专利名称：一种生物医学工程用角蛋白材料的制备方法人头发是人体唯一可以体外大量获得的人源蛋白质，其物理性质具有很强的机械性能即韧性、弹性和抗拉伸性，其优越的物理性能显示出了在生物工程材料科学领域中发展的潜在能力。再则，由于取材容易，对供体无损伤，可反复取材。早在上个世纪60年代头发作为生物学材料引起了学者们的注意(United States Patent 2993794 Process for preparing keratin protein)。人发的结构和成分毛发来自于角化上皮组织，是皮肤细胞特化形式。从横断面来看，人发由外到内可分为表皮层、皮质层和髓质层三层。表皮层是由许多细小的鳞片(又称毛鳞片)重叠而成，属于保护层；皮质层被毛小皮覆盖，由成束的角蛋白构成，是头发最主要的部分，决定头发的弹性、强度与屈曲性；毛髓质则是头发的中心部分。人类毛发主要成分为含硫较多的角质蛋白，其肽链间存在着广泛而紧密的交联，二硫键、氢键、盐式键、酯键、范德华引力等横向连呈现高度的空间稳定性。其性质稳定，对理、化因素的影响有着高度的抵抗力。在上个世纪很难获得可溶性的生物工程用的角蛋白材料。又由于一种临床现象 “向内生长的毛发会导致皮肤的局部炎症反应，有时甚至形成脓肿”。长期以来使人们误认为头发为抗原成分。上述两个原因一直阻碍头发作为生物工程学材料的发展。然而， 科学家们从来没有停止对头发作为生物学材料探索的步伐。第一，在临床上证明自身毛发因意外埋藏于软组织内多年，软组织周围并未出现瘢痕组织；1996年，阎瑞常和肖霞将人发与丝线、尼龙线和无损伤线进行对照。用于缝合动物伤口，结果发现人发组的愈合最好，头发与人体组织有好的相容性被普遍证实了。第二，可溶性人发角蛋白的获取得到了较大的进展，中国专利021553 . 9公开了“一种角蛋白溶液和固体制备技术”和美国专利 59325520 Keratin-based hydrogel for biomedical applications and method of production。第三，角蛋白还具有神奇的分子间自我重组功能，能够自发形成三维立体网状结构.这种分子间自我重组是从纳米级构建成微米级结构，终形成一种均勻、多孔的复杂结构体。在上述实践和理论的基础上，近年来有了许多人发角蛋白材料的生物工程专利，包括United States Patent 5358935，Nonantigenic keratinous protein material ；United States Patent 6165496，Keratin—based sheet material for biomedical applications and method of production ；United States Patent 6432435，Keratin-based tissue engineering scaffold ；United States Patent 7297342，Orthopaedic materials derived from keratin。在专利的基础上，美国KERAPLAST公司和新西兰KERATEC公司三种角蛋白创面覆盖材料Keraderm，Kerafoam和Keragel已经获得注册、并允许上市。除此之外，近年的研究发现人角蛋白在人体组织损伤修复工程中，特别是神经损伤和皮肤组织再生中发挥作用。在神经导向修复，细胞生长支架均显示了良好的应用前景。多年来，建立了多种获取溶解角蛋白方法具体的有氧化法、还原法、酸性法、碱性法以及铜胺溶液法等。其原理均是利用含不同功能的试剂组成混合溶剂来破坏蛋白质肽链间的二硫键、氢键的相互作用，从而制成不同浓度、不同分子量分布的角蛋白溶液。随着角蛋白生物材料的研究的深入，以及对其性能需求的提高暴露了角蛋白传统生产工艺的问题其一使用的强酸、强碱，强还原、强氧化法试剂组靶向性不好，除了破坏了蛋白的二硫键和氢键外对蛋白的一级结构肽键破坏严重，所获再生蛋白分子量较低，而再生角蛋白的分子量大小与其材料强度成正比。其二传统技术利用了大量无机酸和还原剂等环境不友好型试剂，生产工艺复杂，环境后续处理有大量问题。(中国专利10011389. 6—种角蛋白溶液的制备方法)，在纺织行业采用了离子液体法获取羊毛角蛋白，克服了上述存在问题。离子液体解离角蛋白方法的优势在于(1)液体状态温度范围宽，其熔点在一 96°C至300°C以上。且具有良好的物理和化学稳定性。(2)通常无色无臭，蒸汽压低，不易挥发，消除了有机物质挥发而导致的环境污染问题。(3)对大量的无机和有机物质具有良好的溶解能力，并具有溶剂和催化剂的双重功能，可作为许多化学反应的溶剂或催化活性载体。(4)具有较大的极性可调控性，可以形成两相或多相体系，适合用作分离溶剂或构成反应一分离耦合新体系。(5)具有可设计性，离子液体性质可以通过调节阴阳离子的种类进行组合，被称之为“绿色可设计溶剂”，理论上可根据需要，设计出满足不同体系需求种类的离子液体。(6)对蛋白一级结构破坏小，利于角蛋白分子再结合，所获材料强度优于其它方法。本发明借鉴了在纺织领域的离子液体技术，结合了生物工程材料所必需的纯化技术和测定技术，形成了自身特色的发明工艺路线(1)原料为人头发和人指甲，原料用水洗、干燥、乙醇脱脂、干燥。(2)用15%的H2O2IOOml中含Ig次氯酸钙漂白M小时、水洗、60°C干燥原料。(3)按1-15%重量入氯化咪唑盐系列离子液体，在100_150°C下，搅动溶解2-10小时。便可得到含角蛋白胶态离子液体。(4)用水透析或反渗透方法替换离子液体。可以获得水溶的角蛋白液体。(5)凝胶态角蛋白也可以投入乙腈或甲醇中，角蛋白析出，干燥成粉状直接压塑成膜片状、颗粒型、各种异型结构。(6)检测氯化咪唑盐残留，溶解液为冰醋酸-丙酮(1 9)，展开液乙酸乙酯-丙酮-水-浓氨(90 6 2 1)，薄层在紫外光MOnm下观察。(7)通过加热含水离子液体，蒸发掉水，离子液体可以重复利用。本发明借鉴了纺织行业离子液体对羊毛和蚕丝的处理方法，其优点是保留了头发角蛋白的一级结构，一级结构再聚合后可以获得机械强度更佳即更强的韧性、弹性和抗拉伸性能材料。
本发明包括使用本方法产生的角蛋白而制成的凝胶、片状、颗粒状、各种异形状的生物工程用材料。由此而衍生的结缔组织替代材料和细胞生长的支持材料。实例1 (1)原料为人头发和人指甲，原料用水洗、干燥、乙醇脱脂、干燥。(2)用15%的H2O2IOOml中含Ig次氯酸钙漂白、水洗、干燥原料。(3)按1-15%重量入氯化咪唑盐系列离子液体，在100-150°C下，搅动溶解2-10小时。便可得到含角蛋白胶态离子液体。(4)用水透析方法去除离子液体。收获水溶角蛋白溶液。(5)水凝胶态角蛋白可以直接塑成膜片状、颗粒型、各种异型结构后干燥。(6)检测氯化咪唑盐残留，溶解液为冰醋酸-丙酮(1 9)，展开液乙酸乙酯-丙酮-水-浓氨(90 6 2 1)，薄层在紫外光MOnm下观察。。(7)通过加热含水离子液体，蒸发掉水份，离子液体可以回收重复利用。实例2:(1)原料为人头发和人指甲，原料用水洗、干燥、乙醇脱脂、干燥。(2) H2O2+次氯酸钙漂白、水洗、干燥。(3)按1-15%重量入氯化咪唑盐系列离子液体，在100_150°C下，搅动溶解2-10小时。便可得到胶态角蛋白离子液体。(4)胶态角蛋白离子液体投入乙腈或甲醇中，角蛋白析出，干燥成粉状直接压塑成膜片状、颗粒型、各种异型结构。(5)检测氯化咪唑盐残留，溶解液为冰醋酸-丙酮(1 9)，展开液乙酸乙酯-丙酮-水-浓氨(90 6 2 1)，薄层在紫外光MOnm下观察。(6)通过加热含水离子液体，挥发掉乙腈或甲醇，离子液体可以回收重复利用。本发明是生物医学工程领域使用的角蛋白材料的制备。原料为人头发和人指甲，原料用水洗、干燥、漂白、水洗、干燥，按1-15％重量入氯化咪唑盐系列离子液体，在100-150℃下，搅动溶解2-10小时。便可得到胶态角蛋白离子液体。胶态角蛋白离子液体用水透析方法去除离子液体，获得交联的角蛋白水凝胶溶液。胶态角蛋白离子液体也可以喷入甲醇或乙腈中，析出角蛋白干燥、研磨成粉。角蛋白可压制成膜片状、颗粒型、各种异型结构后干燥。经过上述过程后检测氯化咪唑盐残留量。所获得的角蛋白材料适用于生物医学工程使用的损伤的修复材料、皮肤被覆材料、医学美容用材料和防组织粘连材料。