专利名称：鸡白痢沙门氏菌减毒突变株△S6702(OmpR)及其构建方法鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌引起雏鸡和火鸡的一种败血性传染病。鸡白痢沙门氏菌多侵害20日龄以内幼雏，引起白色下痢，病死率极高，成年鸡则可带菌而无临床症状。该病既可垂直传播，又有严重的水平传播，所以造成的危害和经济损失巨大。目前在现代医药中使用疫苗预防传染性疾病是最有效的措施，以疫苗接种预防鸡白痢的研究一直未曾间断过，但传统的灭活疫苗和亚单位苗免疫效果不佳，免疫途径不便而逐渐被活疫苗所取代。现代生物学和DNA重组技术以及对沙门氏菌毒力遗传学的深入研究和了解，为该病原体基因组中引入多重、限定、减毒和不能回复的突变提供了可能性，这种突变是制备减毒活疫苗的遗传学基础。近些年来，Red同源重组法作为一种新的基因打靶技术已经被广泛应用于大肠杆菌的基因敲除与基因替换，并应用于其他细菌及病毒的基因敲除。已有学者采用转座子随机插入法鉴定出一些肠炎沙门氏菌与生物膜形成相关基因ompR、spiA、steB(蛋白质类基因)、rpoS、metE、rfaG、rfbH、rhlE(酶类基因)(董红燕， 张小荣，潘志明等，转座子随机插入鉴定肠炎沙门氏菌生物膜形成相关基因，2008，微生物学报)；焦新安等报道减毒鸡沙门氏菌97A疫苗显示出良好的安全性和免疫效果(焦新安， 潘志明，倪振亚等，减毒鸡沙门氏菌安全性和免疫效力初步研究，1998，中国畜禽传染病)， 为评价ompR、spiA、metE.rfaG基因在鸡白痢沙门氏菌毒力中的作用，获得预防鸡白痢的减毒活疫苗候选株，我们分别构建了这4个基因缺失的减毒株。
本发明的目的是提供1株鸡白痢沙门氏菌减毒突变株及其构建方法。所说的鸡白痢沙门氏菌减毒突变株Δ S6702 (OmpR)，是鸡白痢沙门氏菌 {Salmonella pullorum) CGMCC NO:4376。上述所说的鸡白痢沙门氏菌减毒突变株，是用Red同源重组法将鸡白痢沙门氏菌 OmpR基因敲除，获得预防鸡白痢的减毒活疫苗候选株Δ S6702 (OmpR)。具体的构建方法是用一对带有50核苷酸(nt)左右同源臂的氯霉素抗性基因 (CmK)经电转化导入鸡白痢沙门氏菌S6702 (CGMCC N0:4625)白痢沙门氏菌6基因部分缺失并于其中插入CmK，获得抗氯霉素的转化子，再用表达FLP重组酶的辅组质粒电转入抗氯霉素转化子，将抗性基因消除，获得无抗性的突变株，命名为Δ S6702(0mpR)。以1日龄SPF鸡为模型，比较基因缺失突变株与野生株之间毒力的差异，致死率试验结果表明，Δ S6702 (OmpR)突变株的毒力显著降低，是潜在的鸡白痢沙门氏菌减毒候选活疫苗。本发明实现对野生型鸡白痢沙门氏菌菌株的减毒。为研制鸡白痢沙门氏菌减毒活疫苗及活载体疫苗奠定基础。图1.基因的PCR扩增产物及其RFLP图谱M: IOObp DNA marker ；1: 分菌株S6702 基因的PCR扩增结果；2 分菌株 S&lQ2Hin6 I酶切结果。图2. S6702生物膜状态的扫描电镜观察。图3是质粒pkD3的图谱。图4是OmpR同源臂+氯霉素抗性基因打靶片段的PCR扩增结果 M :200 bp marker ； 1: Red 重组的片段。图5是质粒pKD46的图谱。图6是突变株的PCR鉴定M 100 bp marker ；1野生株S6702的PCR扩增片段；2有cat基因突变株的PCR扩增片段；3无⑵ 基因突变株的PCR扩增片段。本发明中所说的S6702，是指鸡白痢沙门氏菌S6702，也称野生株S6702，于2011年 3月1日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为鸡白痢沙门氏菌/^Bor腫)，保藏编号为CGMCC NO:4625。保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明获得的鸡白痢沙门氏菌减毒突变株Δ S6702 (OmpR)于2010年11月四日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为鸡白痢沙门氏菌 {Salmonella /w/Wor腫)，保藏编号为CGMCC N0:4376。保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

1. 1细菌分离
用接种环从疑似鸡白痢病死鸡的肝脏无菌取样，三区划线法分别接种麦康凯琼脂平板、胆硫乳(DHL)琼脂平板、S. S琼脂平板，37°C温箱培养Mh，观察平板上的菌落形态。37°C 培养24h后，在麦康凯培养基、胆硫乳(DHL)琼脂培养基和S. S培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司)上均形成无色、半透明、边缘整齐、光滑型圆形小菌落，直径1. 5mm左右。 挑取可疑菌落进一步纯培养。1.2.细菌鉴定
1.2.1染色镜检革兰氏法染色后，普通光学显微镜下观察菌体形态、测量细菌大小。 革兰氏染色结果显示镜检可观察到散在排列的红色短小直杆菌，大小约为1 μ mX 4 μ m。1. 2. 2生化试验挑取纯培养的单菌落接种三糖铁琼脂培养基及细菌生化微量鉴定管，37°C培养24h后观察结果。实验结果显示三糖铁接种细菌培养后表现斜面红色，底层变黄，不产气。细菌可发酵葡萄糖、甘露糖，不发酵乳糖、麦芽糖、蔗糖、尿素酶、卫矛醇，不产硫化氢。1.2.3 16S rDNA的序列分析按照常规方法提取细菌基因组DNA作为模板，用 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit 中的Forward Primer 与 Reverse Primerl 扩增约500bp的16S rDNA基因。克隆的基因片段送南京金斯特科技有限公司测序。测得的序列在GenBank数据库进行BLAST搜索比对。PCR扩增的16S rDNA条带序列测定长度为526bp。Blast搜索结果表明，与其同源性超过99%的序列都属于沙门氏菌属，故将其归类为沙门氏菌。该菌命名为S6702。测序的结果如SEQ ID NO :1所示。1.2.4血清学鉴定采用玻板凝集法，先用沙门氏菌A-F群0抗原多价血清检测， 再用0抗原单因子血清和H抗原单因子血清分别鉴定。细菌与A-F群多价0抗原血清、Op 09、O12单因子血清凝集，与其余0抗原单因子血清和H抗原单因子血清均无凝集现象。1. 2. 5 PCR-RFLP法鉴别鸡白痢与鸡伤寒沙门氏菌按照参考文献提供的方法进行 [徐耀辉，焦新安，胡青海等.鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌的PCR-RFLP分子鉴别[J].扬州大学学报(农业与生命科学版)，2005, 6 (1): 1-4.]，结果显示以针对基因的引物扩增S6702，可扩增出600bp的目的片段，该条带回收后经历I酶切消化，S6702的片段仍为600bp (见图1)。由此确定该分离株为鸡白痢沙门氏菌。1. 3.生物膜的测定
1.3. 1结晶紫染色定量法按I^ratt等方法进行[Pratt LA, Kolter R. Genetic analysis of Escherichia coli biofilm form ation: roles of flagella, m otility, chem otaxis and type I pili. Molecular microbiology, 1998, 30: 285-293·],将单个菌落接种于3 ml TSB中，于37°C 200 r/m摇振培养过夜；然后用1:10稀释的TSB按 1 100稀释上述培养菌液，转移至96孔聚苯乙烯U型细胞培养板，100 μ 1/孔培养M h ；倾去培养物，去离子水洗三遍，轻轻拍干；每孔加100 μ 1 0. 4%结晶紫染色20 min，再用去离子水洗三次，轻轻拍干；滴加100 μ 1乙醇，溶解后测定OD55tl值，重复三次取平均值。结果显示阳性对照C533的OD55tl值为0. 523 士 0. 036，分离株S6702的OD55tl值为0. 5；34 士 0. 038， 与空白对照差异极显著(OD55tl值0. 105士0.017)。因此该分离株可形成生物膜。1. 3. 2扫描电子显微镜观察法6孔板内放置无菌盖玻片，按上述方法接种细菌后静置培养Mh，在盖玻片上形成生物膜后，3%戊二醛(0. IM磷酸盐缓冲液)固定池， 依次用50%、70%、80%、90%酒精各脱水1次，然后用100%酒精脱水2次，醋酸异戊酯脱水2 次，每次均为5 min, CO2冷冻干燥5 h。载体表面在真空条件下镀金粉，于场发射电子显微镜(FESEM) S4800观察结果。结果显示S6702表现为细菌群聚性增加，在细菌周围有高密度的网状结构的基质样物质，呈典型的生物膜状态(图2)。2. S6702基因突变株的构建
2.1靶基因序列测定 2. 1. 1靶基因的扩增
煮沸裂解法制备鸡白痢沙门氏菌S6702基因组DNA模板，取适量过夜培养的菌液12000 rpm离心10 min，沉淀用灭菌超纯水重悬，100°C水浴10 min，置于冰浴中冷却；12000 rpm 离心10 min,取上清作为PCR模板。根据GenBank上发表的沙门氏菌基因的序列设计
5引物(见表1)，扩增上述基因。25 μι PCR扩增体系如下


本发明涉及一种将野生型鸡白痢沙门氏菌毒力基因缺失的菌株及其构建方法。所说的鸡白痢沙门氏菌减毒突变株△S6702(OmpR)，是鸡白痢沙门氏菌(Salmonellapullorum)CGMCC NO:4376。该菌株是用Red同源重组法将鸡白痢沙门氏菌OmpR基因敲除而获得。鸡白痢沙门氏菌CGMCC NO:4376可作为鸡白痢沙门氏菌减毒候选活疫苗应用。