专利名称：可溶性受体br43×2和应用方法在免疫应答过程中发生的细胞相互作用由几种细胞表面受体家族，包括肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的成员所调节。该TNFR家族由多种膜内在糖蛋白受体组成，其中许多联合它们的各自配体调节不同的造血细胞系之间的相互作用(Smith等，细胞和病毒蛋白质的TNF受体超家族激活、共同刺激和死亡(The TNF Receptor Superfamily of Cellular andViral ProteinsActivation，Costimulation and Death)，76959-62，1994；Cosman，干细胞(Stem Cells)12440-55，1994)。一个这样的受体是跨膜激活物及CAML-相互作用物TACI(von Bülow和Bram，科学(Science)228138-41，1997；和WIPO公开文本WO98/39361)。TACI是一个膜结合受体，具有一个含两个富含半胱氨酸假重复的细胞外结构域、一个跨膜域和一个与CAML(钙调节物和亲环蛋白配体)相互作用的细胞质结构域，TACI是一个膜内在蛋白，位于细胞内小泡上，当在Jurkat细胞中超量表达时是NF-AT激活的辅诱导物。TACI与B细胞和一种T细胞亚型相关。von Bulow和Bram(同上)报道，TACI的配体是未知的。已发现本发明的多肽，即仅具有一个富含半胱氨酸假重复的TACI同种型(BR43×2)、TACI和相关的B细胞蛋白质BCMA(Gras等，国际免疫学(Int.Immunol.)171093-106，1995)，可以结合目前称作neutrokineα(WIPO公开文本，WO98/18921)、BlyS(Moore等，科学，285260-3，1999)、BAFF(Schneider等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1891747-56，1999)、TALL-1(Shu等，白细胞生物学杂志(J.Leukoc.Biol.)65680-3，1999)或THANK(Mukhopadhyay等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)27415978-81，1999)的TNF配体ztnf4。因而，BR43×2、TACI和BCMA对于调节ztnf4的活性，尤其是调节B细胞的激活，将是有用的。为此，本发明提供用于调节ztnf4或其它BR43×2、TACI或BCMA配体的活性的蛋白质治疗法、相关的组合物和方法，以及从本文中本领域技术人员将明了的其它用途。发明概述一个方面，本发明提供在哺乳动物中抑制ztnf4活性的方法，包括施用一定量的选自下组的化合物a)含有BR34×2胞外域的多肽；b)含有TACI胞外域的多肽；c)含有BCMA胞外域的多肽；d)含有SEQ ID NO10的序列的多肽；e)与SEQ ID NO2的多肽特异结合的抗体或抗体片段；f)与SEQ ID NO4的多肽特异结合的抗体或抗体片段；g)与SEQ ID NO6的多肽特异结合的抗体或抗体片段；h)与SEQ ID NO8的多肽特异结合的抗体或抗体片段；i)与SEQ ID NO10的多肽特异结合的抗体或抗体片段；k)SEQ ID NO4的多肽；l)SEQ ID NO6的第1-166位氨基酸残基；和m)SEQ ID NO8的第1-150位氨基酸残基。在一个实施方案中，所述化合物是由通过肽键连接在一起的第一部分和第二部分组成的融合蛋白，所述第一部分含有选自下组的多肽a)含有SEQ ID NO8的序列的多肽；b)含有SEQ ID NO2第25-58位氨基酸残基的多肽；c)含有SEQ ID NO6第34-66位氨基酸残基的多肽；d)含有SEQ ID NO6第71-104位氨基酸残基的多肽；e)含有SEQ ID NO6第25-104位氨基酸残基的多肽；f)含有SEQ ID NO8第8-37位氨基酸残基的多肽；g)含有SEQ ID NO8第41-88位氨基酸残基的多肽；h)含有SEQ ID NO8第8-88位氨基酸残基的多肽；而所述第二部分含有另一多肽。在另一个实施方案中，该第一部分还含有选自下组的多肽a)SEQ ID NO2第59-120位氨基酸残基；b)SEQ ID NO6第105-166位氨基酸残基；和c)SEQ ID NO8第89-150位氨基酸残基。在另一个实施方案中，该第一部分选自a)含有BR43×2胞外域的多肽；b)含有TACI胞外域的多肽；和c)含有BCMA胞外域的多肽。在一个相关实施方案中，该第一部分选自a)SEQ ID NO4的多肽；b)SEQ ID NO6的第1-154位氨基酸残基；和c)SEQ ID NO8的第1-48位氨基酸残基。在另一个相关实施方案中，该第二部分是免疫球蛋白的重链恒定区。在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段选自a)多克隆抗体；b)鼠单克隆抗体；c)来源于b)的人源化抗体；和d)人单克隆抗体。在一个相关实施方案中，该抗体片段选自F(ab’)、F(ab)、Fab’、Fab、Fv、scFv和最小识别单位。在另一个实施方案中，所述哺乳动物是灵长类动物。在另一个实施方案中，所述ztnf4活性与B淋巴细胞相关。在另一个有关的实施方案中，该ztnf4活性与激活的B淋巴细胞相关。在又一实施方案中，该ztnf4活性与静息的B淋巴细胞相关。在另一个实施方案中，该ztnf4活性与抗体的产生相关。在一个有关的实施方案中，该抗体的产生与自身免疫病相关。在一个有关的实施方案中，所述自身免疫病是系统性红斑狼疮、重症肌无力、多发性硬化症或类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，该ztnf4活性与哮喘、支气管炎或肺气肿相关。在又一实施方案中，该ztnf4活性与末期肾衰竭相关。在又一实施方案中，该ztnf4活性与肾疾病相关。在一个有关的实施方案中，该肾疾病是肾小球肾炎、脉管炎、肾炎或肾盂肾炎。在又一实施方案中，该肾疾病与肾瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、轻链神经病(light chain neuropathy)或淀粉样变相关。在另一个实施方案中，该ztnf4活性与效应T细胞相关。在一个有关的实施方案中，该ztnf4活性与调节免疫应答相关。在又一实施方案中，该活性与免疫抑制相关。在又一实施方案中，免疫抑制与移植排斥、移植物抗宿主疾病或炎症相关。在另一个实施方案中，该活性与自身免疫病相关。在一个有关的实施方案中，该自身免疫病是胰岛素依赖性糖尿病或Crohn氏病。在另一个实施方案中，该ztnf4活性与炎症相关。在一个有关的实施方案中，该炎症与关节疼痛、肿胀、贫血、败血症性休克相关。在另一个方面，本发明提供用于抑制BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合(receptor-ligand engagement)的方法，包括施用一定量的上述化合物。在另一个实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与B淋巴细胞相关。在另一个有关的实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与激活的B淋巴细胞相关。在又一实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与静息的B淋巴细胞相关。在另一个实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与抗体的产生相关。在一个有关的实施方案中，该抗体的产生与自身免疫病相关。在一个有关的实施方案中，该所述自身免疫病是系统性红斑狼疮、重症肌无力、多发性硬化症或类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与哮喘、支气管炎或肺气肿相关。在又一实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与末期肾衰竭相关。在又一实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与肾疾病相关。在一个有关的实施方案中，该肾疾病是肾小球性肾炎、脉管炎、肾炎或肾盂肾炎。在又一实施方案中，该肾疾病与肾瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、轻链神经病或淀粉样变相关。在另一个实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与效应T细胞相关。在一个有关的实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与免疫应答的调节相关。在又一实施方案中，该活性与免疫抑制相关。在又一实施方案中，免疫抑制与移植排斥、移植物抗宿主疾病或炎症相关。在另一个实施方案中，该活性与自身免疫病相关。在一个有关的实施方案中，该自身免疫病是胰岛素依赖性糖尿病或Crohn氏病。在另一个实施方案中，该BR34×2、TACI或BCMA受体-配体啮合与炎症相关。在一个有关的实施方案中，该炎症与关节疼痛、肿胀、贫血、败血症性休克相关。
在另一个方面，本发明提供编码SEQ ID NO2的多肽的分离多核苷酸分子。还提供SEQ ID NO1的分离多核苷酸分子。在一个有关实施方案中，提供含有以下可操作地连接的元件的表达载体转录启动子、以上描述的多核苷酸分子和转录终止子。在另一个实施方案中，该表达载体还含有可操作地与所述多核苷酸分子连接的分泌性受体-配体啮合序列。本发明还提供其中导入了上述表达载体的培养细胞，其中所述培养细胞表达所述多核苷酸片段所编码的所述多肽。本发明还提供制备多肽的方法，包括培养其中已导入了上述表达载体的细胞；籍此所述细胞表达所述多核苷酸分子编码的所述多肽；和回收所述表达多肽。本发明还提供具有SEQ ID NO2的序列的分离多肽。在一个有关的实施方案中，该多肽与可药用载体(vehicle)组合在一起。
附图简述

图1显示了BR34×2、TACI(vonBülow和Bram，同上)(SEQ ID NO6)、BCMA(Gfas等，同上)(SEQ ID NO6)和BR43×1(SEQ ID NO7)之间的多氨基酸序列比对。图中标出了该富含半胱氨酸假重复和跨膜结构域。
图2显示了可溶性I125-ztnf4与稳定的BHK转染子所表达的TACI和BCMA结合的斯卡查德图分析。
图3A显示了ztnf4辅助激活人B淋巴细胞以增殖并分泌免疫球蛋白。
图3B显示了培养9天后，从有IL4或IL4+IL5时用可溶性ztnf4刺激的B细胞获得的上清液中，所测量到的IgM和IgG水平。
图4显示了在存在IL-4的情况下用可溶性ztnf4或对照蛋白(泛素)体外刺激5天的人外周血B细胞。测试了纯化的TACI-Ig、BCMA-Ig和对照Fc对ztnf4特异性增殖的抑制。
图5A显示了从产生SLE特性的ztnf4转基因动物获得的结果。
图5B显示了用针对CD5、CD4和CD8的抗体染色的ztnf4转基因动物的淋巴结、脾和胸腺细胞。
图5C显示了6-23周龄转基因ztnf4动物的血清中总的IgM、IgG和IgE水平。
图5D显示了在ztnf4转基因动物的肾切片中所鉴定到的肾小球中淀粉样沉积和肾小球膜增厚。
图5E显示了ztnf4转基因小鼠中的效应T细胞。
图6A和B显示了从ZNBWF1小鼠和MRL/lpr/lpr小鼠血清中获得的与SLE的发生相关的ztnf4水平升高。
图7显示了在研究期间出现蛋白尿的NZBWF1小鼠的百分数。
图8显示了与ZNBWF1和MRL/lpr/lpr小鼠的血清相比，通过ELISA测定的ztnf4转基因小鼠和对照同窝出生幼仔的抗dsDNA水平。
通过参考以下详细说明书，本发明的这些和其它方面将是明显的。发明详述在阐述本发明之前，阐明下文中用到的某些术语的定义可能对于本发明的理解将是有帮助的。
亲和标记物在本文中用于指能够与第二多肽结合从而为该第二多肽的纯化或检测作准备，或为该第二多肽与基质的结合提供位点的多肽片段。原则上，任何可以获得其抗体或其它特异性结合剂的肽或蛋白质均可以用作亲和标记物。亲和标记物包括聚组氨酸序列、A蛋白(Nilsson等，EMBO J.41075，1985；Nilsson等，酶学方法(Methods Enzymol.)1983，1991)、谷胱苷肽S-转移酶(Smith和Johnson，基因(Gene)6731，1988)、Glu-Glu亲和标记物(Grussenmeyer等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)827952-4，1985)、P物质、FlagTM肽(Hopp等，生物技术(Biotechnology)61204-10，1988)、链霉亲和素结合肽、或其它抗原表位或结合域。一般参见Ford等，蛋白质表达和纯化(Protein Expression and Purification)295-107，1991。编码亲和标记物的DNA可以从供应商处获得(例如PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)。
等位变体是指占据同一个染色体座位的一个基因的两种或多种不同形式中的任意一种。等位变异通过突变自然发生，并可导致种群内的表型多态现象。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中没有变化)，也可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语“等位变体”在本文中还用于指由一个基因的等位变体编码的蛋白质。也包括由于等位变异而与参考氨基酸序列不同的来自同一物种的相同蛋白质。等位变异是指在编码指定蛋白质的基因中个体之间天然存在的差异。
氨基端和羧基端在本文中用以指示多肽和蛋白质中的位置。在上下文允许的地方，对于多肽或蛋白质的一个特定序列或部分这些术语用以指示邻近或相对位置。例如，在一个蛋白质中位于一个参考序列羧基端的某个序列，其位置与该参考序列的羧基端接近，但不一定位于该完整蛋白质的羧基端。
互补物/抗互补物对(complement/anti-complement pair)；是指在适当条件下形成一个非共价连接的稳定对的不相同部分。例如，生物素和抗生物素蛋白(或链霉亲和素)是一个互补物/抗互补物对的原型成员。其它典型的互补物/抗互补物对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对、有义/反义多核苷酸对等等。当期望该互补物/抗互补物对随后发生解离时，该互补物/抗互补物对优选具有＜10-9M的结合亲和力。
重叠群是指具有一段与另一个多核苷酸毗连的相同或互补序列的多核苷酸。毗连序列被称为与一段指定的多核苷酸序列完全地或沿该多核苷酸的部分序列“重叠”。例如，多核苷酸序列5’-ATGGCTTAGCTT-3’的代表性重叠群是5’-TAGCTTgagtct-3’和3’-gtcgacTACCGA-5’。
多核苷酸分子的互补物是指与参考序列相比具有互补的碱基和相反取向的多核苷酸分子。例如，序列5’ATGCACGGG3’与5’CCCGTGCAT3’互补。
简并核苷酸序列或简并序列是指(与编码多肽的参考多核苷酸分子相比)包括了一个或多个简并密码子的核苷酸序列。简并密码子含有不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(例如，GAU和GAC三联体均编码Asp)。
表达载体线性或环状DNA分子，其含有与为其转录提供条件的其它片段可操作连接并编码目的多肽的片段。这些其它片段可以包括启动子与终止子序列、和任选的一个或多个复制原点、一个或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号等等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或可以同时含有两者的元件。
同种型是指可以由不同基因或由相同基因通过不同拼接产生的一种蛋白质的不同形式。在某些情况中，同种型在运输活性、发育中的表达时间、组织分布、细胞内定位或这些性质的组合上不同。
分离的多核苷酸是指该多核苷酸已从其天然遗传环境中被取出，并因此不含有其它外来的或不想要的编码序列，而且其以适合在遗传工程蛋白质生产系统中应用的形式存在。这些分离的分子是那些从其天然环境中分离出来的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离DNA分子不含有通常与其相连的其它基因，但可以包括天然存在的5’和3’非翻译区例如启动子和终止子。相连区域的鉴定对于本领域的普通技术人员是明了的(见例如，Dynan和Tijan，自然316774-78，1985)。
分离的多肽或蛋白质是在非其天然环境的情况下，例如在脱离血液和动物组织的情况下存在的多肽或蛋白质。在一种优选形式中，该分离的多肽基本不含有其它多肽，尤其是动物来源的其它多肽。优选提供高度纯化形式的多肽，即纯度大于95％，更优选纯度大于99％的多肽。当在本文中使用时，该术语“分离的”并不排除存在另一种物理形式的相同多肽，例如二聚体或其它的糖基化或衍生形式。
可操作地连接当应用于核苷酸片段时，术语“可操作地连接”指这些片段被排列起来，以致它们可以为了预期的目的，例如在启动子中起始转录并沿着编码片段向终止子前进，而协调地发挥功能。
直向同源物(ortholog)是指从一个物种获得的多肽或蛋白质，其是另一个物种的多肽或蛋白质的功能对应物。直向同源物之间的序列差异是物种形成的结果。
多核苷酸是指从5’向3’末端进行阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可以是从天然来源分离的、体外合成的、或是从天然和合成分子的组合制备的。多核苷酸的大小以碱基对(缩写“bp”)、核苷酸(“nt”)或千碱基(“kb”)表示。在上下文允许时，后两个术语可以描述单链或双链多核苷酸。当该术语应用于双链分子时，其用以指整个长度，并应理解为与术语“碱基对”相同。本领域技术人员会知晓，双链多核苷酸的两条链可以在长度上稍有不同，并且它们的末端可以由于酶切的缘故而是交错的；因此在双链多核苷酸分子中并非所有核苷酸都是配对的。这些非配对末端一般长度不超过20个nt。
多肽是通过肽键连接起来的氨基酸残基的聚合物，而不论其是天然产生的还是合成产生的。少于大约10个氨基酸残基的多肽通常被称作“肽”。
启动子是指含有提供用于RNA聚合酶的结合和转录起始的DNA序列的基因部分。启动子序列通常但并不总是存在于基因的5’非编码区中。
蛋白质是含有一或多条多肽链的大分子。蛋白质还可以含有非肽成分，例如糖基。可以通过产生蛋白质的细胞向蛋白质添加糖和其它非肽取代基，而且这些糖和其它非肽取代基随着细胞类型的不同而改变。蛋白质在本文中根据其氨基酸主链结构来定义；一般说来取代基例如糖基并不指明，但可以存在。
受体与生物活性分子(“配体”)结合并介导配体对细胞的作用的细胞相关蛋白质，或该蛋白质的多肽亚基。配体与受体的结合导致受体的变化(并在某些情况中，导致受体的多聚化，即相同或不同的受体亚基的连接)，从而引起受体的一个或多个效应域和细胞内的一个或多个其它分子之间发生相互作用。这些相互作用接着导致该细胞代谢的改变。与受体-配体相互作用连接的代谢事件包括基因转录、磷酸化、去磷酸化、细胞增殖、环AMP产生的增加、细胞钙的转移、膜脂的转移、细胞粘附、肌醇脂的水解和磷脂的水解。BR43×2具有TNF受体的特性，本文将对此作更为详细的讨论。
分泌信号序列编码如下多肽(“分泌肽”)的DNA序列，该多肽作为一个更大多肽的成分指导该更大多肽通过合成该更大多肽的细胞的分泌途径。该更大多肽通常在通过该分泌途径的运输过程中被裂解除去该分泌肽。
可溶性受体不与细胞膜结合的受体多肽。可溶性受体最普遍的是缺乏跨膜域和细胞质域的配体结合受体多肽。可溶性受体可以含有额外的氨基酸残基，例如为纯化该多肽提供条件或为该多肽与基质的结合提供位点的亲和标记物。许多细胞表面受体具有天然存在的可溶性对应物，该对应物经蛋白水解产生，或从另外一种拼接形式的mRNA翻译产生。当受体多肽缺乏足够的跨膜和细胞内多肽片段以分别提供膜锚定或信号转导时，它们被认为基本上没有这些片段。
通过粗略的分析方法(例如凝胶电泳)测定的聚合物的分子量和长度应理解为是近似值。当该值以“大约”X或“近似”X表示时，所描述的X值应理解为准确至±10％。
本文所引用的所有文献均以参考文献的形式完整地并入。
本发明部分基于对受体TACI的一种同种型，即一个1192bp DNA序列(SEQ ID NO1)和其相应多肽序列(SEQ ID NO2)的发现。该同种型被命名为BR43×2。BR43×2的可溶性形式公开于SEQ ID NO4，该多核苷酸编码SEQ ID NO3中的可溶性受体。本发明编码BR43×2受体的多核苷酸和多肽最初是采用人类RPMI 1788文库和N-或C-端FLAG-标记、生物素-或FITC-标记的目前被称为neutrokineα(WIPOWO98/18921)、Blys(Moore等，同上)、BAFF(Schneider等，同上)、TALL-1(Shu等，同上)或THANK(Mukhopadhyay等，同上)的肿瘤坏死因子配体ztnf4，通过信号诱捕克隆(signal trap cloning)鉴定的，这在本文中有更为详细的描述。通过配体结合鉴定阳性库，然后将其分解成单个克隆，分离该cDNA并测序。该BR43×2的推导氨基酸序列(显示于SEQ ID NO2)与已知肿瘤坏死因子受体的比较揭示，BR34×2是TACI的同种型，仅具有一个保守性差的富含半胱氨酸的假重复。
结构上，该TNF受体家族的特征在于，细胞外部分由历史上称作“富含半胱氨酸的假重复”的几个组件构成。一个原型TNFR家族成员具有相继向右排列的4个这样的假重复，每一个长大约29-43个残基。一个典型的假重复具有6个半胱氨酸残基。由于尽管它们看上去似乎来源于一个共同的祖先组件，但又并非完全重复#1、#2、#3和#4假重复具有相互区别的特征性序列特征，因此被称作假重复。p55 TNF受体的晶体结构显示，每一个假重复都相应于一个折叠域，而且所有的4个假重复均折叠成相同的四级结构，并通过二硫键在内部结合在一起。
TACI含有两个富含半胱氨酸的假重复(von Bülow和Bram，同上)，与该TNF受体家族的其它成员相比第一个在结构上是保守的，而第二个的保守性较差。本发明的BR43×2同种型缺少TACI的第一个富含半胱氨酸的假重复，仅保留了第二个保守性较差的重复单位。
对SEQ ID NO2所示BR43×2的推导氨基酸序列进行的序列分析揭示存在一个如下成熟蛋白质，该蛋白质具有一个含有一富含半胱氨酸假重复(SEQ ID NO2的第25-58位残基)的胞外域(SEQ ID NO2的第1-120位残基)、一个跨膜域(SEQ ID NO2的第121-133位残基)和一个细胞质域(SEQ ID NO2的第134-247位残基)。BR34×2的该富含半胱氨酸的假重复具有6个保守的半胱氨酸残基(SEQ ID NO2的第25、40、43、47、54和58位残基)、一个保守的天门冬氨酸残基(SEQ ID NO2的第34位残基)和两个保守的亮氨酸残基(SEQ ID NO2的第36和37位残基)，并与TACI(SEQ ID NO6)的第一个富含半胱氨酸的假重复享有46％的一致性，与BCMA(SEQ ID NO8)的富含半胱氨酸的假重复享有35％的一致性(图1)。该富含半胱氨酸假重复可以用以下基序来表示CX[QEK][QEKNRDHS][QE]X{0-2}[YFW][YFW]DXLLX{2}C[IMLV]XCX{3}CX{6-8}CX{2}[YF]C(SEQ ID NO10)，其中C表示半胱氨酸残基、Q表示谷氨酰胺残基、E表示谷氨酸残基、K表示赖氨酸残基、N表示天冬酰胺残基、R表示精氨酸残基、D表示天门冬氨酸残基、H表示组氨酸残基、S表示丝氨酸残基、Y表示酪氨酸残基、F表示苯丙氨酸残基、W表示色氨酸残基、L表示亮氨酸残基、I表示异亮氨酸残基、V表示缬氨酸残基和X表示除了半胱氨酸之外的任何天然存在的氨基酸残基。方括号“[]”内的氨基酸残基表示在该位置所允许的氨基酸残基变异。括号“{}”内的数目表示在该位置所允许的氨基酸残基数。
本发明还提供SEQ ID NO10所给出的长度在32-40个氨基酸残基的可溶性多肽。
SEQ ID NO4的第1-120位残基所示可溶性BR43×2受体含有一个富含半胱氨酸假重复(SEQ ID NO4的第25-58位残基)，而且缺少SEQID NO2中所示的BR43×2的跨膜和细胞质域。
本领域的技术人员将明了，这些域的边界是大约的，其基础是与已知蛋白质的比对和对蛋白质折叠的预测。这些性质揭示，由SEQ ID NOs1和3的DNA序列编码的受体是TNF受体家族的一个成员。
利用预测可以检测BR43×2表达的针对BR43×1的核苷酸探针所进行的mRNA组织分布的Northern印迹和斑点印迹分析，显示在脾、淋巴结、CD19+细胞中有表达，在混合的淋巴细胞反应细胞、Daudi和Raji细胞中有弱表达。采用逆转录酶PCR，仅在B细胞中检测到BR43×1，而在激活的T细胞中未检测到BR43×1，这与以前针对TACI所报道的(von Bülow和Bram，同上)相同。采用与相应的TACI序列100％重叠的BR43×2探针，在脾、淋巴结和小肠、胃、唾液腺、阑尾、肺、骨髓、胎儿的脾、CD19+细胞和Raji细胞中检测到TACI和BR43×2。
采用Northern印迹分析，在小肠、脾、胃、结肠、阑尾、淋巴结、气管和睾丸中检测到BCMA。在腺淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和腮腺瘤中也检测到BCMA，在CD8+、CD19+、MLR细胞、Daudi、Raji和Hut78细胞中检测到微弱的BCMA。
还采用鼠ztnf4(SEQ ID NO19)进行了Northern印迹分析，与人类TACI、BCMA和BR43×2相同，鼠ztnf4的表达主要在脾和胸腺中被检测到。鼠ztnf4还在肺中表达，并且在皮肤和心脏中检测到微弱表达。
本发明还提供编码本文所公开的BR43×2多肽的多核苷酸分子，包括DNA和RNA分子。本领域的技术人员将很容易明了，鉴于遗传密码的简并性，在这些多核苷酸分子中可以有相当大的序列变异。SEQ ID NO11是包括了编码SEQ ID NO4可溶性BR43×2多肽的所有DNA的一个简并DNA序列。同样，SEQ ID NO12是包括了编码SEQ ID NO2 BR43×2多肽的所有DNA的一个简并DNA序列。本领域技术人员应明了，通过用U取代T，SEQ ID NO12简并序列还提供了编码SEQ ID NO4的所有RNA序列。因此，含有SEQ ID NO11的第1-360位核苷酸、SEQ ID NO12的第1-741位核苷酸、和它们的RNA等同物的编码BR43×2多肽的多核苷酸是本发明所考虑到的。表1列出了SEQ ID NOs11和12中使用的单字母密码，以指示简并核苷酸的位置。“解析(resolution)”是指由密码字母所指示的核苷酸。“互补”是指互补核苷酸的密码。例如Y密码指示C或T，而它的互补R指示A或G，A与T互补，G与C互补。
表1核苷酸 解析 互补 解析AATTCCGGGGCCTTAARAG YCTYCT RAGMAC KGTKGT MACSCG SCGWAT WATHACT DAGTBCGT VACGVACG BCGTDAGT HACTNACGT NACGT表2列出了SEQ ID NOs11和12中使用的简并密码子，其包括了对于一个给定氨基酸的所有可能密码子。
表2氨基酸 单字母密码密码子 简并密码子CysC TGC TGTTGYSerS AGC AGT TCA TCC TCG TCTWSNThrT ACA ACC ACG ACTACNProP CCA CCC CCG CCTCCNAlaA GCA GCC GCG GCTGCNGlyG GGA GGC GGG GGTGGNAsnN AAC AATAAYAspD GAC GATGAYGluE GAA GAGGARGlnQ CAA CAGCARHisH CAC CATCAYArgR AGA AGG CGA CGC CGG CGTMGNLysK AAA AAGAARMetM ATGATGIleI ATA ATC ATTATHLeuL CTA CTC CTG CTT TTA TTGYTNValV GTA GTC GTG GTTGTNPheF TTC TTTTTYTyrY TAC TATTAYTrpW TGGTGGTer. TAA TAG TGATRRAsn|Asp BRAYGlu|Gln ZSAR任何 XNNN
本领域的普通技术人员都将明了，在确定代表编码每一个氨基酸的所有可能密码子的简并密码子时，引入了某种多义性。例如，丝氨酸的简并密码子(WSN)在某些情况中可编码精氨酸(AGR)，而精氨酸的简并密码子(MGN)在某些情况中编码丝氨酸(AGY)。在编码苯丙氨酸和亮氨酸的密码子之间也存在类似的关系。因此，该简并序列所包括的一些多核苷酸可能编码变异的氨基酸序列，但通过参考SEQ ID NOs2和4的氨基酸序列本领域的普通技术人员能够轻易地鉴别出这些变异序列。按本文所描述的方法能够很容易地对变异序列的功能性进行测试。
本领域的普通技术人员还应明了，不同的物种会表现出“偏倚密码子使用”。一般参见Grantham等，核酸研究(Nuc.Acids Res.)81893-912.1980；Haas等，当代生物学(Curr.Biol.)6315-24，1996；Wain-Hobson等，基因(Gene)13355-64，1981；Grosjean和Fiers，基因18199-209，1982；Holm，核酸研究143075-87，1986；Ikemura，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)158573-97，1982。本文所用术语“偏倚密码子使用”或“偏倚密码子”是本领域的一个术语，指在某种物种的细胞中最为频繁使用的蛋白质翻译密码子，由此产生对编码每一种氨基酸的一种或几种可能密码子的偏好(见表2)。例如，苏氨酸(Thr)可以由ACA、ACC、ACG或ACT编码，但在哺乳动物细胞中ACC是最为常用的密码子；在其它物种中，例如昆虫细胞、酵母、病毒或细菌中，可能偏好不同的Thr密码子。可以通过本领域已知的多种方法将一个特定物种的偏倚密码子引入本发明的多核苷酸中。在重组DNA中引入偏倚密码子序列可以例如通过使蛋白质的翻译在特定细胞类型或物种中更为有效而增强蛋白质的产生。因此，SEQ ID NOs11和12中公开的简并密码子序列可以充当模板，用于优化多核苷酸在本领域常用的和本文所公开的多种细胞类型和物种中的表达。可以对含有偏倚密码子的序列进行测试，优化其在各种物种中的表达，并按本文公开的方法测试其功能性。
BR43×2的富含半胱氨酸的假重复中高度保守的氨基酸可以用作鉴定新家族成员的工具。例如，可以采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，从获自各种组织材料或细胞系的RNA，扩增编码上述细胞外配体结合域的序列。尤其是，从BR43×2序列设计的高度简并引物对于该目的是有用的。
在本发明的优选实施方案中，分离的多核苷酸将与相似大小的SEQ IDNO3区域，或其互补序列在严紧条件下杂交。一般地，严紧条件选择为低于一定离子强度和pH下该特异序列的热解链温度(Tm)大约5℃。Tm是(在一定的离子强度和pH下)有50％的目标序列与完全匹配的探针发生杂交时的温度。典型的严紧条件是pH7，盐浓度高达大约0.03M，而且温度至少大约60℃。
正如前面提及的，本发明的分离多核苷酸包括DNA和RNA。用于分离DNA和RNA的方法是本领域所熟知的。尽管DNA也可以采用来自其它组织的RNA来制备或作为基因组DNA来分离，但一般优选从RPMI 1788细胞、PBMNC、静息或激活的转染B细胞或扁桃体组织分离RNA。可以采用盐酸胍提取，之后通过CsCl梯度离心分离来制备总RNA(Chirgwin等，生物化学(Biochemistry)1852-94，1979)。采用Aviv和Leder的方法(美国国家科学院院刊691408-12，1972)，从总RNA制备poly(A)+RNA。采用已知方法从Poly(A)+RNA制备互补DNA(cDNA)。然后通过例如杂交或PCR鉴定并分离编码BR43×2多肽的多核苷酸。
本领域技术人员应明了，SEQ ID NOs1和3中公开的序列仅代表该人类基因的一个等位基因，而且可以预料存在等位变异和其它种拼接。SEQID NOs1和3中所示DNA序列的等位变体，包括那些含有沉默突变的等位变体和那些其中的突变导致氨基酸序列改变的等位变体，均属于本发明的范围之内，同样，SEQ ID NOs2和4的等位变体蛋白质也属于本发明的范围。这些序列的等位变体和拼接变体可以根据本领域已知的标准程序通过探测来自不同个体或组织的cDNA或基因组文库来克隆。
本发明还提供与SEQ ID NOs2和4的多肽以及它们的物种直向同源物基本同源的分离的BR43×2多肽。术语“基本同源”在本文中用以指与SEQ ID NOs2和4中所示序列或它们的直向同源物有50％、优选60％、更优选至少80％的序列一致性的多肽。这些多肽将更优选与SEQ ID NO2或其直向同源物至少90％一致，最优选95％或更高一致。序列一致性百分数通过常规方法测定。见例如Altschul等，Bull.Math.Bio.48603-66，1986和Henikoff和Henikoff，美国国家科学院院刊8910915-9，1992。简要地说，采用10的断缺区空缺罚分、1的断缺区延伸罚分，和表3所显示的Henikoff和Henikoff(同上)“blosum 62”评分矩阵(氨基酸用标准的单字母密码表示)，比对两个氨基酸序列以优化比对分数。然后按如下公式计算一致性百分数
表3A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y VA 4R-1 5N-2 0 6D-2 -2 1 6C 0 -3 -3 -3 9Q-1 1 0 0 -3 5E-1 0 0 2 -4 2 5G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6H-2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8I-1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4L-1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4K-1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5M-1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5F-2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6P-1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5W-3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11Y-2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4多核苷酸分子的序列一致性采用上述公开的比率通过相似方法测定。
基本同源的蛋白质和多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸替代、缺失或添加。这些改变优选在性质上是较小的，即保守氨基酸替代(见表4)和其它不显著影响蛋白质或多肽的折叠或活性的替代；小的缺失，典型的是1至大约30个氨基酸的缺失；和小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端的甲硫氨酸残基、不超过大约20-25个残基的小接头肽或亲和标记物。含有亲和标记物的多肽可以进一步在BR43×2多肽和该亲和标记物之间含有一个蛋白水解切割位点。优选的该位点包括凝血酶切割位点和Xa因子切割位点。
表4保守性氨基酸替代碱性的精氨酸赖氨酸组氨酸酸性的谷氨酸天门冬氨酸极性的谷氨酰胺天冬酰胺疏水的亮氨酸异亮氨酸缬氨酸芳香族的 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小的 甘氨酸丙氨酸丝氨酸苏氨酸甲硫氨酸除了这20个标准氨基酸之外，还可以用非标准氨基酸(例如4-羟脯氨酸，6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)来替代本发明BR43×2多肽的氨基酸残基。可以用有限量的非保守氨基酸、非遗传密码子编码的氨基酸和人造氨基酸来替代BR43×2多肽的氨基酸残基。本发明的蛋白质还可以含有非天然存在的氨基酸残基。
非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2，4-亚甲基脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟基-脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟基乙基半胱氨酸、羟基乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、六氢吡啶羧酸、叔-亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸(2-azaphenylalanine)、3-氮杂-苯丙氨酸、4-氮杂-苯丙氨酸、和4-氟苯丙氨酸。用于将非天然存在的氨基酸残基掺入蛋白质的几种方法是本领域已知的。例如，可以采用应用了化学氨酰化抑制型tRNA抑制无义突变的一种体外系统。用于合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法是本领域已知的。在含有大肠杆菌(E.coli.)S30提取物以及可从商业途径获得的酶和其它试剂的无细胞系统中，对含有无义突变的质粒进行转录和翻译。通过层析纯化蛋白质。见例如Robertson等，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)1132722，1991；Ellman等，酶学方法(MethodsEnzymol.)202301，1991；Chung等，科学259806-9，1993；和Chung等，美国国家科学院院刊9010145-9，1993)。在第二种方法中，通过显微注射突变的mRNA和化学氨酰化的抑制型tRNA，在非洲爪蟾卵母细胞中进行翻译(Turcatti等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)27119991-8，1996)。在第三种方法中，在缺少待被置换的天然氨基酸(例如苯丙氨酸)但存在期望的非天然存在氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸、或4-氟苯丙氨酸)的情况下，培养大肠杆菌细胞。该非天然氨基酸取代其天然对应物掺入蛋白质中。见Koide等，生物化学(Biochem.)337470-6，1994。天然存在的氨基酸残基可以通过体外化学修饰转变成非天然存在的种类。化学修饰可以和定点诱变结合起来，以进一步扩展替代的范围(Wynn和Richards，蛋白质科学(Protein Sci.)2395-403，1993)。
可以用有限数量的非保守氨基酸、非遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸、和人造氨基酸替代BR43×2的氨基酸残基。
本发明BR43×2多肽中的必需氨基酸可以根据本领域已知的程序鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学2441081-5，1989)。将单个丙氨酸突变引入该分子的每一个残基位置，然后测试所获得的突变分子的生物学活性(例如提供在免疫应答期间B细胞应答的降低、自身抗体产生的抑制或降低)，以鉴定对于该分子的活性关键的氨基酸残基。也参见Hilton等，生物化学杂志2714699-708，1996。生物学相互作用位置即配体结合部分例如该富含半胱氨酸的假重复，还可以通过物理分析核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记等技术所测定的结构，以及对推测的接触位置的氨基酸进行突变来确定。见例如de Vos等，科学255306-12，1992；Smith等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224899-904，1992；Wlodaver等，FEBS Lett.30959-64，1992。必需氨基酸的身份还可以从与相关TNFR家族成员例如TACI和BCMA的同源性的分析推断出来。
只要保留保守的半胱氨酸、天门冬氨酸和亮氨酸残基并且不打乱高级结构，还可以在BR43×2的富含半胱氨酸的假重复中进行其它的氨基酸替代。优选参考其它的富含半胱氨酸的假重复的序列来进行BR43×2的富含半胱氨酸假重复中的替代。SEQ ID NO10是一个一般性的富含半胱氨酸假重复，其显示了基于这种比对能够允许的氨基酸替代。在该域中的替代受本文所提及的限制的制约。
采用已知的诱变和筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Saueer(科学24153-7，1988)或Bowie和Sauer(美国国家科学院院刊862152-6，1989)公开的方法，能够进行多个氨基酸替代并对它们进行检测。简而言之，这些作者公开了如下方法，该方法用于同时使多肽的两个或多个位置随机化、筛选功能性多肽、之后对诱变多肽测序，以确定在每一个位置所能够允许的替代谱。其它能够应用的方法包括噬菌体展示(例如Lowman等，生物化学3010832-7，1991；Ladner等，美国专利5，223，409；Huse，WIPO公开文本WO 92/06204)和区域定向诱变(region-directed mutagenesis)(Derbyshire等，基因46145，1986；Ner等，DNA 7127，1988)。
按照Stemmer，自然370389-91，1994，Stemmer，美国国家科学院院刊9110747-51，1994和WIPO公开文本WO 97/20078中所公开的方法，通过DNA改组可以制备本文公开的BR43×2 DNA和多肽序列的变体。简而言之，通过亲本DNA的随机片断化，之后采用PCR进行重新组装，获得随机引入的点突变，然后通过体外同源重组，产生变体DNA。可以通过采用亲本DNA家族，例如来自不同物种的等位变体或DNA，改动该技术，以向该程序中引入额外的可变性。通过选择合乎需要的突变并同时筛去有害改变，选择或筛选期望活性，之后进行更多轮的诱变和分析，从而可以实现序列的快速“进化”。
以上公开的诱变方法可以和检测宿主细胞中克隆诱变多肽活性的大批量自动筛选方法联合。可以从该宿主细胞回收编码活性多肽(例如，提供免疫应答期间B细胞应答的降低、自身抗体产生的抑制或降低)的诱变DNA分子，并采用现代装置对其进行快速测序。这些方法使得可以快速地确定目的多肽中各个氨基酸残基的重要性，并且可以应用于未知结构的多肽。
采用以上所讨论的方法，本领域的普通技术人员能够鉴定和/或制备多种与SEQ ID NO2的第1-120位残基或其等位变体基本同源的，并且保留了野生型蛋白质的B细胞抑制特性的多肽。这些多肽可以包括来自肿瘤坏死因子受体超家族其它成员的额外氨基酸或域、或亲和标记物等等。含有TNFR超家族其它成员的功能域的BR43×2多肽或融合结构，构成了表现出改变的B细胞抑制能力的杂合肿瘤坏死因子受体。
本发明还提供来自其它物种的对应受体和多核苷酸(直向同源物)。这些物种包括但不限于哺乳动物、鸟类、两栖动物、爬行动物、鱼类、昆虫、和其它脊椎和无脊椎动物种类。尤其有意义的是来自其它哺乳动物物种，包括鼠、猪、绵羊、牛、犬、猫、马的BR43×2受体和其它灵长类动物的受体。可以采用本发明提供的信息和组合物联合常规的克隆技术，克隆人类BR43×2受体的直向同源物。例如，可以采用从表达该受体的组织或细胞类型获得的mRNA，克隆cDNA。mRNA的适合来源可以通过使用从本文所公开的序列设计的探针探测Northern印迹来鉴定。然后从阳性组织或细胞系的mRNA制备文库。然后可以通过各种方法，例如通过用基于本文公开序列的完整或部分人cDNA或一或多套简并探针进行探测，分离编码受体的cDNA。还可以采用PCR和根据本文所公开的序列设计的引物，克隆cDNA。在再一种方法中，可以采用该cDNA文库转化或转染宿主细胞，并用针对该受体的抗体检测目的cDNA的表达。相似的技术也可以应用于分离基因组克隆。
本发明的受体多肽，包括全长受体多肽、可溶性受体多肽、多肽片段、和融合多肽，均可以根据常规技术在基因工程化宿主细胞中制备。适合的宿主细胞是能够用外源DNA转化或转染并且能够培养生长的那些细胞类型，包括细菌、真菌细胞、和培养的高等真核细胞。优选真核细胞，尤其是多细胞生物的培养细胞。用于操作克隆的DNA分子并将外源DNA导入各种宿主细胞中的技术公开于Sambrook等，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版，Cold SpringHarbor，NY，1989；和Ausubel等编，当代分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)，John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987。
一般地，将编码BR43×2多肽的DNA序列和其表达所必需的其它遗传元件，一般包括转录启动子和终止子，在表达载体中可操作地连接在一起。该载体一般还将含有一个或多个选择标记和一个或多个复制原点，当然本领域技术人员将明了在某些系统中选择标记可以在不同的载体上提供，而且外源DNA的复制可以通过整合在宿主细胞的基因组中来实现。启动子、终止子、选择标记、载体和其它元件的选择是属于本领域普通技术水平的常规设计。许多这样的元件在文献中均有描述，并且可以通过供应商获得。
为了指导BR43×2多肽进入宿主细胞的分泌途径，在表达载体中提供一个分泌信号序列(又称作信号序列、前导序列、前原序列或前序列)。该分泌信号序列可以是BR43×2多肽的分泌信号序列，或可以来源于另一种分泌蛋白质(例如t-PA)或从头合成。该分泌信号序列以符合正确阅读框的形式与BR43×2 DNA序列连接，并且所处位置将可以指导新合成的多肽进入宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列通常位于编码目的多肽的DNA序列的5’端，但某些信号序列可以被放置在目的DNA序列的别处(见例如Welch等，美国专利5,037,743；Holland等，美国专利5,143,830)。
在本发明中，培养的哺乳动物细胞是适合的宿主。用于将外源DNA导入哺乳动物宿主细胞中的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler等，细胞(Cell)14725，1978；Corsaro和Pearson，体细胞遗传学(SomaticCell Genetics)7603，1981；Graham和Van der Eb，病毒学(virology)52456，1973)、电穿孔(Neumann等，EMBOJ.1841-45，1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等，同上)、和脂质体介导的转染(Hawley-Nelson等，焦点(Focus)1573，1993；Ciccarone等，焦点1580，1993)。重组多肽在培养的哺乳动物细胞中的产生公开于，例如Levinson等，美国专利4,713,339；Hagen等，美国专利4,784,950；Palmiter等，美国专利4,579,821；和Ringold，美国专利4,656,134。适合的培养哺乳动物细胞包括COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL1651)、BHK(ATCC CRL 1632)、BHK 570(ATCC CRL 10314)、293(ATCCCRL 1573；Graham等，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)3659-72，1977)、Jurkat(ATCC CRL-8129)、BaF3(来源于小鼠骨髓的白介素-3依赖性前淋巴样细胞系，见Palacios和Steinmetz，细胞41727-34，1985；Mathey-Prevot等，分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)64133-5，1986)和中国仓鼠卵巢细胞系(例如CHO-K1；ATCC CCL 61)。其它适合的细胞系是本领域已知的，可以从公共保藏处例如美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland获得。一般地，优选强转录启动子，例如来自SV-40或巨细胞病毒的启动子。见，例如美国专利4,956,288。其它适合的启动子包括那些来自金属硫蛋白基因的启动子(美国专利4,579,821和4,601,978)和腺病毒的主要晚期启动子。
一般采用药物筛选来选择插有外源DNA的培养哺乳动物细胞。这些细胞通常被称作“转染子”。在有选择剂的情况中培养并能够将目的基因传递给其后代的细胞被称为“稳定转染子”。优选的选择标记是编码抗生素新霉素抗性的基因。在存在新霉素类药物例如G-418或类似物的情况下进行筛选。还可以应用选择系统以增加目的基因的表达水平，该方法称作“扩增”。扩增按以下方式进行在有低水平的选择剂的情况下培养转染子、之后增加选择剂的量，以选择产生高水平的导入基因产物的细胞。优选的可扩增选择标记是赋予氨甲蝶呤抗性的二氢叶酸还原酶。还可以使用其它药物抗性基因(例如潮霉素抗性、多药物抗性、嘌呤霉素乙酰转移酶)。可以采用引入表型改变的其它一些标记，例如绿色荧光蛋白、或CD4、CD8、I型MHC等细胞表面蛋白质、胎盘碱性磷酸酶，以便通过FACS分拣术或磁珠分离技术等手段从未转染细胞中分拣出转染细胞。
也可以采用其它高等真核细胞作为宿主，这包括植物细胞、昆虫细胞和鸟类细胞。毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为载体用于植物细胞中基因表达的综述参见Sinkar等，生物科学杂志(J.Biosci.)(Bangalore)1147-58，1987。昆虫细胞的转化和外源多肽在其中的产生公开于Guarino等，美国专利5,162,222和WIPO公开文本WO94/06463。可以用通常来源于苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)的重组杆状病毒感染昆虫细胞。见King和Possee，杆状病毒表达系统实验室指南(The Baculovirus ExpressionSystemA Laboratory Guide)，London，Chapman&Hall；O’Reilly等，杆状病毒表达载体实验室手册(Baculovirus Expression VectorsA Laboratory Manual)，纽约，Oxford University Press，1994；和Richardson编，杆状病毒表达实验指南，分子生物学方法(BaculovirusExpressio Protocols.Methods in Molecular Biology)，Totowa，NJ，Humana Press，1995。制备重组BR43×2杆状病毒的第二种方法利用Luckow所描述的基于转座子的系统(Luckow等，病毒学杂志(J.Virol.)674566-79，1993)。该系统利用了转移载体，在Bac-to-BacTM试剂盒(LifeTechnologies，Rockville，MD)中有该系统出售。该系统利用含有Tn7转座子的转移载体pFastBaclTM(Life Technologies)，以使编码BR43×2多肽的DNA移动至以称为“杆粒”的大质粒形式在大肠杆菌中维持的杆状病毒基因组中。见Hill-Perkins和Possee，普通病毒学杂志71971-6，1990；Bonning等，普通病毒学杂志751551-6，1994；和Chazenbalk和Rapoport，生物化学杂志2701543-9，1995。此外，转移载体可以包括一个在表达的BR43×2多肽的C-或N-端带有编码表位标记物的DNA的符合阅读框的融合物，所述表位标记物例如Glu-Glu标记物(Grussenmeyer等，美国国家科学院院刊827952-4，1985)。采用本领域已知的技术，将含有BR43×2的转移载体转化至大肠杆菌中，然后筛选含有指示重组杆状病毒的中断lacZ基因的杆粒。采用普通技术分离含有该重组杆状病毒基因组的杆粒DNA，并用于转染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)的细胞，例如sf9细胞。随后制备表达BR43×2的重组病毒。通过本领域通常使用的方法制备重组病毒原液。
采用该重组病毒感染宿主细胞，典型的是来源于秋粘虫草地夜蛾的细胞系。一般参见Glick和Pasternak，分子生物技术重组DNA的原理和应用(Molecular BiotechnologyPrinciples and Applications)，ASMPress，Washington，D.C.，1994。另一个适合的细胞系是来源于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的High FiveOTM细胞系(Invitrogen)(美国专利#5,300,435)。采用商业可获得的无血清培养基培养和维持这些细胞。对于sf9细胞，适合的培养基是sf900 IITM(Life Technologies)或ESF921TM(Expression Systems)；而对于粉纹夜蛾细胞，适合的培养基是Ex-cell0405TM(JRH Biosciences，Lenexa，KS)或Express FiveOTM(LifeTechnologies)。使这些细胞从大约2－5×105个细胞的接种密度生长至1-2×106个细胞的密度，此时以0.1-10，更典型的是接近3的感染复数(MOI)加入重组病毒原液。在可获得的实验室手册中一般都有该使用程序的描述(King和Possee，同上；O’Reilly等，同上；Richardson，同上)。随后可以采用本文所描述的方法从上清中纯化该BR43×2多肽。
真菌细胞，包括酵母细胞，也可以用于本发明。在这点上尤其有意义的酵母种类包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和Pichia methanolica。用外源DNA转化酿酒酵母细胞并从其中制备重组多肽的方法公开于例如Kawasaki，美国专利4,599,311；Kawasaki等，美国专利4,931,373；Brake，美国专利4,870,008；Welch等，美国专利5,037,743；和Murray等，美国专利4,845,075。通过选择标记确定的表型，通常是药物抗性或在缺乏特定营养物(例如亮氨酸)时的生长能力，选择转化的细胞。用于酿酒酵母的一个优选载体系统是Kawasaki等公开的POT1载体系统(美国专利4,931,373)，该系统允许通过在含有葡萄糖的培养基中的生长来选择转化细胞。用于酵母的适合启动子和终止子包括那些来自糖酵解酶基因(见例如Kawasaki，美国专利4,599,311；Kingsman等，美国专利4,615,974；和Bitter，美国专利4,977,092)和醇脱氢酶基因的启动子和终止子。也参见美国专利4,990,446；5,063,154；5,139,936和4,661,454。用于其它酵母，包括多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、巴斯德毕赤酵母、Pichia methanolica、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillermondii)和Candida maltosa，的转化系统是本领域已知的。见例如Gleeson等，普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)1323459-65，1986和Cregg，美国专利4,882,279。可以根据McKnight等，美国专利4,935,349的方法应用曲霉属(Aspergillus)细胞。Sumino等，美国专利5,162,228公开了用于转化Acremonium chrysogenum的方法。Lambowitz，美国专利4,486,533公开了用于转化链孢霉属(Neurospora)的方法。
例如，Pichia methanolica作为宿主在制备重组蛋白质中的应用公开于Raymond，美国专利5,716,808；Raymond，美国专利5,736,383；Raymond等，酵母(Yeast)1411-23，1998；和国际公开文本WO 97/17450、WO 97/17451、WO 98/02536和WO 98/02565。用于转化P.methanolica的DNA分子通常制备成双链环状质粒，并优选在转化之前将其线性化。对于在P.methanolica中制备多肽，优选质粒中的启动子和终止子是P.methanolica基因，例如P.methanolica的醇利用基因(AUG1或AUG2)的启动子和终止子。其它有用的启动子包括二羟丙酮合成酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)和过氧化氢酶(CAT)基因的启动子。为了有利于该DNA整合至宿主染色体中，优选使质粒的完整表达片段在两个末端被宿主DNA序列所包围。用于Pichia methanolica的优选选择标记是P.mehanolica编码5-氨基咪唑核苷酸羧化酶(AIRC；EC 4.1.1.21)的ADE2基因，该基因允许ade2宿主细胞在缺少腺嘌呤的情况下生长。对于大规模的工业程序，可能期望使甲醇的使用最小化，这时优选采用其中两个甲醇利用基因(AUG1和AUG2)均已缺失的宿主细胞。对于分泌蛋白质的制备，优选液泡蛋白酶(vacuolor protease)基因(PEP4和PRB1)缺陷的宿主细胞。采用电穿孔促使含有编码目的多肽的DNA的质粒导入P.methanolica细胞中。优选采用具有2.5-4.5kv/cm，优选大约3.75kv/cm的场强度，和1-40毫秒，最优选大约20毫秒的时间常数(t)的按指数规律衰减的脉冲电场，通过电穿孔转化P.methanolica细胞。
在本发明中，原核宿主细胞，包括大肠杆菌、芽孢杆菌属和其它属的菌株，也是有用的宿主细胞。用于转化这些宿主并在其中表达克隆的外源DNA序列的技术是本领域所熟知的(见例如Sambrook等，同上)。当在细菌例如大肠杆菌中表达BR43×2多肽时，可以将该多肽典型地作为不溶性颗粒保留在细胞质中，或可以通过细菌分泌序列指导其进入周质间隙。在前一种情况下，裂解细胞，并回收这些颗粒，然后采用例如异硫氰酸胍或尿素进行变性。之后可以通过稀释该变性剂，例如通过对尿素溶液以及还原型和氧化型谷胱甘肽的组合物进行透析，然后对缓冲盐溶液透析，使该变性多肽重新折叠并二聚化。在后一种情况中，可以通过如下步骤从周质间隙中以可溶性的功能形式回收该多肽破坏细胞(例如通过超声或渗透震扰)以释放出周质间隙的内容物并回收该蛋白质，由此避免了对变性和重折叠的需要。
根据常规程序在含有营养物和对于所选宿主细胞的生长所必需的其它成分的培养基中，培养转化或转染的宿主细胞。多种适合培养基，包括已知成分培养基和复杂培养基，是本领域已知的，并且一般包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。如果需要，培养基还可以含有生长因子或血清等成分。生长培养基一般通过例如药物选择，或表达载体上或共转染至宿主细胞中的选择标记所弥补的必需营养物的缺乏，对含有外来添加DNA的细胞进行选择。在含有充足碳源、氮源和痕量营养物的培养基中大约25℃-35℃培养P.methanolica细胞。通过常规手段，例如振荡小摇瓶或喷射(sparge)发酵罐，给液体培养物提供足够的通气量。对于P.methanolica，一种优选的培养基是YEPD(2％D-葡萄糖、2％BactoTM蛋白胨(Difco Laboratories，Detroit，MI)、1％BactoTM酵母提取物(Difco Laboratories)、0.004％腺嘌呤和0.006％L-亮氨酸)。
表达的重组BR43×2多肽(或嵌合或融合BR43×2多肽)可以采用分级分离和/或常规纯化方法和介质纯化。优选提供高纯度形式的本发明蛋白质或多肽，即大于95％的纯度、更优选大于99％的纯度。硫酸铵沉淀和酸或离液剂提取可以被用于样品的分级分离。典型的纯化步骤可以包括羟基磷灰石、大小排阻、FPLC和反向高效液相层析。适合的阴离子交换介质包括葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特级硅胶等的衍生物。优选PEI、DEAE、QAE和Q的衍生物，尤其优选DEAE Fast-FlowSepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)。典型的层析介质包括那些用苯基、丁基或辛基衍生的介质，例如苯基-Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearl丁基650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、辛基-Sepharosse(Pharmacia)等等；或聚丙烯树脂，例如Amberchrom CG 71(Toso Haas)等。适合的固相支持物包括玻璃珠、硅基树脂、纤维素树脂、琼脂糖珠、交联琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、交联聚丙烯酰胺树脂以及在其使用的条件下不会溶解的同类物质。可以用允许蛋白质通过氨基、羧基、巯基、羟基和/或糖类部分附着的活性基团来修饰这些支持物。偶联化学的例子包括溴化氰活化、N-羟基琥珀亚胺活化、环氧化物活化、巯基活性、酰肼活化、和用于碳二亚胺偶联化学的羧基和氨基衍生物。这些和其它固相介质是本领域所熟知和广泛应用的，并可以从供应商处获得。用于使受体多肽与支持介质结合的方法是本领域所熟知的。具体方法的选择是一项常规设计，其部分取决于所选支持物的性质。见例如亲和层析原理和方法(Affinity ChromatographyPrinciple&Methods)，Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，瑞典，1988。
可以利用其物理性质分离本发明的多肽。例如，可以采用固定化的金属离子吸附(IMAC)层析纯化富含组氨酸的蛋白质，包括那些含有聚组氨酸标记物的蛋白质。简而言之，首先用二价金属离子挂载凝胶以形成螯合物(Sulkowski，生物化学进展(Trends in Biochem.)31-7，1985)。富含组氨酸的蛋白质将被吸附在该基质上，吸附亲和力随着所用金属离子的不同而不同，然后通过竞争性洗脱、降低pH或使用强鏊合剂将其洗脱下来。其它纯化方法包括通过凝集素亲和层析和离子交换层析纯化糖基化蛋白质(酶学方法，第182卷，“蛋白质纯化指导(Guide to ProteinPurification)”，M.Deutscher(编)，Acad.Press，San Diego，1990，第529-39页)。在本发明的其它实施方案中，可以构建目的多肽与亲和标记物(例如，麦芽糖结合蛋白、FLAG-标记物(Asp Tyr Lys Asp Asp AspAsp Lys(SEQ ID NO13))、Glu-Glu标记物(Glu Glu Tyr Met Pro MetGlu(SEQ ID NO14))、免疫球蛋白域)的融合物，以便于纯化。
可以有利地采用蛋白质的重折叠(和任选重氧化)过程。优选将该蛋白质纯化至＞80％的纯度，更优选＞90％的纯度，甚至更优选＞95％的纯度，尤其优选该蛋白质处于药用纯的状态，即就污染的大分子，尤其是其它蛋白质和核酸而言纯度大于99.9％，而且不含有感染性和致热性试剂。优选地，纯化的蛋白质基本上不含有其它蛋白质，尤其是动物来源的其它蛋白质。
BR43×2多肽或其片段也可以通过化学合成制备。BR43×2多肽可以是单体或多体；糖基化的或非糖基化的；PEG化(pegylated)或非PEG化的；而且可以包括或不包括起始甲硫氨酸残基。BR43×2多肽的实例包括长度在32-40个残基之间，具有符合如下基序的氨基酸序列XXCX[QEK][QEKNRDHS][QE]X{0-2}[YFW][YFW]DXLLX{2}C[IMLV]XCX{3}CX{6-8}CX{2}[YF]CXX(SEQ ID NO10)，并且服从本文所描述的限制的多肽。
BR43×2多肽可以通过全部固相合成、部分固相方法、片段缩合或经典的溶液合成方式合成。优选通过固相肽合成，例如按Merrifield，美国化学协会杂志852149，1963所描述的方法，制备该多肽。该合成用α-氨基端受保护的氨基酸来进行。具有不稳定侧链的三功能氨基酸也用适合的基团保护起来，以避免在该多肽的组装期间发生不需要的化学反应。选择性地除去该α-氨基保护基团以允许在该氨基端继续随后的反应。用于除去该α-氨基保护基团的条件并不除去该侧链保护基团。
该α-氨基保护基团是已知在逐步多肽合成领域中有用的那些基团。包括酰基类保护基团(例如甲酰基、三氟乙酰基、乙酰基)、芳基类保护基团(例如生物素基)、芳香氨基甲酸酯(urethane)类保护基团(例如苄氧基羰基(Cbz)、取代的苄氧基羰基和9-芴甲氧基羰基(Fmoc))、脂肪族氨基甲酸酯保护基团(例如，t-丁氧基羰基(tBoc)、异丙氧基羰基、环己基氧基羰基)和烷基类保护基团(例如苯甲基、三苯甲基)。优选的保护基团是tBoc和Fmoc。
所选择的侧链保护基团必须在偶联期间保持完整，并且在氨基端保护基团的脱保护期间或在偶联情况中不会被除去。该侧链保护基团还必须能在合成完成后能够在不改变最终多肽的反应条件下被除去。在tBoc化学中，三功能氨基酸的侧链保护基团大多数是以苯甲基为基础的。在Fmoc化学中，它们大多数是以叔丁基或三苯甲基为基础的。
在tBoc化学中，优选的侧链保护基团对于精氨酸是甲苯磺酰基，对于天门冬氨酸是环己基，对于半胱氨酸是4-甲基苄基(和乙酰氨基甲基)，对于谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸是苄基，对于组氨酸是苄氧基甲基(和二硝基苯基)，对于赖氨酸是2-Cl-苄氧基羰基，对于色氨酸是甲酰基，对于酪氨酸是2-溴苄基。在Fmoc化学中，优选的侧链保护基团对于精氨酸是2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)或2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)，对于天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺和组氨酸是三苯甲基，对于天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸是叔丁基，对于赖氨酸和色氨酸是tBoc。
对于磷酸肽的合成，可以直接或在组装后掺入磷酸基团。在直接掺入策略中，丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸上的磷酸基在Fmoc化学中可以通过甲基、苄基或叔丁基来保护，而在tBoc化学中可以通过甲基、苄基或苯基来保护。在Fmoc化学中，还可以采用直接掺入没有对磷酸保护的磷酸酪氨酸。在组装后掺入策略中，在固相上用二叔丁基-、二苄基-、或二甲基-N，N’-二异丙基-亚磷酰胺衍生化丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的未保护羟基基团，然后通过叔丁基氢过氧化物进行氧化。
固相合成通常通过α-氨基保护的(侧链保护的)氨基酸与适合的固相支持物偶联从羧基端开始进行。当与氯甲基、氯三苯甲基或羟甲基树脂附着时，形成酯键，并且所获多肽将在C端具有游离的羧基基团。或者，当采用酰胺树脂例如二苯甲基胺或对二苯甲基胺树脂(对于tBoc化学)和Rink酰胺或PAL树脂(对于Fmoc化学)时，形成酰胺键，而且所获多肽将在C端具有氨甲酰基。这些树脂，无论是以聚苯乙烯-或是聚酰胺为基础的还是聚乙二醇接枝的，带有或不带柄或接头的，以及带有或不带有第一个附着氨基酸的，均可以从商业途径获得，它们的制备描述于Stewart等，“固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)”(第二版)，(Pierce Chemical公司，Rockford，IL，1984)；和Bayer和Rapp，Chem.Pept.Prot.33，1986；和Atherton等，固相肽合成实践方法(Solid Phase Peptide SynthesisAPractical Approach)，IRL Press，Oxford，1989。
采用各种活化剂包括二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)和羰基二咪唑(CDI)，将C端氨基酸(如果必需的话侧链和α-氨基基团受到保护)附着在羟甲基树脂上。该C端氨基酸可以以其铯四甲基铵盐(cesium tetramethylammonium salt)的形式，或在有三乙基胺(TEA)或二异丙基乙基胺(DIEA)存在时，直接与氯甲基或氯三苯甲基树脂结合。第一个氨基酸和酰胺树脂的结合与在偶联反应过程中的酰胺键形成相同。
在与树脂支持物结合后，依据保护化学(例如tBoc、Fmoc)采用各种试剂去除α-氨基保护基团。Fmoc的去除程度可以在300-320nm或通过电导池监测。除去α-氨基保护基团后，将剩余的被保护氨基酸按要求的序列逐步地进行偶联，以获得期望序列。
有多种活化试剂可以用于该偶联反应，包括DCC、DIPCDI、六氟磷酸2-氯-1，3-二甲基酰亚铵(dimethylimidum)(CIP)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧-三(二甲基氨基)-膦(BOP)和它的吡咯烷