专利名称：衍生自il-2的免疫调节多肽及其在治疗癌症和慢性感染中的用途的制作方法白细胞介素2(IL_2)是就T细胞描述的首个生长因子。自其被发现以来，其显示出强烈的体外促进T细胞增殖和存活的能力(Smith, KA(1988) Science. 240, 1169-76)和在病毒感染的情况下在体内增强T细胞免疫应答的能力(Blattman，JN，et al. (2003)Nat Med 9,540-7)或在疫苗的情况下的此能力(Fishman, M. , et al. (2008) J Immuno ther.31, 72-80, Kudo-Saito, C. , et al. (2007)Cancer Immunol Immunother. 56，1897-910; Lin, CT, et al. (2007) Immunol Lett. 114，86-93)。然而，最近，多项实验数据质疑了 IL-2作为T免疫应答的促进剂的这种经典作用(Almeida，A. R. , et al. (2002) JImmunol. 169，4850-60; de la Rosa, M. , etal. (2004) Eur J Immunol. 34，2480-8; Malek, T.R. , et al. (2004)Nat Rev Immunol. 4，665-74),这些数据表明该细胞因子是天然调节型T细胞TCD4+CD25+FoxP3+(Treg)的自身稳定性生长因子。白细胞介素-2是调节型T细胞抑制其它效应子细胞、例如CD4辅助T细胞、CD8细胞毒性T细胞和NK细胞的活性和扩增的机制中的主要参与者。特别地，最近有人提出调节型T细胞抑制其它T细胞，诱导IL-2水平的局部降低(Pandiyan，P.，et al. (2007)Nat Immunol. 8，1353-62)。这种抑制性效应是基于a)它们直接抑制它们所抑制的效应子 T 细胞产生 IL-2 (Almeida, A. R. , et al. (2002) J Immunol. 169, 485060; Takahashi, T. , et al. (1998) Int Tmmunol. 10, 1969-80 ; Thornton, A. M. , et al. (1998) J ExpMed. 188，287-96;Wolf, M.，et al. (2001) Eur JImmunoI. 31，1637-45) ;b)迅速且有效消耗它们的微环境中的 IL-2 的能力(Pandiyan, P.，et al. (2007) Nat Immunol. 8，1353-62);和c)过表达 IL-2 α 链受体的能力(Kuniyasu, Y. , et al. (2000) Int Immunol. 12, 1145-55),这使它们能够在IL-2为低浓度时更有效使用IL-2。总之，IL-2是非常多效性的细胞因子，其对于不同细胞群体的生物活性具有非常重要的意义。该性质使IL-2成为免疫应答调节中的重要节点，使其成为免疫调节治疗的受关注的和复杂的靶标。特别地，该细胞因子的作用的多效性使其对于治疗策略(在不同细胞群体中以选择性/优选性方式调节该细胞因子的活性)的设计具有非常重要的意义。IL-2已经被用于癌症治疗有好几年了。特别地，其在数个国家被批准以高剂量用于治疗黑色素瘤和肾细胞癌。然而，IL-2在患者中的直接使用是严重受限制的，因为其毒性效应。所以仅有20%的适合的患者接受进一步的治疗,仅有17%的患者显示出相关的客观反应。临床阶段中这种显著性失败的一个可能的解释是使用天然IL-2的治疗也刺激调节型T细胞群体，其阻碍使用它所追求的免疫刺激(Ahmadzadeh，Μ.，et al. (2006)Blood. 107，2409-14)。已经开发了数种策略来减轻IL-2治疗的毒性效应。这些策略中的一些是基于使用IL-2的突变体，所述变体被设计为增强该分子的信号传导能力，主要是通过高亲和性受体(α、β和Y链)，而不是通过中等亲和性受体(β和Y链)。基本的想法是相对于NK细胞(其被认为是导致所观察到的毒性效应的细胞)中的信号传导，优先促进T细胞上的信号传导。下列发明处于相同的研究路线美国专利7，186，804、美国专利7，105，653、美国专利6，955，807、美国专利No. 5，229，109、美国专利申请20050142106。重要的是要注意这些发明中没有一项涉及具有差别化调控调节型T细胞活性的能力的IL-2突变体。此外，这些发明中的突变体是IL-2的激动剂，不是拮抗剂/抑制剂，例如本申请中描述的那些。已经为了增强IL-2的药理学活性的目的产生了其它的IL-2突变体。例如，为了改善其折叠或延长其在血液中的寿命。其中，下列发明涉及该研究路线美国专利号4，959，314、美国专利号5，116，943、美国专利号4，853，332。同样地，这些突变体中没有一个显示出差别化调控调节型T细胞的活性的能力。、其它现有的发明涉及IL-2活性的抑制剂，主要是为了治疗自身免疫疾病或为了预防器官移植排斥。其中有下列发明美国专利5，876，717、美国专利5，635，597、美国专利6，906，170、美国专利 6，168，785。最后，应该提及，在文献中有很多治疗剂的提议(Kre i tman, R. J. (2009) CurrPharm Des. 15, 2652-64; Litzinger, Μ. T. , Fernando, R. , Curiel, T. J. , Grosenbach, D.ff. , Schlom, J. and Palena, C. (2007) Blood. 110, 3192-201; Morse, Μ. A. , Hobeika, A. C.,Osada, T. , Serra, D. , Niedzwiecki, D. , Lyerly, Η. K. and Clay, T. M. (2008) Blood. 112, 610-8 ; Onizuka, S. , Tawara, I. , Shimizu, J. , Sakaguchi, S. , Fu j ita, T. and Nakayama, E.(1999) Cancer Res. 59, 312833; Quezada, S. A. , Peggs, K. S. , Curran, M. A. and Allison, J.P. (2006) J Clin Invest. 116，1935-45)，它们提出在体内调节或降低调节型T细胞的活性。这些治疗剂已经在动物模型、甚至在患者中进行了测试，以进行直接癌症治疗或增强疫苗的效应。还有一些报告提议调节IL-2的活性,特别是通过单克隆抗体(Boyman, 0.，Kovar,M. , Rubinstein, Μ. P. , Surh, C. D. and Sprent, J. (2006) Science. 311, 1924-1927; Boyman, 0.,et al. (2006)Expert OpinBiol Ther. 6, 1323-31;Kamimura, D. , et al. (2006)J TmmunoI. 177, 306-14; Murakami, M. , Sakamoto, A. , Bender, J. , KappIer, J. and Marrack, P. (2002)Proc Natl Acad Sci USA. 99, 8832-7; Toma I a, J. , Chme I ova, H. , Mrkvan, T. , Rihova, B. andKovar, M. (2009) J Immunol. 183，4904-4912)，以促进更好的或更有效的免疫应答。然而，据我们所知，在文献中没有关于这样的IL-2的突变体的报道支持它们用于选择性或优先调控调节型T细胞的活性的可能性。特别地是这样的IL-2突变蛋白能够选择性/优先拮抗调节型T细胞上的IL-2的活性，从而影响其功能并促进免疫应答的治疗性增强。
本发明是基于以下科学发现IL_2的突变体变体能够产生对于调节型T细胞的优先抑制。本发明人首次发现在体外实验中，IL-2的突变体能够实质上抑制调节型T细胞(T CD4+CD25+FoxP3+)的活性，同时对于具有效应子功能的其它淋巴细胞的激活和/或增殖几乎无影响。该发现提供了在这些细胞相关的疾病、例如癌症或慢性感染中免疫调控调节型T细胞的新的策略。本发明涉及与人IL-2共有初级序列的多肽，但是，其中数个氨基酸发生突变，消除或实质上降低它们通过不同形式的IL-2受体的信号传导。这些IL-2的突变体变体保持与IL-2受体的一个或多个组分结合的能力，并且对于调节型T细胞群体具有优先的抑制活性，在那里它们阴性地调节它们的功能。提供了对于调节型T细胞具有优先抑制性特性的数种具体的IL-2突变体变体。本发明还包括这些突变体的治疗性应用单独使用或与疫苗组合用于治疗其中调节型T细胞(Treg)的活性相关的疾病、例如癌症或慢性感染。本发明提出了在疾病中调控调节型T细胞的活性的新的策略，其中，在所述疾病中，通过这些细胞的抑制减少天然诱导的或由疫苗诱导的保护性免 疫应答。该新的治疗策略的优点相对于调控Treg的活性的其它提议的优点是多方面的，例如 IL_2突变体实质上是自身蛋白(除了一些突变)。该事实降低了预料不到的毒性的风险(这在基于小的抑制剂的策略中是常见的)，或产生针对所注射的药物的免疫应答的风险(这在例如Ontak的策略中将会发生，其中IL-2偶联于外源的和毒性的分子，例如白喉毒素)。 这些IL-2的突变体变体保持对于IL-2的受体的结合亲和性，至少为天然IL_2的亲和性的数量级(对于高亲和性受体为IOpM)。使用受体抑制剂或配体、使用单克隆抗体或其它药物的策略难以达到该亲和性。 这些突变体的尺寸小(15kD)，可使它们具有高移动性并易于刺入肿瘤微环境。已知这对于较大的分子例如抗体等是复杂的。发明详述获得IL-2的类似物多肽本发明涉及100至500个氨基酸的多肽，优选是大小为140个氨基酸的多肽，其表观分子量是至少15kD。这些多肽保持与天然IL2的高水平的序列同一性，超过90%的同一性，在它们的序列区域中，相对于天然IL-2包括2至6个突变。在这些位置中，通过插入不同于天然IL-2的相同位置处的那些氨基酸的氨基酸残基而使这些多肽突变。选择替换原始残基的残基是因为它们具有与原始氨基酸非常不同的理化性质残基从极性变为非极性，从带电变为不带电，从大的变为小的，从酸性变为碱性，等等。本发明的多肽还可以被称作内在的免疫调节多肽，IL-2的类似物或IL-2的突变蛋白，等等。这些多肽是根据IL-2的3D结构(储存于PDB数据库中)设计的，仅在IL-2的那些对应于显著暴露于溶剂的氨基酸的位置处导入突变，这些位置是通过使用公众域的生物信息学程序例如RASMOL，SwissPDBviewer等鉴定的。本发明的多肽可以通过数种方式获得，例如通过蛋白合成。它们也可以通过遗传工程技术获得，例如在细菌例如大肠杆菌中的包涵体中表达它们。还可以使用聚合酶链式反应通过定向诱变技术获得特定位置处的点突变。通过其生物活性选择IL-2的类似物多肽在体外或体内实验中选择同时具有以下特征的本发明的多肽I)这些IL-2的突变体变体丧失对于不同形式的IL-2受体的信号传导能力，或该能力实质上降低。该性质可以通过使用IL-2依赖性的细胞系(例如CTLL2或Kitt225)，或使用鼠和/或人来源的T淋巴细胞或NK细胞在体外增殖测定法中直接测定。这些突变体在这些测定法中应该具有至少为天然IL-2的1/100的刺激活性。2)这些IL-2的突变体(突变蛋白)保持与IL-2受体的一个或多个分子组分结合的能力。该结合能力可以这样测定通过ELISA针对商业上可获得的受体的链、例如受体的α和β链而直接测定；或在受体为阳性的细胞群体上间接进行。在这些测定中，IL-2突变蛋白的识别率应该与天然IL-2相当。3)IL-2的突变体对于淋巴细胞上的天然IL-2活性具有抑制性活性，对于调节型T细胞群体是优先的(至少在T⑶4+⑶25+FoxP3+细胞中)。本发明中包括的IL-2的突变蛋白在一定浓度范围内能够优先或选择性抑制调节型T细胞的活性或扩增，而不影响或仅极小地影响具有效应子功能的其它淋巴细胞(例如T辅助细胞、细胞毒性T细胞或NK细胞)的活性和/或扩增。这些突变蛋白的优先或选择性抑制活性可以在数种体外测试中证实，其中测定在存在数量渐增的突变蛋白的情况下，效应子和调节型群体的混合物对于刺激的应答。在合适浓度范围下，相对于它们对于实验中使用的效应子群体、例如T辅助细胞、细胞毒性T细胞或NK细胞的活性或扩增的抑制，它们对于调节型T细胞的生长或活性的抑制强至少3倍。本发明还包括IL-2突变蛋白的数种具体变体(在表I中公开了具体的突变)，它们具有上述特征而被选择。这些突变蛋白包括显著降低它们的刺激鼠和人淋巴细胞的能力的多个氨基酸置换。然而，它们与受体的α和β链结合的能力保持完整，并且它们获得了抑制(拮抗)IL_2的天然活性的能力。这些突变蛋白的最显著的方面是在包含调节型T细胞和其它效应子T细胞的淋巴细胞的培养物中，它们在一定浓度范围内显示出显著的优先抑制调节型T细胞(CD4+CD25+FoxP3+)的能力。本发明总体上涉及多肽，其具有与人白细胞介素2(IL-2)的序列具有高度同源性的初级序列，在天然IL-2的序列中具有一些点突变。本发明的多肽对于免疫系统具有免疫调节效应，其选择性/优先作用于调节型T细胞。本发明还涉及氨基酸序列如本发明所公开的具体多肽。本发明还涉及包含作为活性成分的本文公开的多肽的药物组合物。最后，本发明涉及所述多肽和药物组合物的治疗性用途，因为它们对于疾病例如癌症和慢性感染性疾病具有免疫调节效应。