专利名称：用于生产蛋白的转基因芦荟植物及其相关的方法具有生物活性的蛋白有持续增长的市场，许多的所述生物活性蛋白被应用于治疗目的。目前已有超过160种市售的基于蛋白的药物。未来的两年，另外还有大约50种有希望被批准。现在对治疗性蛋白生产的需求已经超过了工业的产能。为了克服这个问题，预计所述工业的产能需要提高4-5倍。然而，这些治疗性蛋白的生产设备昂贵，并且其建造需要较长的时间。因此，需要更加低成本的生产方法，并且需要所述方法能够缩短达到大规模生产所需要的时间。可以使用一些基于动物的蛋白生产方法。但是，这些方法经常会引入疾病造成的健康风险。这样的风险可能来自于疾病的交叉感染，所述疾病可以同时感染所述动物和例如人类患者的最终使用者。因此，存在一个对生产方法的需求，所述方法需要消除所述生产生物和所述终端使用者之间的交叉感染的可能性。另外，许多现有的生产方法需要大量的处理，以从所述动物或产生治疗性蛋白的其他宿主生物中提取所述治疗性蛋白，并且使所述化合物处于患者可以利用的状态。经过纯化以后，可以将所述蛋白与佐剂或其他载体材料结合以稳定所述蛋白并且使患者可以利用。然而，涉及对治疗性蛋白处理的提取、纯化、在其他溶剂中的再悬浮的过程是复杂和繁琐的，并且可能不利于在对治疗有普遍需求的发展中国家中使用。因此，需要一个简化生产方法，所述方法可以消除或减少治疗性蛋白的提取后处理。
根据本发明的组合物和方法可以解决上述的许多的需求和缺陷，并且将会提供另外的改进和优点，本领域技术人员通过阅读本发明公开的内容将会理解这些改进和优点。在一方面，本发明可以提供一种稳定地整合目标基因的转基因芦荟植物。在另一方面，可以提供新的载体和构建体，以将目标DNA序列整合进芦荟植物的基因组中。所述目标序列可以编码一种生物活性的蛋白。所述生物活性的蛋白可以是干扰素、免疫球蛋白、淋巴因子、生长因子、激素、血液因子、组织相容性抗原、酶、化妆品用蛋白和其他哺乳动物蛋白，或其他目标蛋白。在某些方面，所述目标蛋白是人类蛋白。根据本发明的芦荟植物可以将目标基因转录并翻译成目标蛋白。在一方面，至少一些所述的目标蛋白可以易位到所述芦荟叶的中央部分。在其他方面，所述的目标蛋白可以包含一个信号序列以便于其易位到所述芦荟叶的中央部分。在其他方面，可以提供从芦荟植物上分离单细胞的新方法。仍然在其他的方面，本发明可以提供新的方法，所述方法用于将载体整合到芦荟植物中，并且再生这样的转基因芦荟植物。根据本发明的产生哺乳动物蛋白的转基因芦荟植物可以提供用于生产目标蛋白的、更加经济的可行的选择，所述的目标蛋白例如各种生物活性的蛋白和化妆品用蛋白。在一方面，所述的目标蛋白可以定位于和/或集中在所述芦荟叶的凝胶中。所述的目标蛋白的这种定位可以简化从所述植物中移出所述蛋白。在这方面，所述的目标蛋白可以与位于所述芦荟叶中央部分的非变性凝胶被共提取。因此，本发明可以提供一种转基因植物，与例如烟草和玉米的大部分的转基因植物相比，通常可以更容易地从所述转基因植物获得目标蛋白。而且，本发明可以提供有效的蛋白分离方法。仍然在其他的方面，所述的目标蛋白可能不是特别地位于所述芦荟植物中。然而，所述芦荟植物的解剖学和生理学仍然可以提供 生产目标蛋白的某些其他的优点，本领域的技术人员通过阅读本公开内容将可以理解这些优点。与在细菌和酵母中的产生目标蛋白的常规方法相比，芦荟植物有各种优点。芦荟植物10的所述优点可以包括以某些方式加工蛋白的能力，所述方式不适合于简单的单细胞细菌和酵母，并且是产生具有所需形式的蛋白必须的。例如，这种加工可以包括化学修饰(例如通过糖基化)和某些蛋白的折叠。而且，与基于动物细胞的其他蛋白生产方法相比，芦荟植物生产可以提供显著的成本优势、规模优势和减少可能对人有害的污染的危险。来自根据本发明的转基因芦荟植物的芦荟叶的中心部分的蛋白修饰凝胶从所述芦荟植物取出就可以被直接应用。这可以避免相对复杂的和昂贵的从天然植物材料中提取目标蛋白的过程。在某些方面，从所述叶中提取的凝胶不需要蛋白的提取或处理就可以被直接应用。所述凝胶可以以髓心的形式，所述髓心是从转基因芦荟植物的断裂叶的脱落部分机械地提取的。本发明可以为具有生物活性和/或具有化妆品用途的人和其他哺乳动物蛋白的生产提供经济、可行的选择。通过阅读本公开内容，本领域技术人员将会理解本发明的其他改进和优点。图I显示芦荟叶的横断面解剖的一个实例；图2显示产生胼胝体组织的示例性方法；图3用图表概述了产生转基因芦荟植物的各个步骤；图4用图表显示包含序列信息的质粒载体的组件；图5列出来自玉米的泛素启动子的序列信息，并且突出显示了所述泛素启动子区域；图6A和6B显示根据本发明的方面的质粒载体系统的构建；图7A至7C显示根据本发明的方面的另一个质粒载体系统的构建；图8显示根据本发明的方面的另外一个质粒载体系统的构建；和图9显示根据本发明的方面的整合系统的构建。所有的附图的显示仅仅是为了易于解释本发明的基本教导；在阅读如下的说明之后，所述附图关于各种实施方案的数量、位置、序列、关系和组分的扩展将能够被本领域的技术人员解释或者将在所述技术人员的理解范围内。而且，在阅读如下的说明之后，用于实践本发明的各种方案、工具和组合物将在本领域的技术人员的理解范围内。
本文使用的“有效连接(operably linked) ”的意思是在一个DNA构建体中联合两段或多段DNA片段，以至于一段的功能(如编码蛋白的DNA)被另一段调控(例如启动子、终止序列等)。本文使用的术语“转录”被限定为从一个DNA模板生成一个RNA分子。本文使用的术语“翻译”被限定为从一个RNA模板生成一个多肽。本文使用的“表达的”指产生的，例如，当一个蛋白的对应的DNA被转录成mRNA时，所述mRNA被翻译成一个蛋白，所述蛋白在植物细胞中表达。本发明可以提供表达各种目标蛋白的新转基因芦荟植物10、可以提供产生转基因芦荟植物10的方法和组合物、可以提供从所述转基因芦荟植物10中提取蛋白的方法，并且可以提供来自所述转基因芦荟植物10的组分与目标蛋白的新组合物。根据本发明产生的目标蛋白可以包含一个分泌信号，以帮助所述蛋白在所述髓心18中或者在芦荟叶 12的髓心中蓄积。在一方面，这种蓄积可以至少部分地出现在转基因芦荟植物10的叶的musalegenous 细胞中。所述髓心18或芦荟叶12的浆包含所述叶的组分，当从所述芦荟叶12提取所述组分的时候，所述叶的组分通常至少部分地指的是“凝胶”。本文使用的“凝胶”将指所提取的髓心18和其他相关物质，在从所述芦荟叶12中提取髓心18的时候所述相关物质伴随于所述髓心18，而不管后续处理的程度。根据本发明的一个或多个方面，来自所述芦荟叶12的凝胶可以有修饰组分。在一个具体方面，所述凝胶的组分可以被修饰为包含至少一种外源性的蛋白组分，并被称为“蛋白修饰凝胶”。提取含有相关的目的蛋白的蛋白修饰凝胶可以提供容易获得的蛋白和/或有效的蛋白分离的方法。根据本发明产生和/或提取的蛋白修饰凝胶不需要进行蛋白提取就可以直接被应用。出于示例性目的，本发明的方面通常显示在图I至8中。本发明可以提供转基因植物、组合物，以及通常可以被应用于百合家族的芦荟属的方法。典型地，对本发明的描述参考了在物种中的应用，所述物种选自于芦荟(Aloe vera)(库拉索芦荟)、开普芦荟(Aloeferox)、木立芦荟(Aloe arborescence)。所述芦荟属通常包括一组大的无莖、丛生、多质单子叶植物。这些植物通常指用于本公开内容目的的芦荟植物10。芦荟植物产生的各种化合物已经被应用于药用目的。当存在于一种蛋白修饰凝胶中的时候，这些化合物可以补充根据本发明的转基因的芦荟植物10的生物活性蛋白的药学性质。图I显示转基因的芦荟植物10的芦荟叶12的横断面。所述转基因的芦荟植物10的叶包含一种容易提取的凝胶状蛋白混合物、碳水化合物和所述凝胶中包含的水，所述凝胶主要来自于髓心18。该凝胶状混合物主要位于芦荟叶12的中心区域。已经显示所述凝胶中的各种化合物具有多种药用性质和应用。在一方面，所述凝胶和/或髓心18可以稳定转基因的芦荟植物10产生的、并且位于所述凝胶和/或髓心18中的转基因蛋白。图I特别地显示表皮14、皮层或叶肉16和髓心或髓18。所述表皮14形成所述叶的外层细胞。在本发明的一个方面，一个转基因的芦荟植物10可以包含位于一种或多种这些组织中的芦荟细胞，所述细胞暂时地或稳定地整合一种遗传的构建体，所述遗传构建体被所述芦荟细胞表达。所述皮层16包含富含叶绿体，以及维管束、木质部和韧皮部的细胞。所述髓心18是海绵状的薄壁组织并且至少部分地代表所述凝胶，所述薄壁组织几乎仅由大的皮层细胞组成，所述凝胶可以有助于整合或蓄积一种或多种目标转基因蛋白。
所述表皮14通常由单外层细胞组成。就在所述表皮14的下面是包含维管束网络的皮层16。所述维管束的外支撑通常由鞘细胞提供。所述维管束由三种常见的管状结构组成木质部、韧皮部和相关的大的中柱鞘管。所述木质部将水和矿物质从所述植物的根运送到叶。所述韧皮部在整个植物中运输淀粉和其他合成的物质。所述中柱鞘管包含一种胶乳或树液，所述胶乳或树液含有非常多的轻泻剂蒽醌，特别是芦荟素。所述蒽醌吸收太阳的紫外线，并且防止所述芦荟叶12的中央部分过热，所述芦荟叶12通常的功能是作为所述芦荟植物的水贮藏器官。所述维管束的中柱鞘部分附着到所述表皮14上，而所述维管束的剩余部分突出到所述髓心18中。所述芦荟叶12的最里面和主要部分是髓心18，所述髓心18至少部分地组成所述凝胶。为了提取凝胶，通常认为所述表皮14和皮层16可以包括含有凝胶的鞘。所述提取的凝胶(包含大量的髓心18)通常是稠的并粘的物质，所述物质在历史上为了医学的目的已经被局部应用于皮肤上，例如作为一种烧伤和创伤的治疗物。所述凝胶通常的功能是作为所述芦荟植物的物质的蓄积器。所述皮层16通常合 成多种碳水化合物和糖蛋白，所述碳水化合物和糖蛋白是所述芦荟植物需要的。过量合成的碳水化合物通常被转运到髓心18，与水和某些矿物质一块储存。所述碳水化合物被韧皮部管转运到髓心18的皮层16的细胞的大液泡。然后，因为渗透压的原因水被所述碳水化合物吸收，从而使所述髓心18作为所述芦荟植物的水贮藏器官。通过沿其纵轴破碎芦荟叶12并且挤压所述叶，将周围的鞘中的所述凝胶通过所述断裂面挤出来，可以相对容易地提取所述凝胶。可以将其他的物质与所述凝胶一块从所述叶组织中提取出来。方法概述根据一个或多个本发明的转基因的芦荟植物10通常包含一种或多种DNA构建体，所述DNA构建体稳定地整合在所述植物中以表达一种或多种目标蛋白。根据一个或多个本发明产生一个转基因的芦荟植物可以涉及各种新的组合物和方法。典型地，开发一种或多种DNA构建体以在所述转基因的芦荟植物10中表达一种或多种蛋白。在一方面，单独一种构建体可以表达一种mRNA。在另一方面,单独一种构建体可以表达多种mRNA。在又另一方面，多种构建体可以产生多种mRNA。每种mRNA可以产生一种或多种多肽。为了将所述构建体引入到所述芦荟植物中，芦荟细胞或未分化的胼胝体组织通常被应用，如图2的一般性地显示。所述芦荟细胞和胼胝体组织典型地来自于根或叶分生组织，或者来自于一个芦荟植物的种子。使用许多如图3中图表显示的技术和/或构建体，将所述DNA构建体引入所述芦荟细胞中。通过阅读本公开内容，本领域的技术人员将会知晓某些技术。可以使用各种技术筛选已整合有所需构建体的芦荟细胞或胼胝体组织。典型地，所述DNA构建体将包含一种选择性标记。一旦将目标构建体稳定地引入所述芦荟细胞或胼胝体组织，通常从所述芦荟细胞或胼胝体组织产生芦荟的小植物。可以发育成为包含所述DNA构建的活的转基因的芦荟植物10的芦荟小植物可以组成型地表达或者诱导性地表达目标的一种或多种目标蛋白。依赖于所产生的特定的蛋白和/或是否存在所述蛋白相关的信号序列，目标蛋白可以在所述转基因的芦荟植物10的局部，或者在所述转基因的芦荟植物10的全株中普遍存在。依赖于所述特定的构建体和/或相关的目标蛋白，然后可以通过无性或者有性的方式繁殖所述转基因的芦荟植物10。可以使用许多技术以从所述转基因的芦荟植物10中分离所述蛋白。然后可以进一步地分离和/或进一步地处理所述蛋白。这些处理可以包括酶修饰、化学修饰、掺入合适的佐剂，这些处理以及其他处理对本领域的技术人员来说通过阅读本公开内容后是可以知晓的。在一个方面，可以处理所述蛋白，将它从一种非活性(前体)的形式转变成一种活性形式，以进行所述特定蛋白的具体的应用，。细胞的分离如图2中的示例性序列所示，在整合目标构建体之前，通常从一个芦荟植物中分离芦荟细胞或者芦荟细胞群。通常基于其再生能力来选择用于DNA构建体的芦荟细胞类型。可以使用来自芦荟植物的茎分生组织或根分生组织的分生细胞或者来自芦荟种子的胚的芦荟细胞。然而，所述芦荟植物的许多部分保持再生或形成胼胝体组织的能力，并且也可以使用所述部分。通常可以使用许多技术分离所述细胞，本领域的技术人员通过阅读本公开内容将会知晓所述技术。典型地，使用解剖刀机械地从所述芦荟植物分离所述细胞。或者，其他机械的或非机械的技术可以被应用于分离目标细胞，这是本领域的技术人员通过阅读本公开内容后可以知晓的。一旦分离了合适的芦荟细胞或者芦荟细胞群，通常使所述芦荟细胞在培养基中生长以形成胼胝体组织。虽然某些技术不需要所述 芦荟细胞首先生长成胼胝体组织，但是所述胼胝体组织提供了未分化芦荟细胞的集合的来源，所述未分化芦荟细胞保持产生转基因的芦荟植物10的能力。所述胼胝体组织通常在固体培养基上生长。然而，所述胼胝体组织也可以被置于液体培养基中，并且悬浮生长。所述分生细胞可以从芦荟植物的根尖或叶中分离。分生芦荟细胞也可以从顶端分生组织中分离。典型地，用于分离所述组织的芦荟植物是年轻健康的芦荟植物。通常选择的所述芦荟植物不高于八(8)英寸，并具有六(6)个或少于6个的出生茎。通常通过切割成段在一个芦荟植物的茎上形成创伤。所述创面可以刺激所述芦荟细胞生长。通常，所述胼胝体将主要在所述切表面上开始生长。为了从芦荟叶12分离芦荟细胞，通常从新生枝的远端切段。然后将所述段部分置于生长培养基上。枝顶端分生组织源自于距新生芦荟植物的底端一英寸处的切割。将所述芦荟叶12从所述切面去除，并且防止所述段。在所述“切口”中发现所述分生组织芦荟细胞。通过它们在培养皿上不断生长一形成胼胝体组织或再生枝的能力“选择”或“分离”它们。一旦分离所述分生组织芦荟细胞，就将它们培养在合适的培养基上，并且处于促进胼胝体组织形成的条件下。从种子分离所述胚的芦荟细胞通常包括去除所述种皮以暴露所述胚，并且从所述胚机械地剥离目标芦荟细胞。所述芦荟种子经典型地灭菌处理，并且除去所述种子的外壳。为了从芦荟植物或者芦荟胚机械地移出所述芦荟细胞，通常可以使用解剖刀。一旦从所述种皮中分离胚的芦荟细胞，就将它们培养在合适的培养基上，并且处于促进胼胝体组织形成的条件下。当需要胼胝体组织时，所述分离的芦荟细胞通常在有利于胼胝体组织的条件下生长，这是本领域的技术人员通过阅读本公开内容可以知晓的。典型地，将所述分离的芦荟细胞在合适的固体营养培养基中放置并生长，以在转化之前形成直径大约为Icm大小的胼胝体组织。芦荟细胞通常生长在摄氏23-26度下。合适的培养基包括基础固体或液体培养基，所述培养基将通常包含补充的无机营养素-常量元素(例如氮、硫、磷、钙、镁和钾)和微量元素(例如铁、硼、钴、铜、碘、锰、钥和锌)；包括糖(蔗糖或麦芽糖)和维生素以及辅因子(硫胺素、烟酸、生物素、吡哆素、尤其是肌醇)的有机营养素；氨基酸(例如脯氨素和酪蛋白水解产物)；以及主要是生长素的源(通常是(NAA)，I-萘乙酸；(IAA)，吲哚-3-醋酸；或(2，4-D)，2，4-二氯苯氧代乙酸)和细胞分裂素的源(通常为(BAP) 6-苄氨基嘌呤)的生长调节剂。这些培养基和维生素通常是以预配制的组合物的形式市售，所述组合物具有各种浓度的无机营养素和维生素，并且已知有MS培养基(Murashige-Skoog)、Gamborg培养基或Chu N6培养基。另外，在培养皿(Petri dishe)上生长的细胞通常需要固体基质载体，例如在所述生长培养基中加入琼脂。DNA构建体的形成合适的DNA构建体通常被引入到由分离的芦荟细胞衍生的胼胝体组织，以通过形成转基因的芦荟植物10产生目标蛋白。也可以将DNA构建体弓I入分离的芦荟细胞或成熟的芦荟细胞，这是本领域的技术人员通过阅读本公开内容后可以知晓的。为了增殖所述构建体并且将其引入所述芦荟细胞，DNA构建体通常被整合进入载体(例如质粒或病毒)中。一种示例性质粒载体可以包括由Invitrogen(Carlsbad,California)生产的商品名为pZErO的质粒，出于示例性目的显示在图4的图表中，并且，例如可以包含该质粒的一种或多种功能组件。 根据本发明的DNA构建体可以包括能够在芦荟细胞中起作用的启动子序列、编码目的蛋白的序列、终止序列和能够在芦荟细胞中起作用的翻译起始和终止位点。当正确地配置并组合这些组件的时候，它们可以在芦荟细胞中启动DNA的转录和mRNA的翻译，以及它们各自的终止。所述DNA构建体还可以包括分泌信号。另外，一些目标蛋白，例如干扰素，可以包含一个天然的或合成的结构域，所述结构域指引干扰素的分泌。当所述蛋白离开所述细胞的时候这些分泌信号通常会被切下来，或者在某些情况下这些分泌信号可以保持在所述蛋白上而基本上不影响所述蛋白的功能。可以将分泌信号加到各种需要分泌信号来进行易位的蛋白上。这些分泌信号可以来自于各种植物的分泌序列。所述DNA构建体或一种相关载体也可以包含至少一种可选标记。在一方面，所述DNA构建体可以包含用于所述载体在细菌中的增殖的第一可选标记，和一种用于在芦荟细胞中生长的可选标记。另外，所述DNA构建体可以包含其他的调控元件,所述元件也是为了在所述芦荟植物10中的特定芦荟细胞中表达。其他构建体元件可以包含额外的调控元件，例如增强转录的5’端引导序列和内含子、3’端非翻译区(例如多腺苷酸化信号和位点)、运输肽的DNA。目标DNA序列(例如编码目标治疗蛋白的序列)的扩增可以通过多聚酶链反应来实现(参见编号为4，683，202和5，928，906的美国专利，均通过引用纳入本文)。通过阅读本公开内容，本领域的技术人员将会明白，使用本领域的技术人员已知的方法可以修饰所述DNA构建体以改变它们的功能，所述DNA构建体包括启动子序列、调控序列、稳定序列、靶向序列和/或终止序列。如上文所述，通常可以使用一种在芦荟细胞中起作用的启动子。所述启动子通常包含调控蛋白和分子可以结合的遗传元件。这些蛋白通常包括RNA聚合酶和其他转录因子。所述启动子可以在一个功能位置和/或方向上与核酸序列可操作地连接，以控制该序列的转录起始和/或表达。可以将所述启动子与或者不与一个“增强子”连接，所述增强子是指一种顺式作用调控序列，所述调控序列涉及一段核酸序列的转录激活。自然地，使用一种启动子和/或增强子是重要的，所述启动子和/或增强子在表达必需的芦荟植物10的至少一种细胞类型中可以有效地指导所述DNA片段表达。那些分子生物学领域的技术人员通常知晓启动子、增强子和细胞型组合在蛋白表达中的用途，例如参见Sambrook et al. (1989),通过引用的方式纳入本文中。所述使用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的和/或在合适的条件下起作用的启动子，以指导所述引入的DNA片段的高水平的表达，这对于大规模生产重组蛋白和/或肽是有利的。所述启动子可以是异源的或者内源的。所述DNA构建体通常需要能够在芦荟细胞中起作用的转录和翻译起始和终止调控信号。可以使用大量的调控转录起始的序列。控制转录起始的DNA序列可以来自于农杆菌、病毒或植物。来自花椰菜花叶病毒的35S病毒转录起始区域(35S-CaMV)可以被用于芦荟植物10。可以被应用于芦荟植物10的植物启动子还可以包括来自各种单子叶或双子叶植物的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RUBISCO)小亚基启动子或者来自玉米的泛素启动子。可以使用其他合适启动子，并且这是本领域的技术人员通过阅读本公开内容后可以知晓的。如果需要诱导型调控，那么结构域可以来自不同的来源，使得来自一个来源的调控区域与来自另一个来源的RNA多聚酶结合结构域组合。表达的调控可以是在转基因的芦荟植物的10发育的特定阶段、在所述转基因的芦荟植物10的特定部分(如根、叶、种子、花、树液)中，或者可以是在植物部分和发育阶段的组合中。对一个特定发育阶段或组织的表达调控可能需要其他的DNA元件，这是本领域的技术人员通过阅读本公开内容后是可以知晓的。
许多在植物细胞中有活性的启动子已经在文献中有所描述，并且可能被应用于芦荟细胞中。它们包括存在于植物基因组中的启动子，以及其他来源的启动子，包括根瘤土壤杆菌的根瘤诱导质粒上携带的胭脂碱合酶(NOS)启动子和章鱼碱合酶(OCS)启动子；和例如花椰菜花叶病毒的花椰菜花叶病毒启动子。另外，在各种参考文献中也已经鉴定了各种其他的启动子，所述参考文献包括但不限于编号为5，858，742和5，322，938的美国专利，所述专利公开了来自于花椰菜花叶病毒(CaMV35S)的组成型启动子版本；编号为5，641，876的美国专利，所述专利公开了一种水稻肌动蛋白启动子；公布号为2002/0192813A1的美国专利申请，所述申请公开了在有效植物表达载体设计中有用的5’，3’和内含子元件；序列号为09/757，089的美国专利申请，所述申请公开了一种玉米叶绿体醛缩酶启动子；序列号为08/706，946的美国专利申请，所述申请公开了一种水稻谷蛋白启动子；序列号为09/757,089的美国专利申请，所述申请公开了一种玉米醛缩酶(FDA)启动子；和序列号为No. 60/310，370的美国专利申请，所述申请公开了一种烟胺合酶启动子，所有这些专利和专利申请通过引用的方式纳入本文。这些和大量的在植物细胞中发挥功能的其他启动子可以被应用于转基因芦荟植物中，用于表达目标治疗蛋白。作为一个具体的实例，可以使用来自玉米的所述泛素启动子(SEQ. ID. NO. 44)。所述来自玉米的泛素启动子是一个大的元件，接近2kb长，它由至少三段普通区域组成。所述的启动子的序列在图5中给出，并且标出了特别相关的特征。所述泛素启动子的第一段位于最5’端，并包含基质结合区(MAR)，所述MAR是与组蛋白和其他核蛋白相互作用的元件，并且作为“伸向环外的”侧翼序列，使之更易于接近所述细胞转录装置。它们也协助将转录元件彼此分开，这对于防止在一个位置起始的转录“通读”到第二个序列是重要的。这可以有利于减少形成反义信使的危险。所述第二段包含增强子元件和真正的启动子。所述增强子元件结合转录因子，所述转录因子负责指导所述转录装置(pol II复合体)结合启动子并且起始化转录。虽然“启动子”具体地指与所述核心转录起始装置相互作用必需的必要DNA元件，但是所述术语启动子更广泛地被应用于包括涉及转录起始的所有的DNA元件，并且在这种情况下，所述“泛素启动子”被泛指目标克隆基因5’端的2kb区域或其修饰。第三段包含一段大约Ikb的内含子。内含子是转录的基因的区域，所述区域被通过剪接的步骤从最终翻译的信使(mRNA)中去除。也已经发现，通过备选的增强子元件以及通过促进RNA信使从核到细胞质的易位(部分地与剪接相关的过程)增加蛋白的翻译，内含子可以直接地影响基因表达。然而，在转基因系统中存在内含子不一定总是导致RNA表达或者蛋白翻译水平的提高。在某些方面，所述泛素内含子可以被修饰以减少所述载体的总大小，并且以评估它们对所述芦荟中的转基因表达的作用。在本发明的其他方面，可能需要在所述芦荟植物的绿色组织中优先表达。这种用途需要的启动子可以包括那些来自于如拟南芥核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisc0)小亚基(Fischhoff et al. (1992) Plant MoI Biol. 20 :81-93)、醛缩酶和丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK) (Taniguchi et al. (2000)Plant Cell Physiol. 41(1) :42-48)的基因的启动子。如前所述，可以改变所述启动子以包含多个“增强子序列”，以协助增强基因表达。这样的增强子是本领域中已知的。通过在这样的构建体中包含一个增强子序列，可以增强 所选蛋白的表达。虽然这些增强子通常存在于一个在真核细胞中有功能的启动子的转录起始的5’端，但是也可以将它们插入到所述编码序列的上游(5，)或下游(3’)。在某些情况下，这些5’端增强元件是内含子。作为增强子特别有用的是水稻肌动蛋白1(参见编号为5，641，876的美国专利)和水稻肌动蛋白2基因的5’端内含子、玉米乙醇脱氢酶基因内含子、玉米热休克蛋白70基因内含子(编号为5，593，874的美国专利)和玉米皱缩I基因。根据本发明的方面的构建体可以包含一个3’端元件，所述元件通常包含一个多腺苷信号和位点。众所周知的3’端元件包括那些来自于根癌农杆菌基因的3’端元件，如 nos 3，、tml 3，、tmr 3，、tms 3，、ocs 3，、tr7 3’，例如在编号为 6，090，627 的美国专利中公开的，通过引用的方式纳入本文；来自如小麦(Triticum aesevitum)热休克蛋白17(Hspl73’)、小麦泛素基因、小麦果糖-1，6-二磷酸酶基因、水稻谷蛋白基因、水稻乳酸脱氢酶基因和水稻β微管蛋白基因的植物基因的3’端元件，所有这些元件都在美国公布的专利申请2002/0192813Α1中公开，该文献通过引用的方式纳入本文；和豌豆(Pisumsativum)核酮糖二磷酸羧化酶基因(rbs 3’)，以及来自宿主植物内部的基因的3’端元件。可以被整合进所述DNA构建体中的结构基因编码一种目标蛋白。所述结构基因可以是一个哺乳动物基因或哺乳动物基因的一部分。目标结构基因可以编码干扰素、免疫球蛋白、淋巴因子、生长因子、激素、血液因子、组织相容性抗原、酶或其他蛋白。出于示例性目的，干扰素α -2的序列被作为SEQ. ID. NO. 33列出。结构基因也可以编码标记蛋白，例如来自水母的绿色荧光蛋白(GFP)。可以修饰所述结构基因的DNA序列以使其在芦荟植物10中高水平表达。所述芦荟植物10的密码子偏好可能不同于用于分离所述结构基因的原始物种的密码子偏好。可以改造天然的结构基因以优化所述芦荟植物10中编码的蛋白的产生。此外，可以改造所述结构基因的DNA序列以在芦碁植物10中提供合适的糖基化，所述糖基化不影响所述蛋白的结构。可以通过能够在芦荟植物10中起作用的各种转录和翻译终止序列提供转录和翻译的终止。在一方面，所述终止序列可以包括来自于农杆菌的胭脂碱合酶(NOS)基因的序列。在另一方面，所述终止序列可以衍生自芦荟本身的基因和蛋白的终止序列。在所述DNA构建体中经常整合一个标记基因。利用所述标记基因，可以从所有不包含所述标记基因的细胞群中选择包含目标基因结构的细胞。标记基因可以包括酶或其他蛋白，所述其他蛋白提供卡那霉素、氯霉素、G418和庆大霉素等抗性。如果以例如农杆菌作为一种载体，那么可能还需要其他特异性的DNA序列。如果所述DNA被定位于特定的细胞类型，那么可以有其他区域。如上文所述，所述DNA构建体也可以包括一种分泌信号。构建体还可以包含编码一种信号肽的易位序列，所述信号肽可以定位所述治疗蛋白，用于将所述蛋白从产生它的细胞中移出。在文献中已经鉴定了多种信号序列，所述信号序列在植物中发挥作用，更具体地说是在如芦荟植物的单子叶植物中发挥作用。这些信号序列可以被可操作地整合进入所述构建体中或者目标基因中。在一个方面，可以使用来自于水稻(Oryza sativa)的α淀粉酶分泌序列(SEQ. ID NO. 29)。对这个信号序 列的特征的描述参见"The alpha-amylasegenes in Oryza sativa" MoI Gen Genet. , 1990 April ；221 (2) :235-44,它的全文通过引用的方法纳入本文。或者，一些目标基因——例如干扰素——可以包含一个结构域(天然的或合成的)，所述结构域指导干扰素的分泌。所述分泌信号在所述蛋白离开细胞时被切掉，或者在某些情况下，可以被所述蛋白保留而基本上不影响所述蛋白的功能。分泌信号可以被加到各种需要分泌信号进行易位的蛋白上。这些分泌序列可以衍生自各种植物分泌序列。图6A至6B显示构建体的示例性集合，所述构建体用于从芦荟植物产生蛋白。用pZH(TGC9)标记所述质粒构建体。TGC9包含启动人干扰素α-2和pzUEK(TGC12)(SEQ. ID. NO. 38)表达的全长的泛素启动子、启动包含eGFP(增强的绿色荧光蛋白)(SEQ.ID. NO. 31)和卡那霉素抗性蛋白的融合蛋白表达的全长的泛素启动子。所述融合蛋白将两个蛋白(选择和显示)的筛选性质合并为一。如图所示，使用每条都包含两个不同限制性内切酶位点(引物序列见表I)的PCR引物，通过PCR扩增人干扰素α -2基因产生所述质粒ρζ I (TGC8)。所述扩增的干扰素(IFN)基因具有5’端的PstI和BamHI侧位点，以及3’端的SacI和XhoI侧位点。所述PCR生成的IFN然后作为一个Pstl/Xhol片段克隆进pZErO载体以产生所述构建体pzl (TGC8)，并且为后续的克隆引入所述BamHI和SacI。这个构建体包含全长的IFN α基因和其信号序列，负责指导IFN蛋白从所述细胞的分泌。这显示在滑动图(slide)3上。对这些PCR生成的克隆测序以确定不存在任何的DNA突变。如图所示，通过将IFNa -2基因克隆到所述全长的泛素启动子的下游产生所述质粒载体ρζΠ (TGC9)。将所述IFN的Pstl/Xhol片段从pzl (TGC8)中释放，并且与pzU (TGCl)连接以产生所述构建体ρζΠ (TGC9)。这在滑动图3上显示。如图所示，使用包含BamHI (5’端)和XhoI (3’端)限制性内切酶位点(引物序列见表I)的引物进行eGFP基因的PCR扩增。这个PCR产生的eGFP基因没有终止密码子(以最终使一种eGFP-kan融合蛋白可以被表达)。因此，翻译不在所述eGFP序列末端终止。用限制性内切酶BamHI和XhoI消化所述PCR扩增的片段，并且连接到pZErO的BamHI和XhoI位点中，产生pzEnostop (TGClO)。这显示在滑动图3上。对这些PCR生成的克隆测序以确定不存在任何的DNA突变。如图所示，pzEK (TGCll)形成一种eGFP基因和卡那霉素抗性基因之间的融合构建体。将eGFP以BamHI/XhoI片段形式从pzEnostop (TGClO)释放，并且与pzK(TGC4)连接以产生所述构建体pzEK (TGCll)。所述eGFP基因被克隆到阅读框内，并且在kan/nos (SEQ.ID. NO. 35)的 5’ 端。如图所示，包含eGFP/kan/nos盒的来自pzEK (TGCll)的BamHI/Xbal片段被克隆到ρζΠ (TGC9)的BamHI和XbaI位点，以使eGFP/kan融合基因可以表达。所述IFN序列因此被去除。这个新构建体(pzUEK(TGC12))从全长的泛素启动子(在滑动图4中描述)开始表达所述eGFP/kan融合蛋白。该融合蛋白保持每个单独的蛋白的特性，并且因此明显同时具有显示标记和选择性试剂双功能。图7A至7C显示一个其他示例性构建体集合，所述构建体用于从芦荟植物产生目标蛋白。所示载体使两种基因可以作为一个转录子表达，虽然所述转录子仍然被翻译成两个不同的蛋白。为了实现这个目的，通过插入IRES元件(内部核糖体进入序列)(SEQ.ID. NO. 34)将两个基因彼此分开。所述IRES元件可为核糖体附着和翻译提供一个第二内部 位点。所述第二位点使转录子克隆到所述IRES元件的3’端，以独立地翻译。这些载体，SPpzUSEIrK (TGC18) (SEQ. ID. NO. 43)和 pzUIIrK (TGC19) (SEQ. ID. NO. 39)被分步骤地构建，最终使eGFP或IFN(分别地)与所述卡那霉素抗性标记同时表达。如图所示，通过首先使用包含BamHI (5’端)和Sacl(3’端)限制性内切酶位点(引物序列见表I)的引物进行eGFP基因的PCR扩增来产生pzEnostart (TGC13)载体。该PCR产物作为一个BamHI/SacI片段被克隆进pZErO。在这个构建体中的所述eGFP基因缺少ATG翻译起始位点，因为该蛋白是作为与所述α淀粉酶信号序列(见构建体pzSE，TGC14)的融合体表达的。这显示在滑动图5上。对这些PCR生成的克隆测序以确定不存在任何DNA的突变。如图所示，合成所述α淀粉酶基因的信号序列的一条链，然后通过使用PCR(引物序列见表I)进行填补生成双链。然后，用限制性内切酶PstI和BamHI消化并克隆进pzEnostart (TGC13)。这显示在滑动图5上。所述信号序列被克隆到阅读框中，eGFP的5’端,并且为信号序列eGFP融合体提供翻译起始位点。对产生的pzSE(TGC14)克隆测序以确定不存在任何的DNA突变。如图所示，构建所述载体pzUSE(TGC15)以将α淀粉酶信号序列(ss)-eGFP融合体与具有泛素启动子相连接。来自pzSE(TGC14)的包含所述ss-eGFP的基因盒被作为一个Pstl/SacI片段克隆到pzn(TGC9)中。这替代所述IFN基因盒(通过用限制性内切酶PstI和sacl消化从ρζΠ (TGC9)释放)产生pzUSE (TGC15)。这显示在滑动图5上。如图所示，使用包含SacI (5’端)和XhoI (3’端)限制性内切酶位点的引物进行PCR 扩增从 pIRES2-EGFP(Clontech，BD Biosciences)产生 IRES 元件。所扩增的 IRES 元件作为一个Sacl/Xhol片段被克隆到pZErO中以形成pzlr (TGC16)。这显示在滑动图6上。对这些PCR生成的克隆测序以确定不存在任何的DNA突变。如图所示，然后将来自pzIr(TGC16)的IRES元件作为一个Sacl/Xhol片段克隆到pzK(TGC4)中以形成pzIrK (TGC17)。因此，定位所述kan/nos基因盒的IRES上游。如图所示，所述IRES-kan/nos基因盒作为Sacl/Xbal片段被克隆到pzUSE (TGC15)中以形成pzUSEIrK(TGC18)。这显示在滑动图6上。该构建体将eGFP作为与所述α淀粉酶信号序列的融合体表达，定位所述eGFP以从所述细胞中分泌。这使得可视地监视蛋白在所述转化的植物内的运输和聚积成为可能。该载体还表达所述卡那霉素抗性蛋白(由所述IRES内部元件翻译)，并且使得可以在转基因植物中选择。如图所示，所述IRES-kan/nos基因盒可以作为Sacl/Xbal片段被克隆到pzUI (TGC9)中以形成pzHIrK(TGC19)。这显示在滑动图7上。该构建体表达IFN α-2，它具有用于分泌的信号序列。该载体还表达所述卡那霉素抗性蛋白(由所述IRES内部元件翻译)，并且可以在转基因植物中选择。TGC18和TGC19都以单个的转录子形式表达两个基因，省去了对第二启动子的需求，并且因此缩小了每个载体的总大小。这是重要的，因为缩小转染的构建体的总大小会增加这些元件转移到核中的效率，导致了稳定的整合以及转基因植物的选择。单启动子系统还会降低破坏侧翼基因的表达的风险或者其他可能最终影响转基因表达的情况。上面列出的质粒可以用其他目标编码序列替代所述α干扰素。如本领域的技术人员知晓的，这些替代可以在所述质粒中的相同位点或者其他位点。根据本发明的方面，也可以将一种凝血酶原编码序列(SEQ. ID. NO. 36)整合进一个质粒载体，如图8中所图示显示的。凝血酶原是凝血酶的前体蛋白。它被活化的因 子X (Factor X)在2位切割以释放活化的凝血酶，所述凝血酶是一种凝结蛋白，可以将可溶性的血纤蛋白原转化成不溶的纤维蛋白原带。使用PCR引物(引物序列见表I)扩增所述凝血酶原基因盒(1874碱基对)。利用限制性内切酶BamHI将所述eGFP基因盒从pzUSEIrK(TGC18)载体上释放。随后将所产生的5’突出粘性末端用绿豆核酸酶除去以形成平端。使用小牛肠磷酸酶(CIP)通过在摄氏50度下孵育2个小时进行所述平端的去磷酸化，之后在摄氏15度下与所述凝血酶原基因盒连接过夜。这产生pzUSTIrK(TGC20) (SEQ.ID. NO. 42)。对PCR生成的克隆测序以确定不存在任何的DNA突变。根据本发明的方面，也可以将一种皮离蛋白(Dermcidin)(M))编码序列(SEQ.ID. NO. 30)整合进一个质粒载体，如图8中所图示显示的。皮离蛋白是一种最近报道的宽光谱抗菌肽，被发现在汗腺中组成型的表达。该蛋白分泌到汗液中，并且被转运到表皮的表面。所述PCR扩增的DCD基因盒具有侧翼的BamHI限制性内切酶的位点(引物序列见表I)。所述BamHI消化的DCD基因盒与原来被eGFP占据的pzUSEIrK (TGC18)的BamHI位点连接，形成pzUSDIrK(TGC21)载体(SEQ. ID. NO. 40)。对PCR生成的克隆测序以确定不存在任何的DNA突变。根据本发明的方面，也可以将一种人生长激素(hGH)编码序列(SEQ. ID. NO. 32)整合进一个质粒载体，也如图8中所图示显示的。所述hGH基因盒通过PCR扩增产生，具有侧翼的BamHI限制性内切酶的位点(引物序列见表I)。然后将所述BamHI消化的hGH基因盒与原来被eGFP占据的pzUSEIrK (TGC18)的BamHI位点连接，形成pzUSHIrK (TGC22)载体(SEQ. ID. NO. 41)。对PCR生成的克隆测序以确定不存在任何的DNA突变。根据本发明的方面，也可以将一种人干扰素Y (hIFNg)编码序列整合进一个质粒载体，也如图8中所图示显示的。所述hIFNg基因盒通过PCR扩增产生，具有侧翼的BamHI限制性内切酶的侧位点(引物序列见表I)。然后将所述BamHI消化的hIFNg基因盒与原来被 eGFP 占据的 pzUSEIrK(TGC18)的 BamHI 位点连接，形成 pzUSIfglrK(TGC23)载体(SEQ.ID. NO. 37)。对PCR生成的克隆测序以确定不存在任何的DNA突变。表I用于产生其他表达基因的引物序列表


本发明可以提供转基因的芦荟植物和用于芦荟植物转化的重组构建体，本发明的方面可以被应用于其他单子叶植物。所述重组构建体可以包含一个或多个编码哺乳动物蛋白的DNA序列，和至少一个能够在芦荟植物中指导所述重组蛋白表达的启动子。本发明还提供用于构建和产生一个转基因芦荟植物的方法。本发明包括同时用数个目的基因转染一个芦荟植物的方法。本发明的所述芦荟植物的制备方法可以提供经济地并更安全地大量生产某些生物活性化合物的可能并且更容易为不富裕国家所接受，所述化合物包括用于疾病治疗、诊断和预防的生物药剂。所述芦荟植物产生方法还可以制备用作化妆品的蛋白。