专利名称：一种免疫保护性亚单位疫苗及其制备和应用方法哈氏弧菌(Vibrio harveyi)为水产养殖生物重要病原菌，能够感染多种水产养殖 动物，包括虾类、鱼、贝等。目前对于哈氏弧菌的控制依赖于抗生素和灭活疫苗免疫。抗生素 的危害性，包括抗性菌株的产生、环境污染以及对人类健康的危害等，已成为一种世界性共 识，因而其使用已在国际上受到限制。灭活疫苗由于在每次制备过程中难免会有不同的抗 原结构被破坏而造成免疫效果不稳定。目前针对哈氏弧菌的重组亚单位疫苗有数例报道， 主要为具有免疫活性的哈氏弧菌膜蛋白。相对灭活疫苗而言，重组亚单位疫苗具有免疫特 异性强、重复性较好等特点，但其通常缺点是制备繁琐、造价昂贵、需要特定的佐剂等。因而 对于重组亚单位疫苗而言，如何提高其制备以及自身免疫效率是尚待解决的问题。
本发明目的在于提供一种免疫保护性亚单位疫苗及其制备和应用方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为免疫保护性亚单位疫苗序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列。免疫保护性亚单位疫苗的制备1)质粒pETVP2的构建将质粒pET28用Ncol/Xhol酶切，回收5. 3kb片段；以哈 氏弧菌T4为模板，用引物VhhPF5和VhhPRl进行PCR扩增，产物纯化后用Ncol/Xhol酶切， 回收0. 58kb片段，将其与上述5. 3kb片段连接，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含卡那霉 素的LB固体培养基上培养，并筛选转化子提取质粒，即为质粒PETVP2 ；2)疫苗蛋白的诱导表达和纯化将质粒PETVP2转化大肠杆菌BL21 (DE3)，得转化 子BL21/pETVP2 ；将BL21/pETVP2于含有Kn(50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取过 夜后的培养液加入新鲜的LB液体培养基中，于37°C培养至0D_为0. 5，加入终浓度为ImM 的IPTG并于37°C继续培养4-5h，然后在离心后菌液中加入裂解液，在室温摇动1_2小时； 将菌液离心，回收上清；将上清液用凝胶柱回收，即得序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列所 编码的免疫保护性亚单位疫苗蛋白。所述步骤2)中每毫升菌液中加入5ml裂解液，同时菌液离心后的上清液用His Trap HP Columns 回收。免疫保护性亚单位疫苗的应用将上述所得的免疫保护性亚单位疫苗蛋白与经 LB培养基培养的菌株B187至0D_为0. 8后溶于PBS的菌悬液混合，所得为疫苗混合液具 有对哈氏弧菌免疫保护的作用。将所述疫苗混合液注射于水产养殖动物的体内，而后21-23天再将含有序列表 SEQ ID Nol中的碱基序列的疫苗蛋白的PBS强化免疫混合液注射于水产养殖动物的体内，即可使水产养殖动物具有对哈氏弧菌免疫保护的作用。所述每毫升强化免疫混合液或疫苗混合液中含免疫保护性亚单位疫苗蛋白 0. 2mg ；所述注射水产养殖动物体内的强化免疫混合液或疫苗混合液为IOOul。所述经LB培 养基培养的菌株B187至OD6tltl为0. 8后溶于PBS的菌悬液，为将菌株B187于LB培养基中 于30°C培养至OD6tltl为0. 8，然后离心收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为2 X IO8Cfu/ ml，即为疫苗混合液。本发明具有如下优点1.高保护率。本发明的重组亚单位疫苗对哈氏弧菌的免疫保护效率达89.3%。2.无需任何商业化佐剂。本发明的疫苗应用时不需如弗氏佐剂等有副作用的免疫 刺激剂。Ala lie Val lie Leu Gly lie Leu Ala Val Val Ala Ala Pro Arg Phe202530tta aac ctc caa gac gat gcg tat caa gca aaa atg gaa tcc ate get 144Leu Asn Leu Gln Asp Asp Ala Tyr Gln Ala Lys Met Glu Ser lie Ala354045gac caa ttc gaa aca ggc gtg cga ttt acc caa age caa tgg tta gtc 192Asp Gln Phe Glu Thr Gly Val Arg Phe Thr Gln Ser Gln Trp Leu Val505560aat ggt gga aca cag gaa get caa aca gat ate gat gga tat ggt ggt 240Asn Gly Gly Thr Gln Glu Ala Gln Thr Asp lie Asp Gly Tyr Gly Gly65707580ggc gaa ctg gat gta aat gag ttt ggc ttt ccg ctt ggc act aac aag 288Gly Glu Leu Asp Val Asn Glu Phe Gly Phe Pro Leu Gly Thr Asn Lys859095ggc aac aga aat ggc gtg att ggc aac ccg tat aac ata gga caa ggg 336Gly Asn Arg Asn Gly Val lie Gly Asn Pro Tyr Asn lie Gly Gln Gly100105110aat get ggt tgt att gcc gtg tgg caa get tta ctc ggc aac gaa tac 384Asn Ala Gly Cys lie Ala Val Trp Gln Ala Leu Leu Gly Asn Glu Tyr115120125tct cta tea aat aat cgt aac gcg aac gat agg ttt gat ttt att acc 432Ser Leu Ser Asn Asn Arg Asn Ala Asn Asp Arg Phe Asp Phe lie Thr130135140cga cga gtc caa gac aaa gaa tcc cac caa tct gtt tgt tat tat acc 480Arg Arg Val Gln Asp Lys Glu Ser His Gln Ser Val Cys Tyr Tyr Thr145150155160ttt act aaa aaa ggt tac gat cgc aat cct gat aac tct age ttc gtc 528Phe Thr Lys Lys Gly Tyr Asp Arg Asn Pro Asp Asn Ser Ser Phe Val165170175ata tgg tat gac tea aaa aca ggc age gtc acg aca tea aaa cca act 576lie Trp Tyr Asp Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr Ser Lys Pro Thr180185190aga ttg aaa taa588Arg Leu Lys195序列表.txt<210>2<211>195<212>PRT<213> 哈氏弧菌 T4<400>2Met Lys Arg Arg Asn Pro GIn Gly Leu Thr Leu Leu Glu Leu lie lie151015Ala lie Val lie Leu Gly lie Leu Ala Val Val Ala Ala Pro Arg Phe202530Leu Asn Leu Gln Asp Asp Ala Tyr Gln Ala Lys Met Glu Ser lie Ala354045Asp Gln Phe Glu Thr Gly Val Arg Phe Thr Gln Ser Gln Trp Leu Val505560Asn Gly Gly Thr Gln Glu Ala Gln Thr Asp lie Asp Gly Tyr Gly Gly65707580Gly Glu Leu Asp Val Asn Glu Phe Gly Phe Pro Leu Gly Thr Asn Lys859095Gly Asn Arg Asn Gly Val lie Gly Asn Pro Tyr Asn lie Gly Gln Gly100105110Asn Ala Gly Cys lie Ala Val Trp Gln Ala Leu Leu Gly Asn Glu Tyr115120125Ser Leu Ser Asn Asn Arg Asa Ala Asn Asp Arg Phe Asp Phe lie Thr130135140Arg Arg Val Gln Asp Lys Glu Ser His Gln Ser Val Cys Tyr Tyr Thr145150155160Phe Thr Lys Lys Gly Tyr Asp Arg Asn Pro Asp Asn Ser Ser Phe Val165170175lie Trp Tyr Asp Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr Ser Lys Pro Thr180185190Arg Leu Lys195.
本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种免疫保护性亚单位疫苗及其制备和应用方法。具体为所述保护性疫苗抗原具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列，其制备方法构建质粒pETVP2并转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达并破碎细胞后，自上清中回收重组蛋白，将上述所得的免疫保护性亚单位疫苗蛋白与经LB培养基培养的菌株B187至OD600为0.8后溶于PBS的菌悬液混合，所得疫苗混合液具有对哈氏弧菌免疫保护的作用。本发明所得重组亚单位疫苗具高效保护性，并且应用过程中不需任何商业化佐剂。