA按4∶1混匀，16℃连接16小时。
实施例8 感受态细胞的制备及重组质粒的鉴定用标准CaCl2法制备E.coli DH5α、XL1-Blue、M15和SG13009的感受态细胞(购自QIAGEN公司)，置于-80℃备用。
用热休克法将连接产物分别转化入相应的宿主菌中UreaB+PQE30→DH5α，OMP27+PQE30→XL1-Blue，VacA P95+pQE-TriSystem→XL1-Blue。取冻存的E.coli感受态细胞置于1.5ml Eppendorf管中，分别加入相应的连接反应产物，轻轻混匀，冰浴20分钟后42℃热击45sec，立即置冰上2min，再加入1ml LB，于37℃、200rpm转速下培育50min，5000rpm离心3min，弃部分上清，留约100μl重悬沉淀后涂于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。
以PCR法筛选出含重组质粒的阳性克隆，挑选一单个克隆扩增培养后，提取重组质粒DNA，根据各自的双酶切位点进一步酶切鉴定后，用DNA测序仪进行序列测定，使用QIAGEN公司提供的pQE载体测序引物。
实施例9重组质粒转化表达宿主菌经测序的重组DNA转化表达菌UreaB+PQE30→M15，OMP27+PQE30→XL1-Blue，VacA P95+pQE-TriSystem→SG13009。取上述纯化的重组质粒各1μl对宿主菌感受态细胞进行转化，方法同上。最后取30μl转化培养物涂于含100μg/ml氨苄青霉素及25μg/ml卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。PCR筛选阳性克隆，并以酶切法进一步鉴定，筛选阳性重组工程菌。
实施例10诱导表达以IPTG诱导表达目的蛋白于含100μg/ml氨苄青霉素及25μg/ml卡那霉素的LB培养液中按20∶1比例加入阳性重组工程菌过夜培养液，37℃，200rpm培养至菌液OD600＝0.8时，取出1ml作为诱导表达前的对照，加入IPTG至终浓度1mM，同样条件下诱导培养3小时，菌液于5000rpm离心20分钟，弃上清，-20℃保存菌体沉淀。
实施例11表达产物的鉴定(1)SDS-PAGE凝胶电泳后进行考马斯亮蓝染色，观察表达的蛋白条带，并用光密度薄层扫描仪定量检测蛋白质含量。(2)Western blot按上述方法对宿主菌进行诱导表达及SDS-PAGE后，通过电转移将蛋白转印至硝酸纤维素膜，3％牛血清白蛋白(BSA)4℃封闭过夜，加入H.pylori感染小鼠血清于37℃作用1h，羊抗兔IgG-HRP于37℃ 1h，TBS振洗后，用化学发光法进行检测。氨基酸测序将转印好的膜经考马斯亮蓝染色，甲醇-冰乙酸脱色后切下含目的条带的凝胶，进行氨基酸序列测定。
实施例12表达产物的分离纯化(1)包涵体的分离以裂解液裂解细胞，经超声破碎后(冰浴下进行)，高速离心，再溶于含8M尿素的初始缓冲液中备用。
(2)金属螯合亲和层析(MCAC)纯化重组蛋白所用仪器为AKTAexplorer100(Amersham pharmaciabiotech)FPLC层析仪，将溶解的包涵体直接上样，8M尿素作为变性剂，在变性条件下纯化。采用介质为亚氨二乙酸的HiTrapChelating 5ml预装柱(Amersham pharmaciabiotech)，以5倍体积的0.05MNiSO4过柱吸附Ni2+，0.1-0.5M咪唑线性洗脱，洗脱速度为2ml/min，按每管1ml自动收集洗脱液。
(3)纯化产物的复性将纯化的目的蛋白，4℃下分别于1000ml含4M、2M尿素的磷酸盐缓冲液(PBS)中各透析2h，然后将透析袋移至1000ml不含尿素的PBS中，4℃透析过夜，经聚乙二醇浓缩，分装，-20℃冻存备用。
(4)纯化产物的鉴定SDS-PAGE和Western blot。具体方法见上。
实施例13佐剂的制备用DNA合成仪合成CpG-ODN，序列如下5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’，CpG-ODN可由上海生工生物技术有限公司购得，并经硫代修饰，溶于无菌生理盐水中。
实施例14动物实验验证CpG佐剂的效果1.菌株培养本研究所用的Hp菌株为悉尼株(Sydney Strain，SS1，购于澳大利亚新南威尔士大学微生物学院)。采用添加7％马血(上海生物制品所)和Skirrow选择性抗生素的血琼脂(Oxoid，Ltd)培养基或脑心浸液(BHI)肉汤(Oxoid，Ltd)，微氧培养2-3天，经尿素酶、触酶、氧化酶试验及涂片革兰氏染色鉴定细菌形态及活力。将活力良好的Hp悬于改良布氏肉汤中，利用分光光度计测定菌液浓度，当OD660＝1时，细菌浓度为108/ml[1]。将浓度调整至109/ml，用于接种小鼠。
2.动物实验动物为无特殊病原菌(S.P.F)级C57BL/6小鼠，6～8周龄，18～20g，委托中科院上海实验动物中心饲养。
3.动物实验共设8组，分别经口或鼻道给予Hp WCS(1mg)/CpG(50μg)或HpWCS(1mg)/CT(10μg)，并设m-CpG对照及只给予Hp WCS或佐剂的对照组。免疫程序接种共4次，每周1次。最后1次免疫后1周，所有小鼠均以5×108Hp攻击，隔日1次，共3次，最后1次攻击后2周处死小鼠，将实验鼠胃沿大弯纵向切开，纵向切成同样大小的3份，1份直接行快速尿素酶试验，1份用于细菌培养，1份置于10％福尔马林中固定，用于病理组织学(Giemsa和H&E染色)检测。
4.标本收集1)唾液收集腹腔内注射100μg Pilocarpin(溶于100μlPBS)，数分钟后将剪好的BFC180纤维素条(Whatman，USA)一端伸入小鼠口中将唾液吸出，直至饱和。将纤维素条放入尖底离心管中，-70℃冻存。测定前，在离心管中加入300μlPBS(含5％脱脂奶粉和蛋白酶抑制剂(1mM PMSF，1μg/ml抑肽酶和10μM亮肽素))，旋涡振荡2次，每次15秒，16000g，2分钟，4℃离心，收集上清，测定或置-70℃冻存待用。
2)胃液收集将BFC180纤维素纸(约1×2cm)贴于胃黏膜面，3分钟后，将纤维素纸放入尖底离心管中，-70℃冻存。余步骤同前。
3)血清收集取眼球放血，收集至尖底离心管中，离心集上清，-70℃冻存待用。
5.ELISA法检测抗体以HpWCS(0.5μg/孔)包板。依次加入待测样品及辣根过氧化物酶标记的goat-anti-mouse IgG(Calbiochem，USA)，goat-anti-mouse IgG1(Caltag Laboratories，USA)，goat-anti-mouse IgG2a(CaltagLaboratories，USA)和goat-anti-mouse IgA(Caltag Laboratories，USA)。反应浓度为血清1∶100，goat-anti-mouse IgG 1∶1万，goat-anti-mouse IgG2a 1∶4000，goat-anti-mouse IgG1 1∶5000；血清1∶50，goat-anti-mouse IgA 1∶1万；胃液1∶5，唾液1∶25，goat-anti-mouse IgA 1∶1万。最后加入TMB 100μl，37℃，15min后加入终止液，终止反应，测定OD450nm。
6.结果各组保护效果见表1。
组别免疫成分及途实验 感染 保护率径 鼠只数鼠只数(％)1 WCS+CT 123 75*i.o2 WCS+CpG 10100i.o3 WCS+CpG 103 70*i.n4 WCS+mCpG10100i.n5 CpG 10100i.n6 WCS 108 20i.o7 CT 109 10i.o8 N.S 10100i.o*与未免疫对照组(N.S组)相比，P＜0.05(χ2检验)。
如表1、图1所示，细菌攻击后2周及8周时，滴鼻Hp WCS/ODN组的血清IgG和IgG2a显著高于对照组(Student’s t test，P＜0.05)，各组及组内血清、唾液、胃液IgA无显著差别。
结果显示，鼻内给予小鼠CpG-ODN可获得70％的保护率，和CT相似，而经口灌胃不能获得保护，而且单独给予CpG-ODN或变异的CpG ODN均不能产生保护作用。ELISA法检测抗体结果显示，保护组的IgG2a水平增高，IgG2a是Th1反应时产生的抗体，提示免疫保护作用可能与Th1反应相关。综上，CpG-ODN是一颇具潜力的幽门螺杆菌疫苗佐剂。
实施例15预防H.pylori感染的制剂制备将50ug尿素酶B亚单位、50ug空泡毒素、50ug外膜蛋白OMP27和50ug粘膜佐剂CpG-寡核苷酸，在4℃下加入0.08ml无菌双蒸水溶解、混合，即可制成本发明所述的药物制剂。
实施例16动物实验验证本混合制剂预防幽门螺杆菌感染的作用1.菌株培养同上。
2.动物同上。
3.动物实验共设4组，分别经鼻道给予混合制剂Hp WCS(1mg)/CpG(50μg)或并设HpWCS(1mg)/CT(10μg)的对照及只给予Hp的感染对照的对照组。
免疫接种经鼻道免疫C57BL/6小鼠，每周1次，每只小鼠接受免疫的剂量为三种抗原以及佐剂各50μg，共接种4次。另设空白对照组、感染对照组以及全菌超声粉碎抗原+CT组作为对照。最后1次免疫后1周，所有小鼠均以108CFU Hp攻击，经口灌入，隔日1次，共3次。最后1次灌胃后2周拉颈处死小鼠。将实验鼠胃沿大弯纵向切开，纵向切成同样大小的3份，1份直接行快速尿素酶试验，1份放入无菌生理盐水中，用于细菌培养，1份置于10％福尔马林中固定，用于病理组织学(Giemsa和H&E染色)检测。
各组保护效果见表2。

*与未免疫的感染对照组相比，P＜0.05(Two-tailed Fisher’s ExactProbability Test)


本发明公开了一种预防幽门螺杆菌感染的药物制剂以及本发明作为预防幽门螺杆菌感染的药物的应用。本发明的所述的药物可以通过鼻腔的方式或其他免疫学可行的给药途径对机体进行免疫，本发明的制备方法是将三种抗原蛋白与CpG－ODN在4℃下加入无菌双蒸水溶解、混合，即可制成本发明所述的药物制剂。采用本发明对病人进行治疗时，将液体制剂通过鼻道滴入，进入鼻腔，可被鼻粘膜迅速吸收，激发机体的免疫反应而产生保护作用。