专利名称：一种基于单域抗体的抗原表位展示方法表位是蛋白质抗原的一部分，是蛋白质抗原性的基础，抗体的特异性是针对表位的。由于表位一般仅由几个到十几个氨基酸组成，合成单独的抗原表位肽由于其分子较小，一般没有或仅有极微弱的免疫原性。为增强抗原表位肽的免疫原性，一般是 将表位肽与载体蛋白如牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、破伤风类毒素等相偶联，或者与具有佐剂活性的脂质分子共价连接，形成脂肽，也可将抗原表位肽连接于分支状的多聚赖氨酸骨架上，形成一种具有独特三维空间结构的大分子，用以诱导针对表位的免疫应答。这些方法的不足之处是，偶联过程复杂，需要化学合成和纯化，脂肽和多聚赖氨酸骨架制备困难，并且费用较高，所以，其应用受到限制。另外，对于一些空间表位，合成的表位肽几乎不能模拟其在蛋白质抗原分子中的天然构象。因此，建立合适的抗原表位展示方法，有效展示外源抗原的表位肽对于复杂抗原的抗体制备和表位疫苗的设计具有重要意义。对于一般抗体而言，其结合抗原表位的部位由抗体的重链可变区(variabledomain of heavy chain, VH)和轻链可变区(variable domain of light chain, VL)共同构成，但二者对抗原结合的贡献是不同的。一般情况下，VH发挥主要作用，单独的VH仍具有抗原结合能力，但是VL的缺乏将使VH对抗原的亲和力降低，并且易于积聚和沉淀。1989 年，Ward 等(Nature 1989，341 :544-546)首次制备了仅由抗体的 VH 区构成的基因工程抗体，因为仅由一个结构域组成，故称之为单域抗体(single domainantibody)。之后,通过克隆一般抗体的可变区而构建的单域抗体在亲和力和稳定性等方面有了很大提高，但是这类抗体的工程化改造不具有普遍性。因此，分子较小的单域抗体的应用前景受到人们的怀疑。1993 年，Hamers-Casterman 等(Nature 1993,363 :446-448)报道了在胳5它血清中大量存在一种天然缺失轻链的抗体，即重链抗体(heavy chain antibody)。重链抗体在骆驼的体液免疫中发挥着重要的作用。与一般抗体相比，重链抗体除了缺少轻链之外，重链抗体的重链可变区(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody,VHH)还具有不同于一般抗体可变区(variable domain of heavy chain of conventionalantibody, VH)的特征，骆驼的VHH基因通过在几个重要功能位点的选择性进化维持了重链抗体的正常功能，也就是说重链抗体的VHH可以在缺少轻链可变区的情况下单独折叠成稳定的结构，并保持其抗原结合活性。构建自骆驼、鲨鱼等重链抗体的单域抗体具有热稳定性好、可溶性好、亲和力高等特点，并且由于其分子较小，仅为12-15kD左右，因此，其在肿瘤成像、亲和纯化等方面具有较好的应用前景。对于单域抗体，人们更多的还是将其作为一种小分子量的抗体去应用。单域抗体分子虽小，但结构相对稳定，特别是构建自骆驼、鲨鱼等重链抗体的单域抗体具有较好的热稳定性和可溶解性。在单域抗体的三个抗原互补决定区(complementarity-determining region, Q)R)中，抗原互补决定区 3 (Q)R3)在与抗原的结合中发挥主要作用，CDR3的长度变化范围较大，能够形成丰富的构象以参与结合抗原，换一种角度看，也就是说CDR3区能够展示不同长度的肽段，形成各种不同的构象，因此，单域抗体的CDR3应该是一种理想的抗原表位展示部位。基于以上考虑，本发明建立了基于单域抗体骨架的抗原表位展示方法，利用单域抗体的CDR3区展示外源抗原表位，使抗原表位形成稳定的、更接近于其在天然抗原中的构象。利用该抗原表位展示方法，可以制备复杂抗原的替代抗原，用于制备针对复杂抗原的抗体。另外，如果用该方法有效展示来源于病原微生物抗原、肿瘤抗原等的特定表位，则这些重组小蛋白可直接作为疫苗，用于疾病的预防和治疗。
本发明的目的就是建立一种新的抗原表位展示方法，实现抗原表位的有效展示， 以解决目前化学合成的表位肽免疫原性差，以及通过化学偶联法制备表位肽免疫原技术复杂、成本高的问题。为实现上述目的，本发明实施了以下技术方案本发明提供了一种基于单域抗体的抗原表位展示方法，即为利用单域抗体为分子骨架，利用单域抗体的互补决定区3即CDR3为外源目标抗原表位展示部位。本发明还提供了一种基于单域抗体的抗原表位展示方法，即为利用单域抗体为分子骨架，利用单域抗体的CDR3为外源目标抗原表位展示部位，用外源目标抗原表位序列替换⑶R3区序列。所述单域抗体构建自重链抗体的重链可变区。所述单域抗体构建自骆驼类或鲨鱼类重链抗体的重链可变区。所述单域抗体包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO : 7所示的单域抗体骨架序列。所述单域抗体构建自含轻链和重链的常规抗体的重链可变区。所述单域抗体构建自人或鼠抗体的重链可变区。所述单域抗体包含SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 10所示的单域抗体骨架序列。所述外源抗原表位为肽类表位。所述外源抗原表位为包含或“EQKLISEEDL”或“YPDEIEHFKP”或“ ATLRETYGE ”氨基酸序列的肽类表位。本发明提供了一种基于单域抗体的抗原表位展示方法，具体包括如下步骤(I)确定一种重链抗体的重链可变区的完整的氨基酸序列，以此序列作为单域抗体的氨基酸序列，并分析出其CDR3区的序列；(2)用外源抗原表位氨基酸序列替换单域抗体的CDR3区氨基酸序列，并将替换后的全长氨基酸序列转换为其基因编码序列，合成全长基因序列，并将其克隆到表达载体中，得到重组质粒；(3)将得到的重组质粒转化至相应的宿主细胞内，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白就展示有外源抗原表位。本发明还提供了一种基于单域抗体的抗原表位展示方法，具体包括如下步骤(I)确定含轻链和重链的常规抗体的重链可变区的完整氨基酸序列，此序列即为单域抗体的基础氨基酸序列，分析出其框架区2 (FR2)和CDR3区的序列；(2)将FR2区的第9、10和12位的氨基酸分别替换为谷氨酸、精氨酸和甘氨酸，并用外源抗原表位氨基酸序列替换单域抗体的CDR3区氨基酸序列，并将替换后的全长氨基酸序列转换为其基因编码序列，合成全长基因序列，并将其克隆到表达载体中，得到重组质粒;(3)将得到的重组质粒转化至相应的宿主细胞内，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白就展示有外源抗原表位。本发明还提供了根据上述的基于单域抗体的抗原表位展示方法得到的包含有外源抗原表位的蛋白。 本发明还提供了上述蛋白在制备单克隆抗体领域中的用途。本发明还提供了上述蛋白在制备疫苗领域中的用途。本发明还提供了一种单域抗体在展示外源抗原表位中的用途。本发明所述的上述技术方案与现有技术相比具有以下优点1、所述基于单域抗体骨架的抗原表位展示方法，可用于展示某一小肽分子，这种展示有外源小肽的重组蛋白可替代小肽作为免疫原免疫动物，制备针对小肽的抗体，克服了小肽直接作为免疫原存在的免疫原性差的问题；2、利用本发明所述的基于单域抗体骨架的抗原表位展示方法制备表位肽免疫原，避免了通过化学偶联技术制备表位肽免疫原存在的技术复杂、成本高的问题。本发明所述的抗原表位展示方法还具有广泛的潜在应用领域，如可用于展示某抗原分子上的某一表位，这种展示有外源抗原表位的重组蛋白，可作为某抗原的替代抗原直接用于免疫动物，制备针对该表位的抗体，如果制备的抗体能特异性识别相应的抗原，则通过这种技术就实现了在无相应抗原的情况下制备了该抗原的抗体。本发明所述的抗原表位展示方法也可用于蛋白质表位疫苗的制备。例如，利用该表位展示方法展示病原微生物或肿瘤抗原的中和性抗原表位，这种展示有中和性抗原表位的重组蛋白可直接作为疫苗，用于免疫动物，让动物产生针对中和性表位的抗体，从而在体内清除相应的病原微生物或抑制肿瘤的生长。为了使本发明的内容更容易被理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中图I为实施例I所述的骆驼重链抗体的重链可变区(VHH)的氨基酸序列；* :双划线部分为CDR3区；图2为实施例I所述展示(His)6表位的骆驼单域抗体骨架的氨基酸序列；* :双划线部分为(His)6表位；图3为实施例I所述展示(His)6表位的骆驼抗体骨架基因编码序列；* :双划线部分为限制性核酸内切酶酶切位点；倾斜部分为终止码序列；图4为实施例I中应用ELISA法检测基于骆驼单域抗体骨架展示的(His)6表位的小鼠免疫效果；图5为实施例2所述一种人抗体重链可变区(VH)的氨基酸序列；* :双划线部分为框架区2 (FR2)；单下划线部分为⑶R3区；图6为实施例2所述展示c-myc表位的人源单域抗体骨架的氨基酸序列；* :双划线部分为框架区2 (FR2)；加框部分为人工改变的氨基酸残基；单下划线部分为c-myc表位序列；图7为实施例2所述展示c-myc表位的人单域抗体骨架的基因编码序列；* :双划线部分为限制性核酸内切酶酶切位点；图8为实施例2所述应用ELISA法检测人源单域抗体骨架展示的c-myc表位对家兔的免疫效果。图9为实施例3所述的一种鲨鱼的单域抗体的氨基酸序列* :单下划线部分为⑶R3区；图10为实施例3所述的展示人血管内皮生长因子抗原表位的鲨鱼单域抗体的氨基酸序列* :单下划线部分为人血管内皮生长因子抗原表位序列；图11为实施例3所述的展示人血管内皮生长因子抗原表位的鲨鱼单域抗体的编码基因序列* :单下划线部分为酶切位点；图12为实施例3所述的展示人血管内皮生长因子抗原表位的鲨鱼单域抗体的免疫原性检测图13为实施例4所述的一种小鼠抗体的氨基酸序列* :双下划线部分为⑶R3区，单下划线部分位FR2区；图14为实施例4所述的展示人白蛋白抗原表位的小鼠单域抗体的氨基酸序列* :双下划线部分为人白蛋白抗原表位序列，斜体部分为改变后的氨基酸残基；图15为实施例4所述的展示人白蛋白抗原表位的小鼠单域抗体的编码基因序列* :双下划线部分为酶切位点；图16为实施例4所述的展示人白蛋白抗原表位的小鼠单域抗体的免疫原性检测。



本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于单域抗体的抗原表位展示方法。具体地讲，本发明利用单域抗体的CDR3区展示外源抗原表位，这种在其分子表面展示外源抗原表位的单域抗体骨架蛋白可用于制备针对表位小肽的抗体，也可作为外源抗原之替代抗原，用于免疫动物、制备针对外源抗原的抗体。此外，基于单域抗体骨架的抗原表位展示方法还可用于制备表位疫苗。