专利名称：两条单标记引物检测技术及试剂盒的制作方法近年来，核酸扩增技术特别是聚合酶链反应(PCR)在实验检测和临床诊断中迅速发展，特别是实时荧光PCR技术，可以采用自动化仪器进行扩增和结果判断，提高了检测的灵敏度。目前采用的实时荧光PCR检测技术主要是两种方法，一种是在PCR反应体系中加入荧光染料，如sybgreen等，随着PCR的进行，荧光染料渗入双链扩增产物而发光。但这种方法的特异性存在缺陷，染料本身的背景荧光和许多非特异扩增产物带来了干扰信号，影响了结果的判断。另外一种方法是Taqman探针法(U.S.Pat.Nos.5，210, 015and5，487，972) ，这种方法PCR中增加了一条双荧光基团标记的荧光探针，探针的5’端标记报告基团，3’端标记猝灭基团。探针未参与反应时，报告基团的荧光被猝灭基团猝灭不产生荧光信号。当遇到靶核酸序列探针参与反应时，探针被DNA聚合酶的水解作用降价，报告基团离开猝灭基团发出荧光信号。Taqman探针法特异性好，但双标记探针对寡核苷酸合成技术要求高、得率低，导致Taqman探针成本高出普通引物数十倍以上，单一组分成本往往占到整个检测成本的60%以上，提高了临床诊疗费用，影响了这项技术的进一步普及。因此，本发明提供一种单标记双引物方法和试剂盒，能大幅度降低荧光标记的技术要求和成本，同时保持实时荧光PCR技术的优势，适合推广使用。
本发明的目的是提供一种双引物单标记的扩增方法和试剂盒，可以明显降低荧光PCR方法的成本，同时保持荧光PCR灵敏、特异的特征。本发明的技术内容如下:首先，提供一种用核酸扩增技术检测靶核酸序列的方法，在这个扩增体系中，包括有两条引物，这两条引物分别标记了报告基团和猝灭基团。所述核酸扩增技术是指聚合酶链式反应(PCR)。两条引物的序列符合通常PCR技术要求，分别与靶核酸序列的正链与负链序列互补，在扩增体系中能进行链式聚合反应，产生双链扩增产物。在双链扩增产物中，一条引物携带的报告基团进入扩增产物的一条链，另一条引物携带的猝灭基团进入扩增产物的另一条链。当报告基团和猝灭基团处于同一个双链产物中时，报告基团的荧光会被猝灭基团猝灭而不发出或减弱荧光信号。当PCR反应开始前，两条单标记引物处于分离状态，报告基团未被猝灭，在荧光PCR仪器上能被检测到报告基团的荧光信号。当PCR反应开始后，如果反应体系中包含了靶核酸序列，两条单标记引物就会与靶核酸配对延伸形成双链扩增产物，报告基团的荧光被猝灭基团所猝灭，荧光信号会减弱。随着反应的不断进行，双链扩增产物越来越多，荧光信号会越来越弱，其信号的减弱程度反映了双链扩增产物的数量。反之，如果反应体系中不包含靶核酸序列，两条单标记引物不会发生配对延伸反应，不形成双链扩增产物，报告基团的荧光信号会保持不变。由此，根据荧光信号的变化可以对反应体系中的靶核酸进行检测。在双链扩增产物中，报告基团和猝灭基团的距离会影响猝灭效果，本发明发现，距离不超过40个碱基对时猝灭效果较好。所述报告基团是荧光基团，例如常用的FAM、HEX、J0E、VIC等。所述猝灭基团可以是荧光基团，例如TAMRA，也可以是非荧光猝灭基团，例如BHQ。其次，本发明涉及一个检测靶核酸序列的试剂盒，它含有包括有两条引物，这两条引物分别标记了报告基团和猝灭基团。试剂盒中还包括DNA聚合酶、脱氧核苷酸、氯化镁等核酸扩增所需其余各常用组分。图1为引物结构示意图。图2为扩增曲线。
0.2mM、MgCl2 3mM、引物各0.15 ii M组成，并含有IU的Taq DNA聚合酶和IO4拷贝的HBV DNA模板，总反应体积为30 ii I。实施例3:反应程序设定和结果判断将配制好的反应体系管放到实时荧光PCR仪器上，预变性94°C 2min，然后按照940C 15sec、60°C 30sec循环40次的程序运行，在60°C时检测FAM通道的荧光信号。运行结束后根据FAM通道荧光信号的减弱来判断反应体系中含有靶核酸序列。


两条单标记引物检测技术及试剂盒，属于生物技术领域，包括有两条引物，分别标记了报告基团和猝灭基团，用于检测乙型肝炎病毒。本发明可以明显降低荧光PCR方法的成本，同时保持荧光PCR灵敏、特异的特征。