专利名称：泛素蛋白内含子改造序列及其应用的制作方法大多数真核基因都被ー个或多个内含子所间隔，这些间隔序列可以转录成pre-mRNA，这些转录本只有在细胞核中经剪接复合体的作用去除内含子片段后，才能形成成熟mRNA，然后穿过核孔转移到细胞质中进行翻译。真核pre-mRNA的剪接是ー个在细胞核中完成的、严格保守的化学反应，该过程包括剪接体识别外显子-内含子连接区段，通过两步转酯反应切除内含子并使相邻的外显子连接。已有研究发现，内含子在基因表达方面起着重要的调控作用。由内含子介导的使基因表达活性增强的效应叫做内含子增强效应(intron-mediated enhancement, IME)(Callis et al. , Genes Development, 1987,1:1183-1200)。真核 mRNA 内含子已成为提高转基因生物外源基因表达的重要元件之一。单子叶植物的内含子增强效应高于双子叶植物，双子叶植物内含子增强效应一般在 2-5 倍，而单子叶植物可达 10-100 倍(Simpson 和 Filipowicz, Plant Mol. Biol.，1996，32 :1-41)。双子叶植物内含子可以提高单子叶植物基因的表达，而由于单子叶植物内含子与外显子AU的平均含量为59%和44%，双子叶植物的分别为74%和55%，高AU含量可以使内含子更易形成茎环结构从而有利于剪接，因此，单子叶植物内含子通常不会提高双子叶植物基因的表达(Vain et al.，Plant cell R印，1996，15:489-494)。Ueki 等将 PLD、Cat 和Ubi (玉米ubiquitin第一个内含子)内含子与不同启动子连接,分别转化玉米和烟草的原生质体，验证各个载体表达特点，结果发现，含有内含子载体的报告基因表达水平在玉米原生质体中普遍高于同样载体的烟草原生质体的表达水平，内含子载体增强效应与启动子、内含子和报告基因等紧密相关(Ueki et al.，Plant Biotech, 2004，21 (I) :15_24)。现在人们普遍接受内含子像其他调控基因表达的顺式作用元件一祥含有一定的关键序列，这些序列在调控中起到关键作用，而其余的序列对于调控来说并不是必需的。内含子的两个剪接位点5’ GU—AG3’和分支位点的A碱基具有高度的保守性，在完成RNA正确剪接中是必须的。Rose等对拟南芥全基因组序列分析发现，内含子增强基序是分散排布，距离启动子近端的内含子增强效应高于其他位置，并且构建了一个增强序列识别器--頂Eter，以此预测了拟南芥中内含子增强相关基序(见图1，Rose et al.，Plantcell, 2008, 20:543-551 )，并对水稻的内含子分析后发现这种增强基序具有一定的保守性。泛素(ubiquitin)是ー种存在于大多数真核细胞中的由76个氨基酸残基组成的高度保守的蛋白质。1992年，Christensen等从玉米中克隆出了编码泛素蛋白的Ubi-I和Ubi-2基因，并准确定位了 Ubi-I的启动子、转录起始位点、5’侧翼序列处的0. 9kb转录调控区和完整的5’非编码区，并构建pUBI-CAT载体，在玉米和其它单子叶植物的原生质体中进行验证，发现Ubi-I启动子比CaMV35S具有更高的增强基因表达的效应(Christensen etal.,Plant Mol Biol，1992，18 :675-689)。Vain等通过比较发现，ubil内含子与侧翼外显子的41nt所构建的载体(p35Subi⑶S)在玉米悬浮细胞中的增强效应高于其它载体，增强效应可提高71倍(Vainet al. ,Plant cell R印，1996，15 :489_494)。王悦冰比较了玉米泛素蛋白基因的第一内含子(ubil)、水稻肌动蛋白基因的第一内含子(actl)、玉米こ醇脱氢酶基因的第一内含子(adhl)和马铃薯高赖氨酸基因SBgLR基因的第二内含子(SBgLR2)对基因表达的增强作用，结果发现ubil增强报告基因的表达能力最強。目前尚未见到对Ubil内含子进行特定位点的突变，以获得增强基因表达能力更强的内含子序列的报道。
本发明的目的是对来源于玉米泛素蛋白基因Ubil内含子进行改造，提供ー种可以增强基因表达的内含子，通过构建该改造的泛素蛋白内含子的植物表达载体，将其应用于转基因植物的培育中，可以提高其他基因在转基因植物中的表达。本发明通过如下工作达到了上述发明目的I、内含子突变载体的构建策略本发明以P5内含子序列(SEQ ID NO: I)为目标序列，增加内含子增强序列基序 TCGATC的数量，改造ubil-P5内含子，通过序列分析，将ll-16bp、78-83bp、282-287bp和510-515bp依次突变为保守序列--TCGATC (SEQ ID NO: I中有下划线处为待突变位点)。SEQ ID NO: II GTACAOGGAT GCGACCTGTA CGTCAGACAC GTTCTGATTG CTAACTTGCC AGTGTTTCTC61 TTTGGGGAAT CCTGGGATGG CTCTAGCCGT TCCGCAGACG GGATOGATTT CATGATTTTT121 TTTGTTTOGT TGCATAGGGT TTGGTTTGCC CTTTTCCTTT ATTTCAATAT ATGCCGTGCA181 CTTGTTTGTC GGGTCATCTT TTCATGCTTT TTTTTGTCTT GGTTGTGATG ATGTGGTCTG241 GTTGGGCGGT OGTTCTAGAT CGGAGTAGAA TTAATTCTGT TTCAAACTAC CTGGTGGATT301 TATTAATTTT GGATCTGTAT GTGTGTGCCA TACATATTCA TAGTTAOGAA TTGAAGATGA361 TGGATGGAAA TATCGATCTA GGATAGGTAT ACATGTTGAT GCGGGTTTTA CTGATGCATA421 TACAGAGATG CTTTTTGTTC GCTTGGTTGT GATGATGTGG TGTGGTTGGG CGGTCGTTCA481 TTCGTTCTAG ATOGGAGTAG AATACTGTTT CAAACTACCT GGTGTATTTA TTAATTTTGG541 AACTGTATGT GTGTGTCATA CATCTTCATA GTTACGAGTT TAAGATGGAT GGAAATATCG601 ATCTAGGATA GGTATACATG TTGATGTGGG TTTTACTGAT GCATATACAT GATGGCATAT661 GCAGCATCTA TTCATATGCT CTAACCTTGA GTACCTATCT ATTATAATAA ACAAGTATGT721 TTTATAATTA TTTTGATCTT GATATACTTG GATGATGGCA TATGCAGCAG CTATATGTGG781 ATTTTTTTAG CCCTGCCTTC ATAOGCTATT TATTTGCTTG GTACTGTTTC TTTTGTCGAT841 GCTCACCCTG TTGTTTGGTG TTACTTCTGC AG载体构建策略如附图5所示。经改造的P5内含子的序列，为SEQ ID N0:2。2、突变载体pSG (13i_Mn)N的构建首先以p7Z⑶S (13i_P5)质粒为模板，以MP78F与MP78R为引物(表2)，用宝生物工程有限公司的TaKaRa MutanBEST Kit进行定点突变，在P5内含子片段的78bp_83bp处引入突变位点TCGATC，转化后获得第一个中间突变载体，命名为p7Z⑶S (13 -Μ1)中间载体；再以此质粒为模板，MPlIF与MPlIR为引物(表2)在Ilbp_16bp引入第二个突变位点，命名为P7ZGUS (13 -Μ2)中间载体；依次以MP282F 与 MP282R、MP510F 与 MP510R 为引物(表 I)分别在 282bp287bp和510bp-515bp引入第三个和第四个突变点，获得p7Z⑶S (13 -Μ3)中间载体和p7Z⑶S(13 -Μ4)中间载体；见如下表I :表I四个中间载体的构建情况ー览
本发明通过对来源于玉米泛素蛋白基因ubil内含子进行改造，将该内含子特定位点突变为保守序列，提供了一种可以增强基因表达的内含子序列。本发明还提供了含有该改造的泛素蛋白基因ubil内含子的植物表达载体，将其应用于转基因植物的培育中，可以提高其他基因在转基因植物中的表达。