一种卡介苗热休克蛋白65和多表位her－2抗原融合蛋白重组蛋白疫苗制作方法

王丽颖, 王宣军, 于永利

2003年4月16日

2001年10月10日

2001年10月10日

北京迪威华宇生物技术有限公司

A61K39/00GK1410127SQ0113634

多表位 卡介苗 休克 蛋白

1.一种重组蛋白疫苗，它是由卡介苗热休克蛋白65和多表位HER-2抗原融合而形成的融合蛋白，其中，所述的多表位HER-2抗原是由选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，和SEQ ID NO4所示的序列中的一个或多个相互连接形成的2.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，其中，卡介苗热休克蛋白65位于该融合蛋白的氨基端，多表位HER-2抗原位于该融合蛋白的羧基端3.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，其中，所述的多表位HER-2抗原具有SEQ ID NO8所示的氨基酸序列4.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，它具有SEQ ID NO6所示的氨基酸序列5.一种编码权利要求1至5中任意一项权利要求所述的重组蛋白疫苗的基因6.按照权利要求6所述的基因，它具有SEQ ID NO5所示的核苷酸序列

本发明涉及一种基因工程重组蛋白疫苗，特别是涉及一种预防和治疗人乳腺癌的疫苗本发明还涉及编码该疫苗的基因HER-2蛋白(以下简称HER-2)由定位于人的第17号染色体的q21的c-erbB-2基因编码，是一种具有酪氨酸激酶的活性跨膜糖蛋白，和表皮生长因子受体有很高的同源性(Tadashi Yamamoto，et al.Similarity ofprotein encoded by the human c-erbB-2 gene to epidermal growth factorreceptor.Nature vol319 16 January 1986，230-234)HER-2编码基因的扩增和过度表达可引起细胞的转化在10-40％的人乳腺肿瘤细胞有HER2蛋白的过度表达，因此，以HER-2为靶点可能研制出预防和治疗乳腺癌的制剂科学家已在这方面进行了多方面的研究Wei WZ等证明，用突变的重组HER-2蛋白免疫小鼠可使其在一定程度上获得抑制表达HER-2的小鼠乳腺细胞的生长的能力(Wei WZ，et al.Protection against mammary tumor growth by vaccination with full-length，modified human ErbB-2 DNA.Int J Cancer 1999 May 31；81(5)748-54)Dakappagari NK等证明，用含B细胞表位的HER-2多肽免疫转基因小鼠，可激发其抑制过度表达HER-2的肿瘤细胞在其体内的生长的机制(Dakappagari NK，et al.Prevention of mammary tumors with a chimericHER2 B cell epitope peptide vaccine，Cancer Res2000 Jul 15；60(14)3782-9)在临床实验中，HER2蛋白特异性单克隆抗体(Herceptin)对过度表达HER-2的乳腺腺瘤有明显的疗效(Dillman RO，Perceptions of Herceptinamonoclonal antibody for the treatment of breast cancer.Cancer BiotherRadiopharm 1999 Feb；14(1)5-10)用HER-2蛋白抗原肽(VLRENTSPK)装载的树突状细胞体外免疫可诱导CTL，此CTL可杀伤表达HLA-3和相应肿瘤抗原的肿瘤细胞(Kawashima I，et al.Identification of HLA-3-restricted cytotoxic T lymphocyte epitopes from carcinoembryonic antigen andHER-2/neu by primary in vitro immunization with peptide-pulsed dendriticcells.Cancer Res1999 Jan 1559(2)431-5)HLA A2限制性HER-2蛋白抗原肽(IISAVVGIL)在结直肠癌患者也可诱生出T细胞反应(Nagorsen D，et al.Natural T cell response against MHC class I epitopes of epithelial celladhesion molecule，her-2/neu，and caicinoembryonic antigen in patients withcolorectal cancer.Cancer Res2000 Sep 1；60(17)4850-4).热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是存在于多种生物体内的一个分子伴侣蛋白质家族在免疫应答的过程中，热休克蛋白可表现如下三种基本的功能1、协助抗原性物质进入包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞；2、在抗原提呈细胞中和加工处理的抗原物质相互作用使之进入MHC I类抗原提呈途径，进而激活抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)；3、刺激树突状细胞表达协同刺激分子(如B7等)和分泌细胞因子近年的研究表明，HSP可使非共键结合的肿瘤抗原在抗原提呈细胞内加工后和MHC I类分子结合并提呈在其表面，有效地激活CTL去高效杀伤表达特异性肿瘤抗原的肿瘤细胞注射从自体肿瘤提取的热休克蛋白-抗原肽复合物可抑制荷瘤小鼠原发肿瘤的生长、降低肿瘤的转移率，延长荷瘤小鼠的生存时间(Tamura Y.Peng P，Liu K，Daou M，Srivastava PK.Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shock proteinpreparations.Science 1997 Oct 3；278(5335)117-20)CTL是人体杀伤肿瘤细胞的最高效的免疫细胞任何一种激发机体抗肿瘤免疫的疫苗是否有效，决定于这种疫苗是否能激发肿瘤特异性CTL外源性的蛋白类肿瘤抗原在免疫人体后，通常被抗原提呈细胞摄取、加工，进入MHC II类提呈途径，激发体液免疫反应(Heikema A，Agsteribbe E，WilschutJ，Huckriede A.Generation of heat shock protein-based vaccines by intracellular loading of gp96 with antigenic peptides.Immunol Lett 1997 Jun 1；57(1-3)69-74)，但不能有效激活肿瘤特异性的CTL的产生，因而不能产生有效的肿瘤预防和治疗作用因此，赋予多表位HER-2抗原基因工程疫苗特异性激活CTL的性质就成为研究以HER-2多表位为抗原的、预防和治疗人乳腺癌疫苗的一个技术关键本发明的另一个目的是提供一种编码本发明的疫苗的基因本发明提供了一种重组蛋白疫苗，它是由卡介苗热休克蛋白65和多表位HER-2抗原融合而形成的融合蛋白，其中，所述的多表位HER-2抗原是由选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，和SEQ IDNO4所示的序列中的一个或多个相互连接形成的本发明的重组蛋白疫苗中，卡介苗热休克蛋白65可以位于该融合蛋白的氨基端，多表位HER-2抗原位于该融合蛋白的羧基端本发明的重组蛋白疫苗中，所述的多表位HER-2抗原最好具有SEQ ID NO8所示的氨基酸序列本发明的重组蛋白疫苗最优选具有SEQ ID NO6所示的氨基酸序列本发明还提供了一种编码本发明的重组蛋白疫苗的基因该基因可以具有SEQ ID NO5所示的核苷酸序列多表位HER-2抗原是由多个人HER-2蛋白分子中的抗原表位相连接形成的多肽，由HER-2分子上的4个肽段组成，序列可以如SEQ ID NO8所示将多表位HER-2抗原和卡介苗热休克蛋白65融合形成的融合蛋白(序列可以如SEQ ID NO5所示)在进入人体后可刺激人体的细胞毒性T细胞(CTL)发动对表达HER-2的乳腺癌细胞的攻击和杀伤，因而对乳腺癌有预防和治疗的作用一个CTL表位可由8个氨基酸残基组成，因而SEQ ID NO4所示的多表位HER-2抗原可含有多个CTL表位多表位HER-2抗原由HER-2蛋白的四个肽段组成，它们的序列分别是Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe AlaGly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp GlyAsp Pro Ala Ser Asn Thr AlaPro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val PheGluThr Leu Glu Glu Ile(SEQ ID NO1)；Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu(SEQ ID NO2)；Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val(SEQ ID NO3)；Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu(SEQ ID NO4)我们将这四个肽段的编码基因相连在一起，生成了一种新的基因，这一基因编码编码的多肽即为多表位HER-2抗原在多表位HER-2抗原进行人工点突变或以插入、两侧连接的方式进行改造所得的多肽也和可能表现预防和治疗乳腺癌的作用将单一CTL表位HER-2抗原和卡介苗热休克蛋白65融合形成的融合蛋白，在进入人体后可刺激人体的细胞毒性T细胞(CTL)发动对表达HER-2的乳腺癌细胞攻击和杀伤细胞，因而对乳腺癌有预防和治疗的作用，但其作用弱于将多表位HER-2抗原和卡介苗热休克蛋白65融合形成的融合蛋白卡介苗热休克蛋白65是一种来源于卡介苗的蛋白质，它在和多表位HER-2抗原形成融合蛋白后，可以协助多表位HER-2抗原进入包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞，并进入MHC I类途径加工提呈，进而激活抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)对表达HER-2的乳腺癌细胞进行攻击和杀伤此外，卡介苗热休克蛋白65还可刺激包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞表达协同刺激分子(如B7等)和分泌细胞因子，这些协同刺激分子(如B7等)和细胞因子可激活细胞毒性T淋巴细胞的肿瘤细胞杀伤能力本发明的重组蛋白疫苗具有SEQID NO2所示的氨基酸序列本发明还提供了一种编码本发明的重组蛋白疫苗的基因该基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列所述的HER-2多表位基因的序列具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；所述的HER-2多表位基因编码的氨基酸的序列是SEQ ID NO4所示的氨基酸序列本发明的重组蛋白疫苗可通过已知的方法进行生产提取卡介苗基因组DNA的方法参照Molecular Cloning一书(J.Sambrook，Isolation of high-molecular-weight DNA from mammaliancells，9.16-9.22，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecularcloning，1989)采用PCR方法自卡介苗分离热休克蛋白65(HSP65)结构基因采用的5’端引物序列为5’CCATG GCC AAG ACA ATT GCG3’，3’(SEQID NO21)端引物序列为5’ACC GAA TTC GCT AGC CAT ATG GAA ATC CATGCC ACC CAT 3’(SEQ ID NO22)所述PCR操作程序是在一500μl微量离心管中加入下列试剂模板cDNA 5μl(mmol/L)10×PCR缓冲液(含氯化镁)5μldNTPs(10mmol/L)1μl5’端和3’端引物(0.01mmol/L)各0.5μlTaq DNA聚合酶(5u/μl)0.25μl加去离子水至终体积50μl混合后加入矿物油3滴反应条件94℃，30″；55℃，1’；72℃，2’，30个循环周期后，72℃延伸10分钟采用TA克隆方法克隆PCR产物，方法见文献(于永利，麻彤辉，杨贵贞.TA克隆及双链DNA测序介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法.中国免疫学杂志，1994，10(1)5)按常规方法(J.Sambrook，Polyacrylamide gel electrophoresis1.21-1.32，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)提取质粒，采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行序列测定PCR的反应条件为94℃，30″；55℃，1’；72℃，4’，30个循环周期后，72℃延伸10分钟20×TAE缓冲液0.8mol/L Tris base0.4mol/L NaOAc0.04mol/L Na2 EDTA用冰醋酸调pH8.3在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的DNA电泳带将含DNA区带的琼脂糖凝胶切下，置-70℃冷冻15分钟，然后在65℃水浴中使胶融化；加入等倍体积TE-饱合酚，剧烈振荡30秒钟，然后-70℃冷冻15分钟；室温融化后，12,000rpm离心5分钟，将上层液相移至另一管中，用2-2.5倍乙醇沉淀、洗涤和干燥DNA将经EcoRI消化的结核杆菌(卡介苗)65KD热休克蛋白(HSP65)的编码基因和多表位HER-2抗原基因用连接酶连接连接反应结核杆菌(卡介苗)65KD热休克蛋白(HSP65)基因DNA(0.5μg/μl)2μl多表位HER-2抗原基因DNA(50ng/μl)2μl10×连接缓冲液(见Protocols and Applications Guide，p57，PromegaCorporation，Second Edition，1991)1μlT4 DNA连接酶1μl用双蒸水补齐至10μl混合后置14-16℃水浴6-12小时在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的DNA电泳带将含DNA区带的琼脂糖凝胶切下，置-70℃冷冻15分钟，然后在65℃水浴中使胶融化；加入等倍体积TE-饱合酚，剧烈振荡30秒钟，然后-70℃冷冻15分钟；室温融化后，12,000rpm离心5分钟，将上层液相移至另一管中，用2-2.5倍乙醇沉淀、洗涤和干燥DNA将回收的DNA片段克隆入经限制性内切酶NcoI和HindIII消化的原核细胞表达载体pET-28a(+)质粒(美国Novagen公司)的6聚组氨酸(histidine)密码子的上游质粒DNA的消化反应1μg质粒DNA1μl 10×缓冲液(见Promega Corporation产品说明书)1μl限制性内切酶NcoI(10单位/μl)1μl限制性内切酶HindIII(10单位/μl)用双蒸水补齐至10μl混合后37℃温育30-120分钟连接反应质粒DNA(0.5μg/μl)2μlDNA插入片段(300ng/μl)5μl10×连接缓冲液(见Protocols and Applications Guide，p57，Promega Corporation，Second Edition，1991)1μlT4 DNA连接酶1μl用双蒸水补齐至10μl混合后置14-16℃水浴6-12小时将含卡介苗HSP-65-多表位HER-2抗原基因融合基因的重组pET-28a(+)质粒转化大肠杆菌感受态细胞的制备a、将大肠杆菌在LB琼脂培养基上划线，37℃培养12-16小时；b、次日从琼脂平板上取一单菌落于2ml LB培养基中，37℃以225rpm速度震荡培养12-16小时；c、取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中，37℃以225rpm的速度震荡培养直至OD值为0.5左右(大约3小时)；d、将菌液冰浴2小时，然后2,500Xg，4℃离心20分钟收集菌体；e、加入100ml冰冷的Trituration缓冲液(100mmol/LCaCl2，70mmol/L MgCl2，40mmol/L醋酸钠，pH5.5)，混匀，置冰上45分钟；f、l,800Xg，4℃离心10分钟，弃上清，加入10ml冰冷的Trituration缓冲液悬浮细胞；g.按每份200ul分装，4℃可保存1-2周若需长期保存，可加甘油至终浓度为15％，置-70℃备用转化方法a、将200ul感受态细胞置冰上融化，然后加入3ul DMSO或β-巯基乙醇，混合后，加入3-5μl连接反应液(含重组质粒)，温和混匀，置冰上30分钟；b、42℃ 45秒，然后迅速放回冰中1-2分钟；c、加入2ml LB培养液，37℃以225rpm的速度摇荡培养1小时；d、4,000Xg离心10秒钟，弃上清，用200ul LB培养液重悬菌体；e、将菌液铺于含有适当抗生素的LB琼脂培养板上，涂匀，室温放置20-30分钟，倒置于37℃孵箱中培养12-16小时用限制性内切酶消化的方法鉴定重组克隆f、质粒和菌株的保存质粒冰冻保存于-20℃菌株在含20-50％甘油培养液中保存于-20℃或-70℃卡介苗HSP-65和人多表位HER-2抗原基因的融合基因的测序(采用双脱氧末端终止法，具体方法见文献于永利，麻彤辉，杨贵贞.TA克隆及双链DNA测序介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法.中国免疫学杂志，1994，10(1)5)结果表明，所得到的卡介苗HSP-65和人多表位HER-2抗原基因的融合基因和设计的完全一致缓冲液A(1000ml)的配制终浓度1mol/L Tris.HCL(pH7.9)50ml 50mmol/L0.5mol/L EDTA 1ml 0.5mmol/L5mol/L NaCL 10ml 50mmol/L100％ 甘油50ml 5％用台式超声细胞破碎仪(SANYO，MSE SONIPREP150)，设8个循环和50％的时间间隔，在冰浴中超声90秒破菌，搅拌10-20min加DOC，使终浓度为0.2％(即，加约240ul的20％脱氧胆酸钠(DOC)混匀，静置10min20％脱氧胆酸钠(DOC)贮存液应提前1天配制，配方为10g无水DOC，溶于水中，调体积至50ml得粗制裂解物(A)13000rpm，4℃离心10min轻轻倾出上清加18ml缓冲液A和2ml 20％DOC贮存液于包涵体沉淀用组织破碎器充分重悬沉淀，室温下静置至少10分钟将悬液于4℃离心10min，13000rpm加39.4ml缓冲液A和0.6ml 20％十二烷基肌氨酸钠(SKL)储液(SKL净浓度为0.3％)剧烈搅动使沉淀慢慢溶解静置至少30分钟十二烷基肌氨酸钠(SKL)储液10g无水十二烷基肌氨酸钠(SKL)，溶于H2O中，调体积至50ml将悬液于4℃离心10min，13000rpm用缓冲液A+0.3％ SKL稀释溶解的蛋白质使其浓度为lmg/ml用缓冲液A将溶解的蛋白质稀释10倍，使其浓度为0.1mg/ml，SKL的终浓度为0.03％在4℃溶解的蛋白质制备物(体积约为400ml)对缓冲液A(体积约为4000ml)透析8小时，同时充分搅拌然后换新鲜缓冲液并重复从透析袋(口径1cm)中移出经透析的蛋白质溶液，4℃、8000rpm离心20min，去除所有的的聚集物留取上清，做镊-Saphrose-4-B层析分离HSP-65和前列腺特异性抗原(PSA)的T细胞表位的融合基因融合蛋白采用常规的SDS-PAGE方法(J.Sambrook，Polyacrylamide gelelectrophoresis 6.36-6.49，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)鉴定HSP-65和HER-2多表位基因融合蛋白纯度为97％一、体内抑制转染HER-2 SP2/0细胞生长实验1、材料转染HER-2 SP2/0细胞SP2/0细胞是来源于BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞，为H-2d单倍型转染HER-2 SP2/0细胞可在小鼠形成原位实体肿瘤2、实验动物7周的雄性BALB/c小鼠，疫苗组和对照组各20只3、实验方法1)采用DMEM培养基培养转染HER-2的SP2/0细胞在DMEM培养基中含10％的灭活胎牛血清，2mM L-谷胱甘肽，100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素在注射之前，用无血清DMEM将细胞洗三次每只小鼠注射2×105个转染HER-2的SP2/0细胞，注射部位是小鼠两肩胛骨间皮下在接种疫苗后的第25天，测量小鼠肿瘤块基底部的面积2)在接种肿瘤30天前和15天前，疫苗组分别腹腔注射100μg卡介苗热休克蛋白65和多表位HER-2抗原融合蛋白重组蛋白疫苗；对照组分别腹腔注射同疫苗组同体积生理盐水4、实验结果及结论动物肿瘤块基底部面积的平均值疫苗组为30mm2，对照组为200mm2结论是此卡介苗热休克蛋白65和多表位HER-2抗原融合蛋白重组蛋白疫苗能明显抑制表达HER-2的肿瘤细胞的生长二、体内延长转染HER-2 SP2/0细胞成瘤潜伏期实验1、材料转染HER-2 SP2/0细胞SP2/0细胞是来源于BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞，为H-2d单倍型转染HER-2 SP2/0细胞可在小鼠形成原位实体肿瘤2、实验动物7周的雄性BALB/c小鼠，疫苗组和对照组各20只3、实验方法1)采用DMEM培养基培养转染HER-2的SP2/0细胞在DMEM培养基中含10％的灭活胎牛血清，2mM L-谷胱甘肽，100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素在注射之前，用无血清DMEM将细胞洗三次每只小鼠注射2×105个转染HER-2的SP2/0细胞，注射部位是小鼠两肩胛骨间皮下在接种疫苗后的第15天开始，每天测量小鼠肿瘤的形成情况，以可触摸到肿瘤块的时间为肿瘤出现的天数2)在接种肿瘤30天前和15天前，疫苗组分别腹腔注射100μg卡介苗热休克蛋白65和多表位HER-2抗原融合蛋白重组蛋白疫苗；对照组分别腹腔注射同疫苗组同体积生理盐水4、实验结果及结论动物肿瘤出现的平均天数疫苗组为60.3天，对照组为16.9天结论是此卡介苗热休克蛋白65和多表位HER-2抗原融合蛋白重组蛋白疫苗能明显抑制表达HER-2的肿瘤细胞形成肿瘤序列表<110>北京迪威华宇生物技术有限公司<120>一种卡介苗热休克蛋白65和多表位HER-2抗原融合蛋白重组蛋白疫苗<130>I2001265<160>22<170>PatentIn version3.1<210>1<211>60<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln1 5 10 15Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro20 25 30Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro35 40 45Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile50 55 60<210>2<211>17<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys1 5 10 15Glu<210>3<211>17<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val1 5 10 15Val<210>4<211>18<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg1 5 10 15Leu Leu<210>5<211>2016<212>DNA<213>Artificial<220><221>CDS<222>(1)..(2016)<223><400>5atg gcc aag aca att gcg tac gac gaa gag gcc cgt cgc ggc ctc gag48Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu1 5 10 15cgg ggc ttg aac gcc ctc gcc gat gcg gta aag gtg aca ttg ggc ccc96Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro20 25 30aag ggc cgc aac gtc gtc ctg gaa aag aag tgg ggt gcc ccc acg atc144Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile35 40 45acc aac gat ggt gtg tcc atc gcc aag gag atc gag ctg gag gat ccg192Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro50 55 60tac gag aag atc ggc gcc gag ctg gtc aaa gag gta gcc aag aag acc240Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr65 70 75 80gat gac gtc gcc ggt gac 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