专利名称：一种肥胖基因易感性和预警检测试剂盒的制作方法肥胖已经成为全球日趋严重的“流行病”，已经成为全球性的重要健康问题。WHO指出，肥胖是一种疾病，它不仅仅是体型外貌问题，也是糖尿病、心血管疾病甚至肿瘤发病的独立危险因素。肥胖者常伴有胰岛素抵抗，并常与糖尿病、血脂异常、动脉粥样硬化、高血压等集结出现。因此，对肥胖症的早期预防与控制成为预防心脑血管疾病、肿瘤发生的重中之重。大量研究表明，环境因素和遗传因素在肥胖的发生和发展中发挥重要的作用，遗传因素增加了机体发生肥胖的危险性。肥胖风险的高低是遗传基础(内因)和暴露环境因素(生活习惯、生活方式、饮食特点和运动量等外因)相互作用的结果，决定某个个体是否易于患病，称之为易患性(liability)。肥胖属于多基因遗传病，其发生并非是某个单一基因作用的结果，而是若干作用微小但有累积效应的致病基因决定某个个体患病的风险，称之为易感性(susceptibility)。脂联素是脂肪组织特异性分泌的一种胶原样细胞因子。脂联素由244个氨基酸组成，脂联素在血浆中含量丰富。大量研究证实，血浆脂联素水平与体重指数(BMI)、胰岛素和甘油三脂(TG)水平呈 负相关。人脂联素基因(Adiponectin gene或者APM1)定位于染色体3q27，大小为17kb，由3个外显子和2个内含子组成。临床研究表明，脂联素基因多态性位点与肥胖有关。体脂量和肥胖症相关基因(fat-massand obesity-associated gene, FTO)位于染色体16ql2，属于非血红色加双氧酶家族，编码22酮戊二酸2依赖型核酸脱甲基酶。2007年，Frayling等率先报道了位于FTO基因第I内含子的rs9939609与成人和儿童肥胖具高度相关性，随后在欧洲儿项独立研究中，也分别报道了该基因多态性与高加索人群、西班牙人群BMI和肥胖的相关性。此后大量的研究证实，在中国汉族入中rs8050136、rs9939609多态性均与肥胖风险有密切的关联性。大量实验证实，G蛋白B3亚单位(G-protein 133 subunit,GNB3)基因第10外显子多态位点C825T的单核苷酸多态性与肥胖存在相关性。研究还发现，GNB 3基因中第10个外显子的825位，发生了胞嘧啶核苷酸(C)和胸腺核苷酸(T)的改变。该改变激活了一个隐蔽的剪切位点，选择性地对外显子9进行了剪切，造成外显子9转录的mRNA核苷酸序列第498 620bp的缺失，引起其编码的41个氨基酸的减少，导致GNB3结构少了一个WD螺旋区域，从而使B3亚单位的结构发生改变。p3亚单位结构的改变，增强了 G蛋白的活性，Gict2亚单位的表达量相应增加。由于Gict2分子的表达增加会导致脂肪细胞过度增生及细胞内脂质堆积，因此最终会引发肥胖的产生。脂蛋白脂酶基因(lipoprotein lipase, LPL)是脂肪分解过程的关键酶，可催化乳糜微粒CM与极低密度脂蛋白VLDL核心中的甘油三酯TG分解，向组织提供产能所需的游离脂肪酸，并促进各种脂蛋白之间的相互转换，又称为TG水解酶。临床研究提示，LPL(HindIII)的单核苷酸多态性与肥胖有明显的相关性。黑素皮质素受体-4(melanocortin_4receptor, MC4R)是下丘脑腹内侧核分泌的一类肽类物质，为黑素皮质素受体家族5个亚型(MC1-5R)之一。在哺乳动物中，MC4R具有介导瘦素蛋白(Ieptin)的功能，是一个调节能量平衡与能量动态平衡的重要信号分子，可与其内源性配体黑素皮质素激素(melanocortin, MC)或刺鼠色蛋白(agouti protein,agouti蛋白)和agouti相关蛋白(agouti related protein, AGRP)相结合，从而在控制食欲和体重稳态中起关键作用。因此，MC4R在人类肥胖研究中作为重要的调节因子倍受关注。全基因组关联分析发现，MC4R基因(rsl2970134)多态性与肥胖密切相关，参与控制食欲和增加能量消耗，进而调节体重。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferato-activated receptor,PPAR- Y )是由配体激活的核转录因子，属II型核受体超家族成员。PPAR-Y2基因外显子B的第12密码子34位核苷酸C-G突变，导致第12位的脯氨酸替换为丙氨酸，即Prol2Ala是PPAR- Y 2最常见的多态位点。近年来研究显示，PPAR- Y 2与脂肪细胞分化、肥胖、胰岛素抵抗关系密切。 1997 年 Fleury 等发现了解偶联蛋白 2(uncoupling protein 2,UCP2)基因，并将其定位于人类染色体llql3，该基因编码蛋白质的氨基酸序列与以往报道的UCPl蛋白具有59%的一致性。UCP2蛋白广泛表达于人体各种组织，通过参与线粒体呼吸过程的解偶联作用产热，从而调节机体的能量消耗。大量临床报道，UCP2 (Ala55Val)多态性与肥胖有密切相联。研究发现，β 3-肾上腺能受体(β 3-adrenergic receptor, β 3-AR)对调节人体能量平衡发挥重要作用。i3 3-AR(Trp64Arg)基因变异可增加肥胖和糖尿病的易感性。
基于循证医学的基本原则，采用病例-对照研究和队列研究相结合的方法，并将回顾性研究与前瞻性研究相结合，通过文献检索、证据评价、信息提取、H-W遗传平衡检验、同质性检验、大样本Meta分析等一系列严格的筛选和实验验证过程，综合考虑和分析各个基因位点与肥胖的关联度(0R值)、人群中基因型发生频率、发病机理、信号通路等，最后确定8个肥胖相关的易感性基因，共计9个基因位点。本发明提供一种肥胖基因易感性和预警检测试剂盒，通过联合检测多个核酸(DNA 和 RNA)分子标记，包括:APMI (+45)、FTO (rs9939609)、FTO (rs8050136)、GNB3 (825C/T)、LPL(HindIII)、MC4R (rsl7782313)、PPAR- y 2 (Prol2Ala)、UCP2 (Ala55Val)、β 3-AR(Trp64Arg)上基因多态性位点，来评估和筛选肥胖的遗传易感性。该试剂盒的特征是上述基因位点的特异性扩增引物对及DNA测序引物对包括:用于检测APMI基因上+45基因多态性位点的特异性引物对及DNA测序引物对；用于检测FTO基因上rs9939609基因多态性位点的特异性引物对及DNA测序引物对；用于检测FTO基因上rs8050136多基因多态性位点的特异性引物对及DNA测序引物对；用于检测GNB3基因上825C/T基因多态性位点的特异性引物对及DNA测序引物对；用于检测LPL3基因上HidIII基因多态性位点的特异性弓丨物对及DNA测序引物对；用于检测MC4R基因上rsl7782313基因多态性位点的特异性引物对及DNA测序弓丨物对；用于检测PPAR Y 2基因上Prol2Ala基因多态性位点的特异性引物对及DNA测序引物对； 用于检测UCP2基因上Ala55Val基因多态性位点的特异性引物对及DNA测序引物对；用于检测β 3-AR基因上Trp64Arg基因多态性位点的特异性引物对及DNA测序引物对；PCR反应试剂组份(包括:缓冲液，MgCl2溶液，UdNTPs, dNTPs，特异性引物对，TaqDNA聚合酶，UNG酶，模板DNA，纯水等)；PCR产物酶解试剂组份(包括:SAP酶，ExoL酶MIX，纯水等)；DNA测序反应试剂组份(包括:EDTA，无水乙醇，70%预冷乙醇，去离子甲酰胺(H1-Di Formamide)，PCR 酶解产物，BigDye Mix, DNA 测序引物，纯水等)。本试剂盒所述的特征是APMI (+45)、FTO (rs9939609)、FTO (rs8050136)、GNB3 (825C/T)、LPL (HindIII)、MC4R(rsl7782313)、PPAR y 2 (Prol2Ala)、UCP2 (Ala55Val)、β 3-AR(Trp64Arg)上九个基因多态性位点同时进行联合检测。本试剂盒所述的特征是九个特异性扩增引物对分别针对APMI (+45)、FT0(rs9939609)、FTO (rs8050136)、GNB3 (825C/T)、LPL(HindIII)、MC4R(rsl7782313)、PPAR- y 2 (Prol2Ala)、UCP2 (Ala55Val)、β 3-AR(Trp64Arg)上基因多态性位点，能特异性扩增出DNA片段。本发明的九个特异性引物可用常规的合成方法进行合成，这些引物本领域的技术人员可以轻易地进行设计、合成和使用等。本试剂盒所述的特征是九个DNA测序引物对分别针对APMI (+45)、FT0(rs9939609)、FTO(rs8050136)、GNB3 (825C/T)、LPL(HindIII)、MC4R(rsl7782313)、PPAR- y 2 (Prol2Ala)、UCP2 (Ala55Val)、β 3-AR(Trp64Arg)上基因多态性位点，能特异性进行DNA片段的序列检测。本发明的九个DNA测序引物对可用常规的合成方法进行合成，这些引物本领域的技术人员可以轻易地进行设计、合成和使用等。本试剂盒所述的特征是所述试剂盒的组成与含量包括: (I) PCR反应试剂组份:单个PCR反应体系包括:10 X PCR缓冲液2.5 μ I，25mMMgCl2 溶液 2.5μ l，25mM UdNTPs 0.2 μ l,25mM dNTPs 0.2 μ 1，20 μ M 特异性引物对中的一对引物0.5 μ I，5U/ μ I混合酶(Taq DNA聚合酶与UNG酶)I μ I，模板DNA 3 μ I (50ng)，加纯水至25μ1。其中，使用UdNTPs-尿苷酶(UNG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA,以防止PCR扩增产物的污染。(2) PCR产物酶解试剂组份:2 μ I SAP酶+ExoL酶MIX。(3) DNA测序反应试剂组份:有两部分组成:测序反应体系和测序产物纯化。单个DNA测序反应体系包括:3 μ I PCR酶解产物，I μ I测序试剂(25% BigDye Mix)，I μ I DNA测序引物对(使用其中一个引物)，I μ I纯水。测序产物纯化包括:100mM EDTA 2 μ 1，16 μ I无水乙醇,70%预冷乙醇70μ 1X2,10μ I去离子甲酰胺(Hi_Di Formamide)等。上述三个组份的保存温度为_20°C。
(5) PCR反应试剂组份加样:在上述分装好的装有混合反应液的PCR反应管中分别加入模板DNA和阴性对照各3 μ I。S卩:单个PCR反应体系组分，见表1:
表I单个PCR反应试剂组份


本发明提供了一种肥胖基因易感性和预警检测试剂盒，其特征是联合检测多个核酸(DNA和RNA)分子标记，包括APMI(+45)、FTO(rs9939609)、FTO(rs8050136)、GNB3(825C/T)、LPL(HindIII)、MC4R(rs17782313)、PPARγ2(Pro12Ala)、UCP2(Ala55Val)、β3-AR(Trp/Arg)。该试剂盒包括上述多态性位点的特异性扩增引物对及DNA测序引物对，以及PCR反应试剂组份，PCR产物酶解试剂组份，DNA测序反应试剂组份。通过本发明的试剂盒检测，并对相关的基因信息进行数据处理与统计分析，可以评估受检者的肥胖易感性。