专利名称：结合人il－12的人抗体及其生产方法相关申请本申请是要求1999年3月25日提交的美国临时申请序号60/126,603的优先权的非临时申请，所述临时申请的内容通过引用结合到本文中。发明背景人白细胞介素12(IL-12)最近鉴定为一种细胞因子，它具有独特的结构和多效作用(Kobayashi等(1989)J.Exp Med.170827-845；Seder等(1993)Pro.Natl.Acad.Sci.9010188-10192；Ling等(1995)J.Exp Med.154116-127；Podlaski等(1992)Arch.Biochem.Biophys.294230-237)。IL-12在与若干涉及免疫和炎症反应的疾病有关的病理学中起着重要的作用。一篇关于IL-12、其生物活性和在疾病中的作用的综述可见Gately等(1998)Ann Rev.Immunol.16495-521。在结构上IL-12是一种异源二聚体蛋白(称为“p70亚单位”)，它包含通过二硫桥将二者连接在一起的35kDa亚单位(p35)和40kDa亚单位(p40)。所述异源二聚体蛋白主要由诸如单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的抗原提呈细胞产生。这些细胞类型还分泌相对于p70亚单位过量的p40亚单位。p40和p35亚单位在遗传学上是不相关的，而且也没有关于它们具有生物活性的报道，尽管p40同源二聚体可能具有IL-12拮抗剂的作用。在功能上，IL-12在调节抗原特异性1型T辅助(Th1)淋巴细胞和2型T辅助(Th2)淋巴细胞之间的平衡中起重要作用。Th1和Th2细胞控制自身免疫性疾病的发生和发展，IL-12在调节Th1淋巴细胞的分化和成熟中起重要的作用。Th1细胞释放的细胞因子是炎症性细胞因子，包括γ干扰素(IFNγ)、IL-2和淋巴毒素(LT)。Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13促进体液免疫、过敏反应和免疫抑制。与Th1反应在自身免疫性疾病中占优势以及IFNγ的促炎活性一致的是，IL-12可能在与许多诸如类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)和节段性回肠炎的自身免疫性疾病和炎症疾病有关的病理学中起主要作用。已经证实MS病人的IL-12的表达增加，因为文献证实急性MS斑中存在不同水平的p40 mRNA。(Windhagen等，(1995)J.Exp.Med.1821985-1996)。另外，用MS患者表达CD40L的T细胞体外刺激抗原提呈细胞使IL-12产生增加(与对照T细胞相比)，这与CD40/CD40L相互作用是IL-12的有效诱导剂的观测结果一致。与健康对照相比，在RA患者滑液中观测到IL-12 p70水平升高(Morita等(1998)Arthritis and Rheumatism.41306-314)。在RA滑液中细胞因子信使核酸(mRNA)表达类型鉴定主要为Th1细胞因子。(Bucht等，(1996)Clin.Exp.Immunol.103347-367)。IL-12似乎还在与节段性回肠炎(CD)有关的病理学中起重要作用。在节段性回肠炎患者的肠粘膜中观测到IFNγ和IL-12表达增加(Fais等(1994)J.Interferon Res.14235-238；Parronchi等，(1997)Am.J.Path.150823-832；Monteleone等，(1997)Gastroenterology.1121169-1178和Berrebi等，(1998)Am.J.Path.152667-672)。CD患者的粘膜固有层的T细胞的细胞因子分泌类型的特征是主要为Th1反应，包括IFNγ水平明显升高(Fuss等，(1996)J.Immunol.1571261-1270)。而且，CD患者的结肠组织切片显示丰富的表达IL-12的巨噬细胞和表达IFNγ的T细胞(Parronchi等(1997)Am.J.Path.150823-832)。因为人IL-12在各种人类疾病中的作用，因此设计了各种治疗策略来抑制或中和IL-12活性。尤其是寻找结合并中和IL-12的抗体用作抑制IL-12活性的手段。某些最早期的抗体为小鼠单克隆抗体(mAb)，它由IL-12免疫小鼠的淋巴细胞制备的杂交瘤分泌(参见例如Strober等的世界专利申请公布号WO 97/15327；Neurath等(1995)J.Exp.Med.1821281-1290；Duchmann等(1996)J.Immunol.26934-938)。这些小鼠IL-12抗体的体内应用受到限制，因为存在将小鼠抗体给予人类的有关问题，例如血清半衰期短、不能激发某些人类效应物功能以及在人体内诱发抗小鼠抗体的不需要的免疫反应(“human anti-mouseantibody”(HAMA)反应)。一般来说，试图解决在人类使用完全小鼠抗体有关问题的措施包括通过遗传工程改进所述抗体使其成为更接近人类的抗体。例如制备了嵌合抗体，嵌合抗体中所述抗体链的可变区是鼠源性的，而所述抗体链的恒定区是人源性的(Junghans等(1990)Cancer Res.501495-1502；Brown等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 882663-2667；Kettleborough等(1991)Protein Engineering.4773-783)。但是因为这些嵌合抗体和人源化抗体仍然保留部分鼠序列，所以它们仍然可能激发不需要的免疫反应、人抗嵌合抗体(HACA)反应，当长时间给予所述抗体时尤其如此。鼠抗体或其衍生物(例如嵌合抗体或人源化抗体)的优选IL-12抑制剂应该为完全人抗IL-12抗体，因为这样的抑制剂不会激发HAMA反应，即使长期使用也不会激发HAMA。然而，本领域没有关于这类抗体的介绍，因此仍然需要这样的抗体。发明概述本发明提供结合人IL-12的人抗体。本发明还涉及应用本发明的人抗IL-12抗体治疗或预防其病理学涉及IL-12的急性或慢性疾病或病症。一方面，本发明提供结合人IL-12的分离人抗体或其抗原结合部分。
在一个实施方案中，本发明提供选择性突变的人IL-12抗体，包括
使人抗体或其抗原结合部分在优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点进行选择性突变，因为突变产生的增强活性的氨基酸残基而使得它结合人IL-12。
在一个优选实施方案中，本发明提供选择性突变的人IL-12抗体，包括使人抗体或其抗原结合部分在优选选择性诱变位点进行选择性突变，因为突变产生的增强活性的氨基酸残基而使得它结合人IL-12。
在另一个优选实施方案中，使所述选择性突变的人IL-12抗体或其抗原结合部分在一个以上优选选择性诱变位点、接触或超突变位点进行选择性突变，从而使得它具有增强活性的氨基酸残基。在另一个优选实施方案中，在3个以下优选选择性诱变位点、接触或超突变位点选择性突变选择性突变的人IL-12抗体或其抗原结合部分。在另一个优选实施方案中，在2个以下的优选选择性诱变位点、接触或超突变位点选择性突变所述选择性诱变的人IL-12抗体或其抗原结合部分。在再一优选实施方案中，选择性突变所述选择性突变的人IL-12抗体或其抗原结合部分，以便获得目标特异性亲和水平，相对于当用噬菌体展示技术对相同抗原选择抗体时获得的水平，所述目标水平提高。在另一个优选实施方案中，所述选择性突变的人IL-12抗体还保留了至少一个需要特性，例如保留与其他蛋白或人组织的非交叉反应性、保留表位识别、产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0.1s-1或0.1s-1以下的Koff速率常数(rate constant)与人IL-12解离，或者它以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。更优选所述分离的人抗体或其抗原结合部分以1×10-2s-1或1×10-2s-1以下的Koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-7M或1×10-7M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖。更优选所述分离的人抗体或其抗原结合部分以1×10-3s-1或1×10-3s-1以下的Koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-8M或1×10-8M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖。更优选所述分离的人抗体或其抗原结合部分以1×10-4s-1或1×10-4s-1以下的Koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖。更优选所述分离的人抗体或其抗原结合部分以1×10-5s-1或1×10-5s-1以下的Koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-10M或1×10-10M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖。甚至更优选所述分离的人抗体或其抗原结合部分以1×10-5s-1或1×10-5s-1以下的Koff速率常数与人IL-12解离，或者以1×10-11M或1×10-11M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性a)以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；b)具有包含SEQ ID NO1氨基酸序列的重链CDR3；以及c)具有包含SEQ ID NO2氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO3氨基酸序列的重链CDR2；以及具有包含SEQ IDNO4氨基酸序列的轻链CDR2。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO5氨基酸序列的重链CDR1；以及具有包含SEQ ID NO6氨基酸序列的轻链CDR1。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO7氨基酸序列的重链可变区；以及具有包含SEQ ID NO8氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性
a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；b)具有包含SEQ ID NO9氨基酸序列的重链CDR3；以及c)具有包含SEQ ID NO10氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO11氨基酸序列的重链CDR2；以及具有包含SEQID NO12氨基酸序列的轻链CDR2。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO13氨基酸序列的重链CDR1；以及具有包含SEQ ID NO14氨基酸序列的轻链CDR1。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体具有包含SEQ ID NO15氨基酸序列的重链可变区；以及具有包含SEQ ID NO16氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；b)具有包含SEQ ID NO17氨基酸序列的重链CDR3；以及c)具有包含SEQ ID NO18氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO19氨基酸序列的重链CDR2；以及具有包含SEQID NO20氨基酸序列的轻链CDR2。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO21氨基酸序列的重链CDR1；以及具有包含SEQ ID NO22氨基酸序列的轻链CDR1。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO23氨基酸序列的重链可变区；以及具有包含SEQ ID NO24氨基酸序列的轻链可变区。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体包含选自Kabat等论述的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定区或者它们的任何等位基因变异体的重链恒定区(Kabat，E.A.，等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国人类健康服务部(U.S.Department of Heath and HumanServices)，NIH公告第91-3242号)，通过引用包括在本文中。在一个更优选的实施方案中，所述抗体重链恒定区是IgG1。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体是Fab片段或F(ab’)2片段或单链Fv片段。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；b)具有包含选自SEQ ID NO404-SEQ ID NO469的氨基酸序列的重链CDR3；以及c)具有包含选自SEQ ID NO534-SEQ ID NO579的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含选自SEQ ID NO335-SEQ ID NO403的氨基酸序列的重链CDR2；以及具有包含选自SEQ ID NO506-SEQ ID NO533的氨基酸序列的轻链CDR2。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含选自SEQ ID NO288-SEQ ID NO334的氨基酸序列的重链CDR1；以及具有包含选自SEQ ID NO470-SEQ ID NO505的氨基酸序列的轻链CDR1。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分包括含SEQ ID NO23氨基酸序列的重链可变区；以及包括含SEQ ID NO24氨基酸序列的轻链可变区。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体包含如上所述的重链恒定区或Fab片段或F(ab’)2片段或单链Fv片段。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；b)具有包含SEQ ID NO25的氨基酸序列的重链CDR3；以及c)具有包含SEQ ID NO26的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO27的氨基酸序列的重链CDR2；以及具有包含SEQID NO28的氨基酸序列的轻链CDR2。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO29的氨基酸序列的重链CDR1；以及具有包含SEQ ID NO30的氨基酸序列的轻链CDR1。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO31氨基酸序列的重链可变区；以及具有包含SEQ ID NO32氨基酸序列的轻链可变区。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体包含如上所述的重链恒定区或Fab片段或F(ab’)2片段或单链Fv片段。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；b)包括含SEQ ID NO1氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO3氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO5氨基酸序列的重链CDR1，或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO1氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO3氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO5氨基酸序列的重链CDR1的抗体高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO2氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO4氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO6氨基酸序列的轻链CDR1，或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO2氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO4氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO6氨基酸序列的轻链CDR1的抗体高10倍以下。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；b)包括含SEQ ID NO9氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO11氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO13氨基酸序列的重链CDR1，或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO9氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO11氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO13氨基酸序列的重链CDR1的抗体高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO10氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ IDNO12氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO14氨基酸序列的轻链CDR1，或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO10氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO12氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO14氨基酸序列的轻链CDR1的抗体高10倍以下。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；b)包括含SEQ ID NO17氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ IDNO19氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO21氨基酸序列的重链CDR1，或者为其在优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO17氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO19氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO21氨基酸序列的重链CDR1的抗体高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO18氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ IDNO20氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO22氨基酸序列的轻链CDR1，或者为其在优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO18氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO20氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO22氨基酸序列的轻链CDR1的抗体高10倍以下。
本发明还提供编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸分子。一种优选的分离核酸编码包含SEQ ID NO17氨基酸序列的重链CDR3。所述分离的核酸编码抗体重链可变区。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO19氨基酸序列的抗体重链可变区的CDR2。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ IDNO21氨基酸序列的抗体重链可变区的CDR1。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO23氨基酸序列的抗体重链可变区。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO18氨基酸序列的轻链CDR3。所述分离的核酸编码抗体轻链可变区。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO20氨基酸序列的抗体轻链可变区的CDR2。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO22氨基酸序列的抗体轻链可变区的CDR1。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO24氨基酸序列的抗体轻链可变区。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1×10-9M或1×10-9M以下的IC50抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；b)包括含SEQ ID NO25氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ IDNO27氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO29氨基酸序列的重链CDR1，或者为其在优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO25氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO27氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO29氨基酸序列的重链CDR1的抗体高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO26氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ IDNO28氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO30氨基酸序列的轻链CDR1，或者为其在优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO26氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO28氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO30氨基酸序列的轻链CDR1的抗体高10倍以下。
一种优选的分离核酸编码包含SEQ ID NO25氨基酸序列的重链CDR3。所述分离的核酸编码抗体重链可变区。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO27氨基酸序列的抗体重链可变区的CDR2。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ IDNO29氨基酸序列的抗体重链可变区的CDR1。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO31氨基酸序列的抗体重链可变区。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO26氨基酸序列的轻链CDR3。所述分离的核酸编码抗体轻链可变区。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO28氨基酸序列的抗体轻链可变区的CDR2。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO30氨基酸序列的抗体轻链可变区的CDR1。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO32氨基酸序列的抗体轻链可变区。
另一方面，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性a)它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0.1s-1或0.1s-1以下的koff速率常数与人IL-12解离，或者它以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。
b)具有包含选自VH3种系家族成员的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
c)具有包含选自Vλ1种系家族成员的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性a)它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0.1s-1或0.1s-1以下的koff速率常数与人IL-12解离，或者它以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。
b)具有包含选自SEQ ID NO595-667的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
c)具有包含选自SEQ ID NO669-675的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性a)它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0.1s-1或0.1s-1以下的koff速率常数与人IL-12解离，或者它以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。
b)具有包含COS-3种系氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
c)具有包含DPL8种系氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性a)它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0.1s-1或0.1s-1以下的koff速率常数与人IL-12解离，或者它以1×10-6M或1×10-6M以下的IC50抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。
b)具有包含选自VH3种系家族成员的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区包含结构类似于其他VH3种系家族成员CDR2的CDR2和结构类似于其他VH3种系家族成员CDR1的CDR1，而且其中所述重链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
c)具有包含选自Vλ1种系家族成员的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区包含结构类似于其他Vλ1种系家族成员CDR2的CDR2和结构类似于其他Vλ1种系家族成员CDR1的CDR1，而且其中所述轻链可变区因为优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变而具有增强活性的氨基酸残基。
在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的重链CDR3存在突变。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的轻链CDR3存在突变。在另一个实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的重链CDR2存在突变。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的轻链CDR2存在突变。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的重链CDR1存在突变。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的轻链CDR1存在突变。
另一方面，本发明提供带有本发明抗体编码核酸的重组表达载体以及这种载体导入其中的宿主细胞，本发明还包括通过培养本发明的宿主细胞制备本发明的抗体的方法。
再一方面，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它中和人IL-12的活性和至少一种选自狒狒IL-12、狨IL-12、黑猩猩IL-12、弥猴(cynomolgus)IL-12和恒河猴IL-12的其他灵长类IL-12的活性，但是它不中和小鼠IL-12的活性。
再一方面，本发明提供包含本发明抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体的药用组合物。
再一方面，本发明提供包含所述抗体或其抗原结合部分和其他药物如治疗药物的组合物。
再一方面，本发明提供抑制人IL-12活性的方法，包括使人IL-12与本发明的抗体如J695接触，从而抑制人IL-12活性。
再一方面，本发明提供抑制罹患其中IL-12活性有害的疾病的病人的人IL-12活性的方法，包括给予所述病人本发明的抗体如J695，从而抑制所述病人的人IL-12活性。所述疾病可为例如节段性回肠炎、多发性硬化或类风湿性关节炎。
再一方面，本发明的特征为改善抗体或其抗原结合部分的活性以获得预定目标活性的方法，包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)从H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94选择优选选择性诱变位点。
c)分别使选定的优选选择性诱变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得第一组突变抗体或其抗原结合部分；d)评价第一组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定单一选择性诱变位点的突变是否产生具有预定目标活性或部分目标活性的抗体或其抗原结合部分；e)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中逐步组合显示具有改进活性的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分。
f)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体或其抗原结合部分是否具有预定目标活性或部分目标活性。
g)如果步骤d)或f)没有获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分，或者获得只具有部分活性的抗体，则使选自H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96的其他氨基酸残基突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得第二组突变抗体或其抗原结合部分；h)评价第二组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定选自H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96的单个氨基酸残基的突变是否产生具有预定目标活性或部分活性的抗体或其抗原结合部分；i)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中逐步组合显示具有改进活性的步骤g)的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；j)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体或其抗原结合部分是否具有预定目标活性或部分目标活性；k)如果步骤h)或j)没有获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分，或者获得只具有部分活性的抗体，则使选自H33B、H52B和L31A的其他氨基酸残基突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得第三组突变抗体或其抗原结合部分；l)评价第三组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定选自H33B、H52B和L31A的单一氨基酸残基的突变是否产生具有预定目标活性或部分活性的抗体或其抗原结合部分；
m)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中逐步组合显示具有改进活性的步骤k)的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；n)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体或其抗原结合部分是否具有预定目标活性，由此获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分。
另一方面，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；e)对至少一个其他接触位点或超突变位点重复步骤b)至d)；f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合显示具有改进活性的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及g)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
在一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；e)对至少一个其他接触位点或超突变位点重复步骤b)至d)；f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合显示具有改进活性的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及g)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93。在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94。在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，而且以合适表达系统表达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为需要保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分；f)对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤a)至e)；g)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性和至少一种保留特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及h)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；
b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；c)分别使所述选定的接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为需要保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分；f)对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤a)至e)；g)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性和至少一种保留特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及
h)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至d)，所述CDR位点既不是b)项选定的位点，也不是H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96位点；f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定接触或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至d)，所述CDR位点既不是b)项选定的位点，也不是H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94位点；f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和其他特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；f)对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至e)，所述CDR位点既不是b)项选定的位点，也不是H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96位点；g)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性但不影响至少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及h)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种其他特性的保留情况；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的亲和力的方法，包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括
a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性的变化；f)对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至e)，所述CDR位点既不是b)项选定的位点，也不是H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96位点；g)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示具有改进活性但是不影响至少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成具有至少一种保留特性的组合抗体或其抗原结合部分；以及h)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种特性的保留情况；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性而不影响其他特性的方法，包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性并保留其他特性的抗体或其抗原结合部分。
在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)在H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种其他特性的保留情况，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至d)，所述CDR位点既不是b)项选定的位点，也不是H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94和L96位点；f)在所述亲代抗体或其抗原结合部分中组合至少2个单独显示改进活性而且不影响至少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种其他特性的保留情况，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种其他保留特性的抗体或其抗原结合部分。
所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。附图简述

图1A-1B显示一系列结合人IL-12的人抗体的重链可变区的氨基酸序列与种系序列Cos-3/JH3和Dp118 Lv1042的排列对比。Kabat编码用来指示氨基酸位置。显示了Joe 9野生型的全长序列。而其他抗体，只显示了与Joe 9野生型不同的氨基酸位点。
图1C-1D显示一系列结合人IL-12的人抗体的轻链可变区的氨基酸序列的对比。Kabat编码用来指示氨基酸位置。显示了Joe 9野生型的全长序列。而其他抗体，只显示了与Joe 9野生型不同的氨基酸位点。
图2A-2E显示通过定点诱变突变的Y61抗体的重链CDR位点和各位点的相应氨基酸取代。图右侧的条形图显示取代抗体解离速率(实心条)与非突变Y61解离速率(空心条)的比较。
图2F-2H显示通过定点诱变突变的Y61抗体的轻链CDR位点和各位点的相应氨基酸取代。图右侧的条形图显示取代抗体解离速率(实心条)与非突变Y61解离速率(空心条)的比较。
图3证实人抗IL-12抗体J695对弥猴血浆新蝶呤水平的体内效力。
图4显示用胶原免疫小鼠后不同天数的关节炎平均评分的曲线图，证实与用大鼠IgG治疗相比，用C17.15治疗显著减轻关节炎相关症状。发明详述为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。
术语“增强活性的氨基酸残基”包括增强所述抗体活性的氨基酸残基。当然增强活性的氨基酸残基可取代接触位点、超突变位点或优选选择性诱变位点的氨基酸残基，进而在一个或多个CDR中可能存在一个以上的增强活性的氨基酸残基。增强活性的氨基酸残基包括增强抗体的结合特异性/亲和性例如增强抗人IL-12抗体与人IL-12的结合的氨基酸残基。增强活性的氨基酸残基还包括增强抗体例如抑制人IL-12的人IL-12抗体的中和效价的氨基酸残基。
术语“抗体”包括4个多肽链组成的免疫球蛋白分子，4个多肽链是通过二硫键内部连接的2个重链(H)和2个轻链(H)。重链由1个重链可变区(本文简称为HCVR或VH)和1个重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。轻链由1个轻链可变区(本文简称为LCVR或VL)和1个轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结构域CL组成。VH和VL区可进一步分为超变区(称为互补决定区(CDR))和更保守区(称为构架区(FR))，超变区位于构架区之间。各VH和VL由3个CDR和4个FR组成，从氨基末端至羧基末端的排列顺序如下FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体部分”)包括保持特异性结合抗原(例如hIL-12)能力的抗体片段。曾经证实抗体的抗原结合功能可由全长抗体片段完成。属于术语抗体的“抗原结合部分”的结合片段实例包括(i)Fab片段，它是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一价片段；(ii)F(ab’)2片段，它是包括通过铰链区的二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)抗体单臂VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)VH结构域构成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341544-546)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由独立的基因编码，但是它们可利用重组方法以合成接头连接在一起，合成接头使它们能够制成其中VL和VH区成对形成一价分子的单一蛋白链(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science 242423-426和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)。这种单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。也包括其他形式的单链抗体例如双体分子(diabodies)。双体分子是双价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达在单一多肽链上，但是采用短到允许同一链上的这2个结构域成对的接头，由此驱使所述结构域与另一条链的互补结构域成对，而产生2个抗原结合位点(参见例如Holliger，P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 906444-6448；Poljak，R.J.等(1994)Structure 21121-1123)。进而抗体或其抗原结合部分可以成为所述抗体或其抗原结合部分与一个或多个其他蛋白或肽通过共价或非共价结合形成的更大免疫粘附分子的组成部分。这样的免疫粘附分子的实例包括利用链霉抗生物素蛋白核心区制成四聚scFv分子(Kipriyanov，S.M.等(1995)Human Antibodies and Hybridomas 693-101)以及利用半胱氨酸残基、标记肽和C-末端多组氨酸标记制成双价生物素化scFv分子(Kipriyanov，S.M.等(1994)Mol.Immunol.311047-1058)。可采用常规技术例如分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗体，由完整抗体制备诸如Fab和F(ab’)2片段的抗体部分。而且如本文所述，可采用标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。优选的抗原结合部分是完整结构域或成对的完整结构域。
术语“回复突变”是指人抗体的部分或全部体细胞突变的氨基酸被同源种系抗体序列的相应种系残基取代的过程。本发明的人抗体的重链序列和轻链序列分别与VBASE数据库中的种系序列对比，鉴定具有最高同源性的序列。使本发明的人抗体的差异通过突变编码该不同氨基酸的确定核苷酸位置而恢复为种系序列。研究由此鉴定为回复突变的候选对象的各氨基酸的作用是直接还是间接影响抗原结合，而突变后发现影响所述人抗体任何需要特性的任何氨基酸不纳入最终的人抗体；例如选择性诱变方法鉴定的增强活性的氨基酸不进行回复突变。为了使回复突变的氨基酸数目最少，可保留与最接近种系序列不同、但是与第二种种系序列相应氨基酸相同的氨基酸位置，前提是对于所述氨基酸两侧至少10个、优选12个氨基酸，第二种种系序列与本发明人抗体的序列相同而且共线性。可在优化