专利名称：槲皮素在制备nlrp3炎症小体抑制药物中的应用的制作方法槲皮素为天然黄酮类成分。NLRP3炎症小体由NLRP3(N0D-like receptor protein 3)、 ASC (apoptosis-associated speck-like protein)禾口 Caspase-1 组成[Duewell P, Kono H, Rayner KJ et al (2010) NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature 464: 1357-1361]。研究证实,NLRP3 炎症小体可被多种内源性因子代谢紊乱异常激活，包括高尿酸血症[Gasse P, Riteau N, Charron S et al (2009) Uric acid is a danger signal activating NALP3 inflammasome in lung injury inflammation and fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 179: 903-913]> 高血糖[Schroder K, R Zhou, et al. (2010) The NLRP 3 inf lammasome: a sensor for metabolic danger ？ Science 327(5963): 296-300·]、血月旨紊舌L [Cholesterol crystals activate the NLRP3 inflammasome in human macrophages: a novel link between cholesterol metabolism and inflammation. PLoS ONE 5: ell765]等等。最新的研究证实，NLRP3炎症小体的异常激活会诱导肾脏组织产生包括脂肪变性和炎性损害在内的一系列功能性和器质性损害[A Vilaysane, J Chun, ME Seamone et al (2010) The NALP3 inflammasome promotes renal inflammation and contributes to CKD. J Am Soc Nephrol 21: 1732-1744; Navarro-Gonzalez JF, Mora-Fernandez C (2008) The role of inflammatory cytokines in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol 19: 433—442]。 而目前国内外尚无针对抑制NLRP3炎症小体治疗代谢疾病诱导的肾脏脂肪变性及炎性损害的药物；本发明涉及槲皮素制备NLRP3炎症小体抑制药物，可针对性治疗尿酸、血糖、血脂等一系列内源性因子代谢紊乱诱导的肾脏组织脂肪变性及炎性损害。
本发明的目的在于提供槲皮素的新用途，具体地说是提供槲皮素在制备NLRP3炎症小体抑制药物中的应用；该药物可有效治疗代谢疾病诱导的肾脏脂肪变性及炎性损害。本发明的技术解决方案提供槲皮素在制备NLRP3炎症小体抑制药物中的应用。 该应用包括了以槲皮素为主料，配以本领域的技术人员所熟知的药用辅料(赋形剂、助溶剂、控释剂等)，用常规的制剂方法制成本领域的技术人员所熟知的剂型(包括口服液、注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、微囊剂等)，用于制备NLRP3炎症小体抑制药物中的应用；该药物用于治疗代谢疾病诱导的肾脏脂肪变性及炎性损害。本发明的优点是，提供了对NLRP3炎症小体具有确切抑制调节作用的槲皮素用于制备NLRP3炎症小体抑制药物，用于治疗代谢疾病诱导的肾脏脂肪变性和炎性损害及其它与NLRP3炎症小体异常激活相关的疾病。本发明具有3个明显的进步和优点1、成分明确 (槲皮素)；2、作用靶点明确(NLRP3炎症小体)；3、调节作用明确(抑制调节)。本发明利用高尿酸血症大鼠模型、果糖大鼠模型、STZ糖尿病大鼠模型等代谢紊乱模型在组织细胞水平、基因转录水平和蛋白表达水平上科学地评价并确定了槲皮素对 NLRP3炎症小体的抑制调控作用以及对代谢疾病诱导的肾脏脂肪变性及炎性损害的改善作用。本发明所涉及的槲皮素对代谢紊乱模型动物表达异常升高的NLRP3炎症小体组分具有确切的抑制作用；而对正常动物正常水平的NLRP3炎症小体表达无显著抑制作用， 具有很好的安全性。为了更好的理解本发明的实质，下面将用槲皮素的药理实验及结果来说明其在制备NLRP3炎症小体抑制药物中的应用。1、模型的建立动物适应环境1周后，造模。①大鼠高尿酸血症模型灌胃给予氧嗪酸钾盐700mg/kg ；对照给予等体积生理盐水，造模周期60天。②果糖大鼠模型饮用水给予果糖溶液10%;对照给予自来水，造模周期60天。③STZ糖尿病大鼠模型腹腔注射STZ 55mg/kg，对照给予生理盐水，造模周期60天。2、给药造模期间同时给药，灌胃给予25 mg/kg槲皮素(98%)；对照给予生理盐水。3、动物处死冰台上分离肾脏组织，组织经液氮冷冻后保存于-80°C。4、冰冻切片后常规油红0染色和HE染色。5、蛋白质印迹法(Western-blotting)取组织约IOOmg加入Iml的RIPA裂解液勻浆提取，12000g 4°C离心15分钟，得肾脏组织总蛋白提取液，Bradford法测蛋白浓度，稀释蛋白样品至终浓度为5 ug/ul。混合上样缓冲液变性上样，SDS-PAGE凝胶电泳后PVDF转膜，封闭液封闭1小时后加入rNLRP3、rACS和rCaspase-1抗体(根据NCBI数据库相应蛋白序列制备，使用浓度1:4000) 4°C孵育过夜，二抗(1:4000)室温摇床孵育1小时，HRP-ECL 发光，暗室曝光显影。胶片扫描后对图片进行灰度分析。6、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)提取大鼠肾脏总RNA，逆转录得到cDNA模板， 根据NCBI数据库的rNLRP3、rACS和rCaspase-Ι基因设计引物，进行rNLRP3、rACS和 rCaspase-Ι目的基因扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后UV成像，对图片进行灰度分析。实验结果a.油红染色和HE染色
油红染色结果显示相对于正常对照动物，高尿酸血症模型大鼠肾脏皮质出现明显可见的红色脂滴，果糖模型和STZ模型大鼠肾脏皮质出现数目众多的红色脂滴，包括大型脂滴。25mg/kg槲皮素给药组动物肾脏皮质红色脂滴均得到有效控制，数目和体积均明显下降。HE染色结果显示相对于正常对照动物，高尿酸血症模型、果糖模型和STZ模型大鼠肾小管明显扩张，肾间质可观察到炎性细胞浸润和纤维结缔组织增生(慢性炎)。25mg/kg 槲皮素给药组动物肾小管的扩张和肾间质的慢性炎症变化均明显减轻。上述结果说明25mg/kg槲皮素给药可有效改善高尿酸血症模型、果糖模型和STZ 模型大鼠肾脏组织脂肪变性及炎性损害。b.蛋白质印迹法 Western-Blotting
Group 模型+槲皮素 η = 5
空白+生理盐水空白+槲皮素模型+生理盐水
高尿酸血症模型
NLRP3 灰度值 30. 5 士 10. 2 士 11.7*
ACS 灰度值42.7 士 8. 3
55. 6 士 12. 3*
Caspase-I 灰度值 17. 5 士 7. 5
25.1 士 9. 8**
果糖模型 NLRP3灰度值 29. 7 士 15. T ACS灰度值 41. 9 士 13. 3*
Caspase-I ^ciJft
26.0 士 9.8**
STZ模型 NLRP3灰度值 37. 5 士 11. T ACS灰度值 10. 4+++ 55.6 士 7.9*
Caspase-I 灰度值30. 1 士 8. 9
40. 1 士 8. 2*
28. 4 士 13. 9 73. 1 士 17. 9++ 49. 0 48.4 士 11.0 82.9 士 17.4++ 18. 4 士 10. 443. 1 士 14. 3++
27. 5 士 6. 1
36. 7 士 9. 3 22. 5 士 7. 4
26.9 士 10.9
38. 4 士 10. 1 18.4 士 10.4
30.5 士 10.2 28.7 士 11.0 38. 0 士 5. 338. 4 士 8. 8
33. 1 士 9. 7
53. 1 士 16. 6++ 79. 8 士 12.4++ 49. 6 士 11.3++
73. 1 士 14. T+ 82. 9 士 56. 3 士 10. 2++


本发明涉及黄酮类单体化合物槲皮素的新用途，具体是涉及槲皮素在制备NLRP3炎症小体抑制药物中的应用。动物试验结果表明槲皮素对多种代谢紊乱模型动物肾脏表达异常增高的NLRP3炎症小体组分具有确切的抑制作用。利用槲皮素配以相关辅料，用常规的制剂方法可制成针对性抑制NLRP3炎症小体的药物，该药物可用于治疗包括代谢疾病诱导肾脏脂肪变性和炎性损害在内的与NLRP3炎症小体异常高表达相关的疾病。