专利名称：一种重组弓形虫蛋白及其应用的制作方法图IPCR扩增产物的凝胶电泳图2是表达质粒pET-28a-T0X的构建流程图3是诱导后菌体12% SDS-PAGE电泳图，其中M表示Marker，1表示目的蛋白。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。实施例1重组弓形虫蛋白的制备1. 1弓形虫蛋白抗原表位筛选及目的基因克隆通过计算机分析弓形虫的全部氨基酸序列筛选出弓形虫体内蛋白的优势抗原表位，包括P30从N-末端第104位到302位的199个氨基酸和P35从N-末端第170位到370 位的201个氨基酸。所述重组蛋白质的DNA序列如SEQ ID No. 1所示。其中，P30目的肽段DNA序列是P30第310位到第906位核苷酸，P35目的肽段DNA序列是P35第508位到第1110位核苷酸。根据目的片段的DNA序列，即TOX的P30和P35上目的肽段的cDNA序列和质粒上的酶切位点，设计两对PCR引物(P1，P2)和(P3，P4)。Pl和P2用于扩增P30第319位到第 906位核苷酸，P3和P4用于扩增P35第508位到第1110位核苷酸；引物Pl和P4分别带有NdeI和BioI的酶切位点，引物P2和P3顺序互补，并共同对应于P30上述片段的3，末端和P35上述片段的5’末端序列。
设计的二对PCR引物如下
Pl:ATCGCATATGGCCAATCAAGTTGTCACCTG
P2 CTCAGTTAATTTTGGCAAAA
P3 :GCCAAAATTAACTGAGAACCCGTGGCAGGGTAACGC
P4 :ATCGCTCGAGTTACTGCTGATCATCGTATG
以上引物由(华美生物技术有限公司)合成。
以弓形虫培养物(国际标准株RH株中国预防医学科学院病毒研究所赠)为模板， 以引物Pl和P2扩增P30目的DNA片段，以引物P3和P4扩增P35目的DNA片段。以第一轮PCR扩增得到的P30目的DNA片段和P35目的DNA片段为模板，加入引物Pl和P4，扩增 P30P35目的DNA片段。得到完整的目的DNA重组片段P30P35。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1所示。切割含目的DNA条带的胶块，用DNA快速纯化试剂盒(购自六合通-北京 TAKARA 公司，产品名称TAKARA MiniBEST Plasmid purification)回收目的 DNA,操作按产品说明书进行。
1. 2表达载体pET-28a-T0X的构建及鉴定
pET-28a载体(购自华美生物技术有限公司)与PCR扩增产物P30P35目的DNA片段经 NdeI 和 XhoI 双酶切，产物纯化(采用 TAKARA MiniBEST Plasmid purification 试剂盒，购自六合通-北京TAKARA公司)后经T4DNA连接酶与载体连接，连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态(购自华美生物技术有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37°C 倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落，碱裂解法抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳选择可疑重组质粒作为模板进行PCR扩增，对有扩增产物的重组子质粒经内切酶NdeI和EcoRI双酶切、鉴定，其中有2个重组子为阳性重组子。从2个阳性重组子中选一个阳性重组子送赛百胜公司测序鉴定，结果表明该质粒上确实插入了目的基因，且插入方向正确，将此重组质粒命名为表达质粒pET-28a-T0X。
1. 3表达重组弓形虫蛋白的工程菌的构建
将表达质粒ρΕΤ48ει-Τ0Χ转入表达菌株BL21(DE3)(购自华美生物技术有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37°C倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落用含卡那霉素的LB培养基培养，用IPTG诱导表达5小时，诱导菌体用12% SDS-PAGE分析((美) J.萨姆布鲁克(Jos印hSambrook)，(美)D.W.拉塞尔(DavidW. Russell)著，黄培堂等译. 子克降实验指南.北京科学出版社，2002)，结果如附图3所示，确定表达弓形虫蛋白的菌株即为所需的工程菌株，用甘油冷冻保存。
1.4重组弓形虫蛋白的制备和纯化
诱导培养已构建的表达弓形虫蛋白的工程菌株，用IPTG诱导表达5小时，离心收集菌体，以1 10 (W/V)加入菌体裂解液(50mm ρΗ8· O Tris_Cl，50mm NaCl，50%甘油)，加入磁力搅拌转子搅拌30分钟，经超声破菌(冰浴，功率200W，超声3秒，间隔5秒，超声80 次)、组氨酸亲和柱(300ml200mm的NiCl2过柱，流速5ml/min ；500ml PBS缓冲液洗注，流速10ml/min ；超声离心后的上清液用200ml PBS稀释后上样，流速3ml/min，500ml PBS缓冲液洗注，流速5ml/min ；用分别含咪唑20mm、50mm、100mm、200mm各100ml的PBS缓冲液洗脱，紫外检测仪^Onm检测吸收值，收集洗脱峰；SDS-PAGE电泳检测纯化组分)得到纯化的重组蛋白。
1. 5 重组蛋白 Western-blot 验证
为验证重组TOX蛋白质与抗TOX抗血清反应性及重组目的基因获得表达并具有抗原性，用Western-blot法进行了测试。阳性血清为10份用TOX培养物免疫兔子收获的兔抗TOX抗体阳性血清和30份人抗TOX抗体阳性血清(经ELISA法检测证实)。阴性血清为10份对照正常兔血清和30份人抗TOX抗体阴性血清(经ELISA法检测证实)。结果如表1。
表1重组蛋白Western-blot验证结果


本发明提供了一种弓形虫重组蛋白，还提供了该重组蛋白在制备检测试剂盒中的应用。采用本发明提供的弓形虫重组蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了人弓形虫感染临床诊断的需要。