对于谷氨酸显示高活性的新型氨基转移酶、编码该酶的基因和它们的利用法

伊藤纪幸, 西聪子, 川野茂, 八十原良彦

2014年1月22日

2011年9月28日

2010年9月28日

株式会社钟化

C12N15/09GK103534350SQ201180046832

高活性 谷氨酸 氨基 新型 显示 对于

1.一种多肽，其具有下述的理化学性质(1)， (1)作用催化如下氨基转移反应，该反应为在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用，生成光学纯度93%e.e.以上的(S) _1_苄基_3_氨基吡咯烷2.根据权利要求1所述的多肽，其还具有下述的理化学性质(2) (2)底物特异性 (a)氨基供体显示对(S)-1-苯乙胺的活性，相比于L-丙氨酸对L-谷氨酸显示更高的活性，且对于β -丙氨酸、4-氨基丁酸实质上不显示活性； (b)氨基受体相比于丙酮酸对2-氧代戊二酸显示更高的活性3.根据权利要求1或2所述的多肽，其还具有以下的理化学性质(3)至(6)(3)最适pH7.0 ~8.0 ; (4)最适温度30~50°C; (5)热稳定性在30~50°C处理30分钟时，保持处理前的70%以上的残留活性； (6)分子量在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，约48kDa4.根据权利要求1~3中 任一项所述的多肽，其中 所述多肽为从属于节杆菌属(ArthiObacter属)的微生物获得的多肽5.根据权利要求1~3中任一项所述的多肽，其中 所述多肽为从节杆菌属菌种(Arthrobacter sp.)获得的多肽6.根据权利要求1~3中任一项所述的多肽，其中 所述多肽为从节杆菌属菌种(Arthrobacter sp.) KNK04-25 (NITE BP-954)获得的多肽7.一种多肽，其为以下(a)至(g)中任一项所述的多肽 (a)包括序列表的序列编号I所示的氨基酸序列的多肽； (b)包括在序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加了I个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93%e.e.以上的(S)-1-苄基_3_氨基吡咯烷的活性的多肽； (C)包括在序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加了 I个或多个氨基酸的氨基酸序列、且作为氨基供体显示对(S)-1-苯乙胺的活性，相比于L-丙氨酸对L-谷氨酸显示更高的活性，且对于β-丙氨酸、4-氨基丁酸实质上不显示活性，作为氨基受体相比于丙酮酸对2-氧代戊二酸具有更高的活性的多肽； (d)包括在序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加了I个或多个氨基酸的氨基酸序列、且最适pH为7.0~8.0，最适温度为30~50°C，在30~50°C处理30分钟时保持处理前的70%以上的残留活性，分子量在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中约为48kDa的多肽； (e)包括与序列表的序列编号I中记载的氨基酸序列具有50%以上的序列同一性的氨基酸序列、且具有在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93%e.e.以上的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的活性的多肽； (f)包括与序列表的序列编号I中记载的氨基酸序列具有50%以上的序列同一性的氨基酸序列、且作为氨基供体显示对(S)-1-苯乙胺的活性，相比于L-丙氨酸对L-谷氨酸显示更高的活性，且对于β -丙氨酸、4-氨基丁酸实质上不显示活性，作为氨基受体相比于丙酮酸对2-氧代戊二酸具有更高的活性的多肽； (g)包括与序列表的序列编号I中记载的氨基酸序列具有50%以上的序列同一性的氨基酸序列、且最适pH为7.0~8.0，最适温度为30~50°C，在30~50°C处理30分钟时保持处理前的70%以上的残留活性，分子量在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中约为48kDa的多肽8.包括编码权利要求1~7中任一项所述的多肽的碱基序列的DNA9.根据权利要求8所述的DNA，其是下述⑷至(C)中任一项所述的DNA (A)包括序列表的序列编号2中记载的碱基序列的DNA； (B)在严谨的条件下，和包括与序列表的序列编号2中记载的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交的DNA ； (C)包括在序列表的序列编号2中记载的碱基序列中，缺失、取代、插入或添加了I个或多个碱基的碱基序列的DNA10.包含权利要求8或9所述的DNA的载体11.由权利要求10所述的载体转化宿主细胞得到的转化体12.一种光学活性氨基化合物的制造方法，包括 在氨基供体的存在下，使权利要求1~7中任一项所述的多肽或权利要求11所述的转化体的培养物与酮化合物作用13.—种通式(2)所示的 光学活性氨基化合物的制造方法，包括 在氨基供体的存在下，使权利要求1~7中任一项所述的多肽或权利要求11所述的转化体的培养物与通式(I)所示的酮化合物作用， 通式⑴ 14.一种光学活性氨基化合物的制造方法，包括 在氨基受体的存在下，使权利要求1~7中任一项所述的多肽或权利要求11所述的转化体的培养物与氨基化合物的对映体混合物作用15.一种光学活性氨基化合物的制造方法，包括 在氨基受体的存在下，使权利要求1~7中任一项所述的多肽或权利要求11所述的转化体的培养物与通式(3)所示的氨基化合物的对映体混合物作用，由此得到通式(4)所示的光学活性氨基化合物， 通式⑶ 16.根据权利要求13所述的制造方法，其中 所述式(I)所示的酮化合物为选自1-四氢萘酮、2-四氢萘酮、5-甲氧基-2-四氢萘酮、6-甲氧基-2-四氢萘酮、7-甲氧基-2-四氢萘酮、8-甲氧基-2-四氢萘酮、1-苄基-3-吡咯烷酮、l-Boc-3-吡咯烷酮、l-Cbz-3-吡咯烷酮、1-苄基-3-哌啶酮、l-Boc_3-哌啶酮、l-Cbz-3-哌啶酮、苯乙酮、3，4- 二甲氧基苯基丙酮中的I种以上的酮化合物17.根据权利要求15所述的制造方法，其中 所述式(3)所示的氨基化合物为选自1-氨基1，2，3，4-四氢化萘、2-氨基1，2，3，4-四氢化萘、甲氧基-2-氨基1，2, 3, 4-四氢化萘、6-甲氧基-2-氨基1，2, 3, 4-四氢化萘、甲氧基_2_氨基1，2，3, 4-四氢化萘、8-甲氧基-2-氨基1，2，3, 4-四氢化萘、1-节基_3_氨基批咯烧、l-Boc-3-氨基批咯烧、l-Cbz-3-氨基批咯烧、1-苄基-3-氨基哌唳、l-Boc-3-氨基哌啶、l-Cbz-3-氨基哌啶、1-苯乙胺、3，4- 二甲氧基苯异丙胺中的I种以上的氨基化合物18.根据权利要求12或13所述的制造方法，其中， 氨基供体为选自1-苯乙胺、2- 丁基胺、2-戊基胺、2-庚基胺、3-庚基胺、正乙基胺、正丙基胺、正丁基胺、正戊基胺、异丙基胺、异丁基胺、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、3-氨基-1-苯基丁烷、苯甲胺、苯乙胺、环己胺和它们的光学活性体中的化合物19.根据权利要求14或15所述的制造方法，其中 氨基受体为2-氧代戊二酸或丙酮酸20.一种光学活性氨基化合物的制造方法，包括 通过在同一反应体系中利用权利要求1~7中任一项所述的多肽和具有使由氨基供体生成的酮化合物(X)的羰基转换为其他官能团的活性的至少I种酶，在氨基供体的存在下，将酮化合物(Y)转换为与氨基结合的碳原子为不对称点的、对应的光学活性氨基化合物⑵21.根据权利要求20所述的制造方法，包括 通过在同一反应体系中利用下述的多肽和酶(I)至(III)，在氨基供体的存在下，将酮化合物(Y)转换为与氨基结合的碳原子为不对称点的、对应的光学活性氨基化合物(Z) (I)权利要求1~7中任一项所述的多肽； (II)具有以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作为辅酶，并通过所述多肽(I)的作用使由氨基供体的α-氨基酸生成的酮化合物(X)的α-酮酸还原为α-氨基酸的能力，且对所述酮化合物(Y)不起作用的α-氨基酸脱氢酶； (III)具有通过所述α-氨基酸脱氢酶(II)的作用使由所述NADH生成的氧化型β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)转换为NADH的能力、或具有通过所述α -氨基酸脱氢酶(II)的作用使由所述NADPH生成的氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)转换为NADPH的能力的酶22.根据权利要求21所述的制造方法，其中 所述酶(II)、(III)分别为下述的的酶(II’)、(III’ ) (II’ )具有以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)作为辅酶，通过所述多肽(I)的作用使由氨基供体的α-谷氨酸生成的酮化合物(X)的2-氧代戊二酸还原为α-谷氨酸的能力，且对所述酮化合物(Y)不起作用的α-氨基酸脱氢酶， (III’ )具有通过所述α-氨基酸脱氢酶(II’ )的作用使由所述NADH生成的氧化型β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)转换为NADH的能力的酶23.根据权利要求21或22所述的制造方法，包括 将使用通过将编码所述(I)至(III)的多肽和酶的各DNA导入宿主细胞而得到的转化体和/或其培养物作为酶源24.根据权利要求21或22所述的制造方法，包括 将通过使用分别含有编码所述多肽和酶(I)至(III)的各DNA的多个重组载体或使用含有编码所述多肽和酶(I)至(III)的各DNA的全部的I个重组载体转化宿主细胞而得到的所述⑴至(III)的多肽和酶在同一转化体内表达的转化体和/或其培养物用作酶源25.根据权利要求21~24中任一项所述的制造方法，其中 所述酶(II)为谷氨酸脱氢酶，所述酶(III)为葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶26.根据权利要求21~25中任一项所述的制造方法，其中 所述酶(II)为源自牛肝脏或酵母或细菌的酶27.根据权利要求21~26中任一项所述的制造方法，其中 所述酶(III)为源自属于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)或硫杆菌属菌种(Thiobacillus sp.)的微生物的酶28.根据权利要求20所述的制造方法，包括 通过在同一反应体系中利用下述多肽和酶(α)至(Y)，在氨基供体的存在下，使酮化合物(Y)转换为与氨基结合的碳原子为不对称点的、对应的光学活性氨基化合物(Z) (α )权利要求1~7中任一项所述的多肽； (β)具有以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作为辅酶，通过所述多肽(α)的作用使由氨基供体的α-氨基酸生成的酮化合物(X)的α-酮酸还原为2-羟基酸的能力，且对所述酮化合物(Y)不起作用的α-酮酸还原酶； (Y)具有通过所述α-酮酸还原酶(β)的作用使由所述NADH生成的氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)转换为NADH的能力，或具有通过所述α -酮酸还原酶(β )的作用使由所述NADPH生成的氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)转换为NADPH的能力的酶29.根据权利要求28所述的制造方法，其中 所述酶(β)、U)为下述酶(β ’)、U’) (β ’)具有以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)作为辅酶，通过所述多肽(α)的作用使由氨基供体的α-谷氨酸生成的酮化合物(X)的2-氧代戊二酸还原为2-羟基戊二酸的能力，且对所述酮化合物(Y)不起作用的α-酮酸还原酶； (Y O具有通过所述α-酮酸还原酶(β ’)的作用使由所述NADH生成的氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)转换为NADH的能力的酶30.根据权利要求28或29所述的制造方法，包括 将使用通过将编码所述U)至(Υ)的多肽和酶的各DNA导入宿主细胞而得到的转化体和/或其培养物作为酶源31.根据权利要求28或29所述的制造方法，包括 将通过使用分别含有编码所述U)至(Υ)的多肽和酶的各DNA的多个重组载体或使用含有编码所述(α )至(Υ )的多肽和酶的各DNA的全部的I个重组载体转化宿主细胞所得到的、所述U)至(Υ)的多肽和酶在同一转化体内表达的转化体和/或其培养物用作酶源32.根据权利要求28~31中任一项所述的制造方法，其中 所述酶(β)为扁桃酸脱氢酶或羟基异己酸脱氢酶，所述酶(Y)为葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶33.根据权利要求28~32中任一项所述的制造方法，其中 所述酶(β)为源自属于干酪乳杆菌(Lactobacilus casei)或融合魏斯氏菌(ffeissela confusa)的微生物的酶34.根据权利要求28~33中任一项所述的制造方法，其中 所述酶(Y)为源自属于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)或硫杆菌属菌种(Thiobacillus sp.)的微生物的酶35.根据权利要求20~34中任一项所述的制造方法，其中， 所述酮化合物(Y)由通式(I)表示，

[0001]本发明涉及能够通过氨基转移反应将酮化合物高效地转换为光学活性氨基化合物的酶和使用该酶的光学活性氨基化合物的制造方法所得到的光学活性氨基化合物能够作为医药品或农药等的中间体利用

本发明提供一种用于从酮化合物廉价且高效地制造作为医药品或农药等的中间体有用的光学活性氨基化合物的方法。对作为氨基供体的谷氨酸显示相比于对作为氨基供体的L-丙氨酸更高的活性，且以93%以上的高的光学纯度生成(S)1-苄基-3-吡咯烷酮的新型具有氨基转移酶活性的多肽、编码该多肽的基因、高表达该基因的转化体。

对于谷氨酸显示高活性的新型氨基转移酶、编码该酶的基因和它们的利用法