一种兼具细胞特异靶向性、还原响应性及三重抗癌治疗功效的介孔硅纳米药物载体的制 ...的制作方法[0002]经过半个多世纪的探索进取，智能药物控制释放系统在医学领域的潜在应用价值已充分显现并受到日益增多的关注。控释给药也逐渐成为生物医学研究领域的一个重要分支，其横跨了化学工程、材料科学工程、生物学、制药学与临床医学等多类交叉学科。随着EPR效应的提出，微纳尺寸的抗癌药物载体引发越来越多的关注。然而，仅仅依赖肿瘤组织的结构特征提供的“被动”靶向机制，还不足以解决临床化疗中不理想的抑瘤效率和全身性的毒副作用。因此，研究者都在努力寻找合适的生物材料作为药物递送载体，设计具有“主动”靶向功能的新型药物控制释放系统，以提高功能药物送达癌变组织的效率。[0003]纳米技术与材料科学的兴起与进步，为设计并制备出新型的纳米智能药物释放系统奠定了理论和实践基础。相比于微米尺寸的颗粒(> 200nm),纳米颗粒(< 200nm)具有更长的的血液循环时间，从而有更高的概率到达病变组织；并且，纳米颗粒的尺寸优势使得其更容易由细胞吞 噬作用而进入细胞内。因此，研究人员通过整合药理学、药物化学和纳米材料技术，设计新型的纳米控制释放系统，提高药物被细胞摄入的效率。药物分子可以通过物理作用(扩散作用、静电吸附作用)或化学作用(亲疏水性作用、化学交联作用)粘附在纳米颗粒的内/外表面或纳米颗粒所接枝的化学结构(如环糊精、聚合物)中，实现纳米颗粒的载药功能。这类纳米药物递送载体可实现药物的控制释放，减少在到达病变组织前的药物滤出，并提高药物的细胞摄入率。纳米药物控制释放系统的研究是传统药物制剂、药物前体研究的进一步深化和发展，具有较好的医学应用前景，其相关上市药物在抗肿瘤领域已取得了较好的临床效果。相关研究已促进了化学、材料、生物、医学、药学等领域多学科的交叉与融合，是当今最前沿的研究领域之一。[0004]为了使抗癌药物收获更好的疗效，提高其对肿瘤组织的“导航定位”能力、降低毒副作用，并解决化疗过程中可能出现的多药耐受性(Mult1-drug Resistance, MDR)难题,多个交叉领域(化学、材料、生物、临床医学)的科学家共同致力于研发理想的智能药物控释载体，以期实现药物定点、定时、定量地释放——药物载体能定向到达指定部位(病灶)，并在指定的时刻以适当的速率释放出所需剂量的药物，既减少药物对正常组织的毒副作用，又充分地发挥了药物的疗效，并避免药物积累中毒，最终达到治愈的目的。介孔硅纳米颗粒因其独有的高度有序可控的介孔结构、可观的孔容及比表面积、表面丰富的活泼-OH，以及可通过简单的化学修饰实现特异性生物功能化的特性，已成为一种极具潜力的新型生物相容性药物载体。
[0006]为实现本发明目的而采用的技术方案是这样的，一种兼具细胞特异靶向性、还原响应性及三重抗癌治疗功效的介孔硅纳米药物载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:[0007]I)利用溶胶凝胶和模板法制备出单分散的介孔硅纳米颗粒，得到介孔硅纳米颗粒悬浊液；[0008]2)向所述介孔硅纳米颗粒悬浮液中加入3_(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐，之后，3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐水解，得到羧基化的介孔硅纳米颗粒；
[0009]3)采用胱胺分子功能化所述羧基化介孔硅纳米颗粒，制备出二硫键功能化的介孔娃纳米颗粒；
[0010]4)将药物负载到所述二硫键功能化的介孔娃纳米颗粒中；
[0011]5)采用细胞色素C分子封堵经过步骤4)处理的二硫键功能化介孔硅纳米颗粒，制备出还原响应性介孔硅/细胞色素C复合系统；
[0012]6)采用DNA适体单链分子(AS1411)功能化步骤5)所得的还原响应性介孔硅/细胞色素C复合系统，获得产品。
[0013]进一步，所述步骤I)的具体过程是:将作为模板剂的十六烷基三甲基溴化铵与氢氧化钠充分溶解至二蒸水中 ，水浴加热至75°C~85 °C，获得pH = 11~13的十六烷基三甲基溴化铵溶液；用匀速加样器逐滴加入正硅酸四乙酯至所述十六烷基三甲基溴化铵溶液中，持续搅拌，直至混合液成为白色悬浊液，即得到介孔硅纳米颗粒悬浊液。优选地，本步骤中，是利用200~800mL的水溶液作为反应溶剂，在适宜的碱性条件(pH = 11~13)和反应温度(75°C~85°C )下，以0.5~2.0g的双亲性阳离子表面活性剂(十六烷基三甲基溴化铵，CTAB)作为模板剂，通过正硅酸四乙酯的水解而合成介孔硅纳米颗粒。更为优选地，本步骤将1.0g十六烷基三甲基溴化铵与0.28g氢氧化钠充分溶解至480mL 二蒸水中，搅拌均匀并加热至80°C。用匀速加样器逐滴加入5.0g正硅酸四乙酯至上述溶液中，持续剧烈搅拌2h，直至混合液成为白色悬浊液，即合成了介孔硅纳米颗粒。
[0014]进一步，所述步骤2)的具体过程是:将3_(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐缓慢滴加至步骤I)所得的悬浊液中，水浴保温，搅拌4~6h后，离心即得到羧基化的介孔硅纳米颗粒粗制品，记为CTAB麵SNs-TPS ;而后，通过甲醇/盐酸混和溶液抽取所述粗制品中的十六烷基三甲基溴化铵，得到规则孔道结构的羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒，记为MSNs-TPS。优选地，本步骤是利用3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐修饰介孔硅纳米颗粒。将1.0~2.0mL的3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐缓慢滴加至步骤I)得到的体系中，继续水浴搅拌4~6h后，离心即得到羧基化的介孔硅纳米颗粒粗制品(CTAB0MSNs-TPS)。而后，通过适量的甲醇/盐酸混和溶液(V甲醇:V盐酸=9:1)对十六烷基三甲基溴化铵进行抽取，之后的产物即为具有规则孔道结构的羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒。更为优选的是，本步骤是将3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸1.0mL缓慢滴加至步骤I)的体系中，继续水浴搅拌4h后，离心即得到羧基化的介孔硅纳米颗粒粗制品(CTAB0MSNs-TPS)。而后，将1.0g上述纳米颗粒均匀分散于150mL的甲醇/盐酸(135mL:15mL)混合液中，80°C水浴加热回流48h，即可有效地抽取表面活性剂(CTAB)，得到具有规则孔道结构的羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs-TPS)。
[0015]进一步，所述步骤3)的具体过程是:将羧基化介孔硅纳米颗粒(MSNs-TPS)均匀分散在pH = 5.0~6.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中，再向磷酸盐缓冲液(PBS)中加入1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌3h以活化介孔硅纳米材料的羧基；之后，加入胱胺盐酸盐，室温下搅拌36~48h后，用双蒸水和无水乙醇洗涤上述溶液的离心产物，除去介孔内残留的溶剂，冷冻干燥后即得到二硫键功能化介孔硅纳米颗粒，记为MSNs-S-S。优选地，本步骤是将0.1g~0.15g的羧基化介孔硅纳米颗粒(MSNs-TPS)均匀分散在PBS (pH = 5.0~6.0)中，加入0.015~0.02mol的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌3h以活化介孔硅纳米材料的羧基。之后，将过量的1.0~2.0g胱胺盐酸盐加入上述溶液，并在室温下搅拌36~48h。最后,用双蒸水和无水乙醇洗漆上述溶液的离心产物，除去介孔内残留的溶剂，冷冻干燥后即得到二硫键功能化介孔硅纳米颗粒(MSNs-S-S)。更为优选地，本步骤是将0.2g羧基化介孔纳米颗粒(MSNs-TPS)加入20mL PBS (pH = 5.0~6.0)中，室温搅拌4h至均匀分散后，加入0.015~0.02mol的1-乙基_3-[3_ 二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌3h以活化介孔硅纳米材料的羧基。之后，将1.0g胱胺盐酸盐加入上述溶液，并在室温下搅拌36~48h。最后，用双蒸水和无水乙醇洗涤上述溶液的离心产物，以除去介孔内残留的溶剂，冷冻干燥后即得到二硫键功能化介孔娃纳米颗粒(MSNs-S-S)。
[0016]进一步，所述步骤4)的具体过程是:将异硫氰酸荧光素(FITC)或盐酸阿霉素溶解于pH = 5.5~6.5的磷酸盐 缓冲液(PBS)中，再向磷酸盐缓冲液(PBS)中加入二硫键功能化介孔硅纳米颗粒(MSNs-S-S)，搅拌18~24h后，再加入细胞色素C、1-乙基-3- [3- 二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌18~24h，离心得到的产物即为还原响应性介孔硅/细胞色素C复合系统，记为MSNs-CtyC。优选地，本步骤是将10~20mg异硫氰酸荧光素(FITC)或盐酸阿霉素溶解于25~40mL PBS (pH =
5.5~6.5)中。加入10~20mg 二硫键功能化的介孔娃纳米颗粒,搅拌18~24h。最后，将3~5mg细胞色素C，1.5~3.0mg EDC和0.8~1.5mg NHS共同加入到上述混合溶液中，室温搅拌18~24h。离心得到的产物即为还原响应性介孔硅/细胞色素C复合系统，记为MSNs-CtyC。更为优选地，本步骤是将IOmg的异硫氰酸荧光素(FITC)或盐酸阿霉素溶于20mL PBS (pH = 6.0)缓冲溶液中。加入20mg 二硫键功能化的介孔硅纳米材料，搅拌24h。然后，将5mg细胞色素C，3mg EDC和L 5mg NHS共同加入到上述混合缓冲液中，室温搅拌24h。离心洗涤得到的产物即为还原响应性介孔硅/细胞色素C复合系统，记为MSNs-CtyC。
[0017]进一步，所述步骤5)的具体过程是:将所述还原响应性介孔硅/细胞色素C复合系统和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐共同溶解于交联缓冲液中，室温搅拌6~12h，离心，获取颗粒，洗涤该颗粒以去除残余溶剂，之后将去除残余溶剂的颗粒重悬于交联缓冲液，并加入巯基化的DNA适体，室温下温和搅拌0.5~
1.0h,得到适体DNA功能化的还原响应性细胞靶向介孔硅/细胞色素C复合系统，记为MSNs-CytC-Apt。优选地,本步骤是将10~15mg介孔娃/细胞色素C纳米复合颗粒、8~16mg交联剂4- (N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐共同溶解于交联缓冲液中(IOOmM PBS, 2.5mM EDTA, 150mM氯化钠，pH = 7.2)，室温搅拌6~12h，充分洗去残留溶剂后用上述交联缓冲液重悬颗粒，加入20nmol巯基化的DNA适体，室温下温和搅拌0.5~1.0h，得到适体DNA功能化的还原响应性细胞靶向介孔硅/细胞色素C复合系统(MSNs-CytC-Apt)。更为优选地,本步骤是将IOmg介孔娃/细胞色素C纳米复合颗粒、Smg交联剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐共同溶解于交联缓冲液中(IOOmM PBS，2.5mM EDTA，150mM氯化钠，pH = 7.2)，室温搅拌12h后离心收集颗粒，用PBS(pH = 7.0)多次洗涤该反应所得颗粒以去除残余溶剂，之后将颗粒重悬于交联缓冲液，并加入20nmol巯基化的DNA适体，室温下温和搅拌0.5h,得到适体DNA功能化的还原响应性细胞靶向介孔硅/细胞色素C复合系统(MSNs-CytC-Apt)。
[0018]本发明要求保护上述方法所获得的产品。
[0019]本发明的有益效果在于:该方法具有操作步骤简单、成本低廉、通用性强、无特殊设备需求的特点。利用该方法制备的多功能介孔硅/细胞色素C-适体DNA纳米复合颗粒能特异靶向至肝癌细胞，并在细胞内还原性谷胱甘肽的作用下解离出细胞色素C和适体DNA分子，释放出介孔内抗癌药物，通过三者各自的机理共同作用实现三重抗癌治疗，为解决肿瘤多药耐受性提供潜在的方案，在抗癌治疗领域具有广阔的临床应用价值。



[0020]图1为介孔硅纳米颗粒和介孔硅/细胞色素C-适体DNA纳米复合颗粒的特征图:左侧图片为本体介孔硅纳米颗粒的透射电镜形貌图；右侧图片为介孔硅/细胞色素C-适体DNA纳米复合颗粒的透射电镜形貌图；
[0021]图2为介孔硅/细胞色素C-适体DNA纳米复合系统的还原响应性释放特性图。 [0022]图3为介孔硅/细胞色素C-适体DNA纳米复合系统靶向效率。
[0023]图4为体外细胞实验考察介孔硅/细胞色素C-适体DNA纳米复合系统诱导肝癌细胞凋亡的作用。A为与介孔硅/细胞色素C-适体DNA纳米复合颗粒共培养的肝癌细胞的活性检测为凋亡细胞的激光共聚焦扫描显微照片。
[0024]图5为体内构建的皮下肿瘤实验考察介孔硅/细胞色素C-适体DNA纳米复合系统抑制肿瘤的作用。A为给药结束后的肿瘤照片，B为给药周期中裸鼠的体重变化趋势图。

[0025]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。
[0026]实施例1:兼具还原响应性和靶向性的介孔硅/细胞色素C-适体DNA多功能纳米复合颗粒的制备
[0027]I)介孔硅纳米颗粒的合成:将Ig十六烷基三甲基溴化铵与0.28g氢氧化钠充分溶解至480mL 二蒸水中，剧烈搅拌并加热至80V，获得80°C溶液。用匀速加样器逐滴加入5g正硅酸四乙酯至上述80°C溶液中，形成混合液，剧烈搅拌2h，直至混合液成为白色悬浊液。
[0028]2)羧基化介孔硅纳米颗粒的合成:将3_(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸1.0mL缓慢滴加至步骤I)的白色悬浊液中，继续水浴搅拌4h后，离心即得到羧基化的介孔硅纳米颗粒粗制品(CTAB麵SNs-TPS)。而后，将1.0g上述羧基化的介孔硅纳米颗粒粗制品均匀分散于150mL的甲醇/盐酸(135mL: 15mL)混合液中，置于80°C的水浴锅中回流48h，即可有效地抽取表面活性剂(CTAB)，得到具有规则孔道结构的羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs-TPS)。
[0029]3) 二硫键功能化介孔娃纳米颗粒的制备:首先，取步骤2)所得的0.2g纳米颗粒(MSNs-TPS)均匀分散在20mL的PBS (pH = 5.0~6.0)溶液中，室温搅拌4h至均匀分散后，加入0.015~0.02mol的1-乙基_3-[3_ 二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌3h以活化介孔硅纳米材料的羧基。之后，投入1.0g胱胺盐酸盐，并在室温下搅拌36~48h,离心分离固体产物。最后,用双蒸水和无水乙醇洗漆上述离心产物，以除去介孔内残留的溶剂，冷冻干燥后即得到二硫键功能化介孔硅纳米颗粒(MSNs-S-S)。
[0030]4)还原响应性介孔硅/细胞色素C纳米复合系统的制备:首先，将IOmg的FITC或盐酸阿霉素溶于20mL PBS (pH = 6.0)缓冲溶液中，再加入20mg 二硫键功能化的介孔硅纳米颗粒，搅拌24h，得到混合缓冲液。然后，将5mg细胞色素C、3mg EDC和1.5mg NHS共同加入到上述混合缓冲液中，室温搅拌24h，离心分离固体产物。洗涤离心得到的产物，即获得还原响应性介孔硅/细胞色素C复合系统，记为MSNs-CtyC。
[0031]5)兼具还原响应性、靶向性及三重抗癌治疗功效的介孔硅/细胞色素C-适体DNA纳米复合颗粒的制备:将IOmg介孔硅/细胞色素C纳米复合颗粒、8mg4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(作为交联剂)共同溶解于交联缓冲液中(IOOmM PBS, 2.5mM乙二胺四乙酸EDTA，150mM氯化钠，pH = 7.2)，室温搅拌12h后离心收集颗粒，用PBS (pH = 7.0)多次洗涤该反应所得颗粒以去除残余溶剂，之后将颗粒重悬于交联缓冲液，并加入20nmol巯基化的DNA适体(巯基化的一种称为AS1411的单链DNA适体)，室温下温和搅拌0.5h，得 到适体DNA功能化的还原响应性细胞靶向介孔硅/细胞色素C复合系统(MSNs-CytC-Apt)，即产品。
[0032]上述I)步骤和5)步骤处理后的介孔硅纳米材料和介孔硅/细胞色素C-适体DNA纳米复合颗粒的透射电镜图分别见图1(左侧)和图1(右侧)；介孔硅纳米颗粒呈现出高度有序的介孔结构，且其六边形的孔道清晰可见，而经过细胞色素C-适体DNA分子修饰的介孔硅纳米颗粒的介孔轮廓变得模糊，且颗粒外周出现星云状的薄层；该结果表明细胞色素C分子已经成功修饰至介孔硅纳米材料表面。
[0033]实验例1:介孔硅/细胞色素C-适体DNA多功能纳米复合系统的还原响应性行为
[0034]本研究以FITC作为模型药物，苏硫二糖醇(DTT)作为还原性刺激信号，来考察介孔硅/细胞色素C-适体DNA纳米复合系统的释放行为特征。
[0035]需要制作两组实验对象。其中，第一组需要按实施例1的步骤制备适体DNA功能化的还原响应性细胞靶向介孔硅/细胞色素C复合系统。只是在步骤4)中，采用IOmg的FITC溶于20mL PBS(pH = 6.0)缓冲溶液中，同时，还加入0.05M的DTT。第二组同样需要按实施例1的步骤制备适体DNA功能化的还原响应性细胞靶向介孔硅/细胞色素C复合系统。只是在步骤4)中，仅仅用IOmg的FITC溶于20mL PBS (pH = 6.0)缓冲溶液中。
[0036]将上述两种适体DNA功能化的还原响应性细胞靶向介孔硅/细胞色素C复合系统制成两组混悬液。而后，将上述混悬液转移到透析袋(截留分子量8000~14000)中，并置于含有15mL PBS的离心管(50mL)中，37°C避光旋转孵育24h。在设定时间点取出孵育液，在荧光外分光光度计检测520nm处的荧光值。如图2所示:在DTT的刺激下，载有FITC的介孔硅/细胞色素C-适体DNA纳米颗粒在3h内约有78.9%的FITC荧光素分子从介孔硅纳米复合颗粒中“爆释”出来，孵育液颜色发生明显变化，呈现出FTIC的黄绿色(右上方瓶体)；而当其未暴露于DTT刺激信号时，仅有约5.11%的FITC荧光素分子从纳米复合颗粒中“渗漏”出来(右下方瓶体)；从而证实该系统对还原性信号DTT具有快速的响应性，并且能有效地封装功能性药物。
[0037]实验例2:介孔硅/细胞色素C-适体DNA多功能纳米复合颗粒在靶向肝癌细胞内的效率
[0038]选取实施例1制得的FITC标记的介孔硅/细胞色素C-适体DNA多功能纳米复合颗粒，并利用透射电镜、激光共聚焦扫描显微镜及流式细胞仪监控肝癌细胞(HepG2)内吞纳米复合颗粒后的胞内分布状况。如图3所示:流式细胞定量分析显示(图3C)，肝癌细胞分别与MSNsOFITC、MSNs-CytC-AptiFITC共培养，在2h后，经MSNsOFITC孵育的细胞中，具有荧光信号的细胞约占21.3%，而MSNs-CytC-Apt@FITC组具有荧光信号的细胞占48.7%；4h后，MSNsiFITC组的细胞中，具有 荧光信号的细胞约占60.6 %，而MSNs-CytC-Apt@FITC组具有荧光信号的细胞占91.2%，表明肝癌细胞对于介孔硅/细胞色素C-适体DNA多功能纳米复合颗粒的吞噬效率更高。
[0039]实验例3:介孔硅/细胞色素C-适体DNA多功能纳米复合颗粒与肝癌细胞的凋亡诱导作用
[0040]采用步骤d合成的载有盐酸阿霉素的介孔硅/细胞色素C-适体DNA多功能纳米复合颗粒与H印G2肝癌细胞共培养，分别在6h，12h后通过CCK-8试剂盒、激光共聚焦扫描显微镜表征肝癌细胞的增殖与活性情况。如图4所示:12h后，本体介孔硅颗粒处理的细胞与对照组无明显差异，而MSNs-CytC-Apt复合颗粒处理的细胞中只有极个别细胞出现凋亡特征，这应归因于适体DNA受与其相连的细胞色素C的影响，在细胞内扩散速率较慢且与细胞膜核仁素蛋白结合的效率受限；盐酸阿霉素(DOX)处理的肝癌细胞呈现出最大的凋亡比例，因为盐酸阿霉素是水溶性的，及其容易被细胞摄取；类似地，装载盐酸阿霉素的本体介孔硅纳米颗粒(MSNsODOX)也能较明显地引发肝癌细胞凋亡，因为部分盐酸阿霉素容易从孔道中扩散进入培养液从而被细胞摄取；而载有盐酸阿霉素的介孔硅/细胞色素C-适体DNA多功能纳米复合颗粒(MSNs-CytC-Apt@DOX)诱导的凋亡比例略低于DOX和MSNsODOX两组，也从侧面证明了控释机制的存在。24h后，MSNs-CytC-Apt组表现出较为明显的初期凋亡特征，且MSNs-CytC-Apt@D0X组细胞活性最低(图4A)，因为长时间在细胞内还原性谷胱甘肽的作用下，细胞色素C-适体DNA的持续解离并扩散至各自的作用位点，同时药物也持续释放并扩散至细胞核发挥作用，三者共同作用实现多重的凋亡诱导，其机理是:(I)阿霉素可扩散进入细胞核导致DNA损伤(2)细胞色素C与Apaf-1结合并激活caspase的级联放大效应而诱导凋亡(3)选用的DNA适体AS1411与细胞核膜上的核仁素发生结合并阻断其在增殖行为的功能；因AS1411的竞争性，bcl-2mRNA无法与核仁素结合而变得不稳定，无法修复DNA损伤。对细胞核染色后在激光共聚焦扫描显微镜下观察，可发现当细胞启动凋亡程序后,细胞核发生回缩并伴随染色质重排,最终细胞核破碎形成凋亡小体。经MSNs-CytC-Apt (图 4B cl, c2)、D0X (图 4B dl, d2)、MSNs@D0X (图 4B el, e2) ,MSNs-CytC-AptiDOX(图4B fl, f2)孵育的细胞凋亡程度与CCK-8结果一致，需说明的是，随着凋亡程度的增加，细胞会发生回缩并最终脱离基底，所以对应组别的细胞样品在激光共聚焦扫描显微镜下视野内细胞数量明显减少。
[0041]实验例4:介孔硅/细胞色素C-适体DNA多功能纳米复合颗粒对活体肿瘤模型的抑制作用
[0042]采用步骤d合成的载有盐酸阿霉素的介孔硅/细胞色素C-适体DNA多功能纳米复合颗粒经尾静脉注入荷瘤(皮下移植瘤)裸鼠体内，检测给药周期中裸鼠的体重、肿瘤体积变化，并用TUNEL染色法表征肿瘤组织的凋亡程度。如图5所示:注射生理盐水和本体介孔硅纳米颗粒(MSNs)的裸鼠，肿瘤体积无显著区别，MSNs-CytC-Apt注射组的肿瘤增长较为平缓；与实验例4结果相反的是，MSNsODOX对肿瘤的抑制作用高于游离的盐酸阿霉素(DOX)，因为介孔硅纳米颗粒在体内具有更长的血液循环时间，而游离药物易从血液中被清除；MSNs-CytC-Apt@DOX既得益于纳米颗粒的长循环优势，又兼具了控释机制、靶向作用以及三重抗癌治疗， 体现出优越的肿瘤抑制功效(图5A，B)。