专利名称：微小染色体维持蛋白在系统性红斑狼疮疾病诊断和防治中的作用的制作方法系统性红斑狼疮(SLE)是一种涉及许多系统和脏器的自身免疫性疾病，其临床及免疫学表型极为复杂多样。系统性红斑狼疮不仅影响体液免疫，亦影响细胞免疫，补体系统 亦有变化，其影响几乎覆盖了整个免疫系统。由于目前系统性红斑狼疮病因和发病机制尚不明确，这也给系统性红斑狼疮的防治带来了极大的困难。微小染色体维持(mini-chromosome maintenance, Mcm)基因是影响微染色体有丝分裂稳定性的主要基因，其编码的微小染色体维持蛋白(mini-chromosome maintenancecomplex component,MCM)家族是一组与启动DIP、复制密切相关的蛋白质；MCM蛋白的过度表达可以作为检测肿瘤细胞的指标，在肺癌和食管癌的诊断、预后评价、临床治疗等方面具有重要的应用前景。有报道表明MCM基因的转录可能受某些因子调节而在自身免疫病中发挥作用，然而本领域并不知道微小染色体维持蛋白在自身免疫性疾病中的具体作用，更没有报道其与系统性红斑狼疮的关系。
本发明的目的在于提供微小染色体维持蛋白的用途，用于作为系统性红斑狼疮的辅助检测指标，或者作为疾病治疗药物筛选的靶点，或者针对微小染色体维持蛋白设计干扰系统或抗体，直接用于系统性红斑狼疮疾病的防治。本发明的第一个方面，提供一种微小染色体维持蛋白的用途，用于作为系统性红斑狼疮的辅助检测指标；其中，所述的微小染色体维持蛋白具有SEQ ID1(MCM6)所示的序列。在另一实施例中，所述的微小染色体维持蛋白还包括下列微小染色体维持蛋白具有SEQ ID 2所示核酸序列的微小染色体维持蛋白；具有SEQ ID 3所示核酸序列的微小染色体维持蛋白；具有SEQ ID 4所示核酸序列的微小染色体维持蛋白；具有SEQ ID 5所示核酸序列的微小染色体维持蛋白；具有SEQ ID 6所示核酸序列的微小染色体维持蛋白；具有SEQ ID 7所示核酸序列的微小染色体维持蛋白。本发明的第二个方面，提供一种微小染色体维持蛋白的干扰片段，其特征在于具有SEQID 8和SEQ ID 10所示序列，其中所述的微小染色体维持蛋白具有SEQ ID 15所示的序列。该干扰片段可以有效地降低微小染色体维持蛋白的表达。在另一实施例中，该干扰片段可以有效地降低树突状细胞在雌激素以及核抗体模拟物CpG刺激下的功能，从而揭示了降低微小染色体维持蛋白在系统性红斑狼疮疾病防治中的作用。图ISLE患者PBMCs中MCM6的表达量显著高于正常人；图2SLE患者DCs中MCM6的表达量显著高于正常人；图3SLE患者PBMCs中MCM6的表达水平与雌激素水平呈正相关；图4a.在雌激素与CpG的刺激下，MCM家族蛋白的水平均上调；b. PCR验证在雌激素与CpG的刺激下，MCM6的mRNA水平变化； c. Western Blot验证在雌激素与CpG的刺激下，MCM6的蛋白水平变化；图5a.干扰片段可以显著降低MCM6的mRNA表达水平b.干扰片段可以显著降低MCM6的蛋白表达水平图6a. MCM6抑制后的DCs在应对雌激素与CpG刺激下增殖能力没有变化；b. MCM6抑制后的DCs在应对雌激素与CpG刺激下凋亡能力没有变化；c. MCM6抑制后的DCs在应对雌激素与CpG刺激下吞噬能力没有变化；d. MCM6抑制后的DCs在应对雌激素与CpG刺激下⑶86的表达水平没有变化但⑶40的表达水平明显降低；图7MCM6抑制后的DCs对T细胞的刺激能力明显降低。7.直接用其单克隆抗体对系统性红斑狼疮进行治疗。本发明的优点在于I.首次证明微小染色体维持蛋白与系统性红斑狼疮的相关性，使其可以成为系统性红斑狼疮临床检测的辅助指标，为该疾病的防治提供了靶点；2.分析了大量SLE病人中微小染色体维持蛋白的表达水平，并与正常人作对比，结果准确可靠。材料及方法I.研究对象本发明共收集36例SLE患者血样，均为南京市鼓楼医院风湿免疫科门诊与病房病 人，诊断符合美国风湿病学会SLE分类标准，其中男性4例，女性32例，且SLE疾病活动性积分(SLEDAI)均高于8分，属于活动期病人。正常对照16例，均为女性，均来自于医院体检正常人群。正常人与患者年龄并无显著差异。2.弓丨物设计本发明引物根据Genebank提供的cDNA序列，利用Lasergene软件设计如下了引物MCM6 RT-PCR 引物正义链5，AAG TAT TCC CCG GAG TTT AGA GG 3，SEQ ID 11反义链5，GAC ACC GCG TTT TAC TTC ATC ATT 3’ SEQ ID 12MCM6实时荧光定量PCR引物正义链5，GAA CGG GAT CAA TGG CTA CAA TG 3，SEQ ID 13反义链5，GCT CGC TCC TCT TTA ATG CTG ACT 3，SEQ ID 14引物由Invitrogen公司合成。3. PBMCs以及DCs的分离纯化本发明采用无菌法抽取新鲜人外周血肝素抗凝(20U/ml)的抗凝血50ml，将新鲜的抗凝血用含2%胎牛血清pH 7. 2的PBS按I : 1(V/V)比例稀释，稀释后血沿离心管管壁缓慢加到淋巴细胞分离液上，离心(1800r/min,30min)取中间白色云雾层细胞,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，待用。PBMCs准备好后，利用mDCs的分离磁珠，按照说明书的操作步骤，纯化mDCs，纯化后用流式细胞仪检测其纯度，其纯度可以达到98%以上。计数后待用。4.树突状细胞分离及培养本发明在无菌状态下取4周龄C57BL/6小鼠的股骨和胫骨，收集骨髓细胞悬液，裂解红细胞后加入1640完全培养液(含10ng/mlmGM-CFS、lng/ml mIL-4和10% FBS)在C02培养箱培养48h，轻轻吹打除去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞，加入新鲜的上述完全培养基，每隔两天进行一次半量换液，继续培养至第六天，收集所有半贴壁细胞即为小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞，获取DCs并用CDllc流式抗体标记，流式细胞仪检测细胞纯度。5. RNA的提取和逆转录六孔板每孔或同等面积的细胞加Iml Trizol，反复吹打后将液体转移到I. 5ml的离心管中；将样品溶液在15 30°C中静置5分钟；每管样品中加入0. 2ml的氯仿(Chloroform)后剧烈震荡15秒；将样品在15 30°C中静置3分钟后，用12000g的速度在4°C离心15分钟；取上层无色水相,加入等体积的异丙醇(Isopropanol)沉淀RNA,轻轻颠倒混匀10次，在15 30°C静置15分钟；用12000g的速度在4°C离心15分钟；除上清，用Iml 75%的乙醇洗涤RNA沉淀，用7500g的速度在4°C离心5分钟，除上清后干燥15分钟；用不含RNA酶(RNasefree)的水溶解RNA，在55到60°C中促溶10分钟后，用分光光度计测量浓度和纯度。6.总蛋白的提取将细胞去除培养基上清，并用预冷的PBS洗两次，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液后，用细胞刮将细胞收集到I. 5ml的EP管中，4°C摇晃裂解20分钟，然后12000g离心15分钟，取上清为蛋白裂解液于_70°C冻存，备用。蛋白裂解液使用前，先用BCA法测蛋白浓度，读取0D562值，按照标准曲线计算出蛋白浓度，调节蛋白浓度使每个样品的上样总蛋白量为IOOug07.实时荧光定量PCR 加样体系为SYBR Green Master Mix 10 yl、引物(正义链0. 25 yl，反义链0. 25 u I)、稀释好的模板cDNA I yl、ddH20 8.5 u I0每个样设3到4个复孔并设定内参作为对照，复孔间的CT值差异控制在0. 5之内。反应结束后按照内参值计算2_A ACT,并作归
一化处理。8.免疫印迹样品加蛋白上样缓冲液100°C煮5 IOmin后，用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，80V恒压转印80min到0. 45 y m的PVDF膜上。转印结束后，把含有样品的PVDF膜用TBS配制的5%脱脂奶粉室温封闭2小时。然后按说明书使用量加入I : 1000稀释兔抗鼠X-press单克隆抗体，4°C孵育一抗过夜；TBS洗3次，每次10分钟；加入I : 1000稀释的HRP-羊抗兔二抗，37°C反应2小时。TBS洗3次，每次10分钟。最后用化学发光成像仪显影并保存图像。9.干扰片段的设计及干扰步骤本发明采用的干扰片段利用Dharmacon公司主页的在线设计软件设计，得到的干扰片段序列如下siMCM6-0015，GGG UAG UGA UGG AGAAAU U 3，SEQ ID 8 ;siMCM6-0025，GGAAAU CGAAUC AGA GAU A 3，SEQ ID 9 ；siMCM6-0035，GGG AAAAGG UGU UUG AAA U 3，SEQ ID 10 ；其中siMCM6_002会引起细胞凋亡，故舍弃不用。干扰片段由Invitrogen公司合成。10.凋亡检测方法(Annexin V&PI双染法)用预冷的PBS洗涤细胞两次，然后离心弃上清，用准备好的IXAnnexin结合液重悬细胞，比例为每I X IO6个细胞用Iml的I X Annexin结合液；接着在每100 u I Annexin重悬液中加入10 U I Annexin V染液和2 的100 y g/ml的PI工作液；室温孵育15分钟后,用IXAnnexin结合液洗漆一次,然后用流式细胞仪检测分析。11.吞噬能力检测方法在细胞中加上0. 2mg/ml FITC-dextran (sigma)后，于培养箱中37 V培养30-45min,让其进行吞噬。另设加入FITC-dextran于4°C培养的细胞作为对照。培养结束后，每个样用300 ill台酚兰(I. 2mg/ml)灭活胞外荧光后用流式检测细胞内荧光强度，37°C与4°C的荧光强度之差与细胞的吞噬能力成正比。12.混合淋巴反应取出小鼠淋巴结,将淋巴结研磨后过筛网收集细胞,然后用免疫磁珠法(MiltenyiBiotec)分选⑶4阳性T细胞。将DC细胞与分选出来的T细胞按不同比例共培养三天。在培养的最后12小时内加入氚标记的胸腺嘧啶，培养结束后用仪器检测其氚插入的T细胞数量，其数量与其增值能力成正比。实施例I :系统性红斑狼疮患者外周血单核细胞中(PBMCs)中微小染色体维持蛋白6的表达量显著高于正常人；本发明取了 22例SLE患者和10例正常人的血液样本，用淋巴细胞分离液分离出PBMCs，然后利用Trizol提取出总RNA，用反转录酶反转录成cDNA，然后利用实时定量PCR检测了 MCM6的mRNA的水平。结果发现，SLE患者PBMCs中的MCM6的mRNA水平要显著高于正常人(图I)。实施例2 :系统性红斑狼疮患者树突状细胞中(DCs)中微小染色体维持蛋白6的
表达量显著高于正常人；本发明取了 5例患者和4例正常人的血液样本，用淋巴细胞分离液分离出PBMCs，再利用磁珠分离出树突状细胞，然后再利用Trizol提取出总RNA，并用反转录酶反转录成cDNA,利用实时定量PCR检测了 MCM6的mRNA水平。结果表明，SLE患者树突状细胞中的MCM6的表达水平也显著高于正常人(图2)。实施例3 :系统性红斑狼疮患者外周血单核细胞中(PBMCs)中微小染色体维持蛋白6的表达水平与雌激素水平呈正相关；本发明取了 11例SLE患者的血液样本，用淋巴细胞分离液分离出PBMCs，然后利用Trizol提取出总RNA，用反转录酶反转录成cDNA，然后利用实时定量PCR检测了 MCM6的mRNA的水平。同时，利用Abbott公司的Architect i2000SR系统检测了患者血清中雌激素的水平。结果表明，系统性红斑狼疮患者外周血单核细胞中(PBMCs)中微小染色体维持蛋白6的表达水平与雌激素水平呈正相关(图3)。实施例4 :在雌激素与CpG的刺激下，微小染色体维持蛋白家族蛋白的水平均上调；本发明对体外培养的树突状进行了全基因组芯片的检测，通过对结果的分析发现，微染色体维持蛋白家族蛋白的mRNA表达在E2、CpG, E2与CpG联合作用下均明显上调 (图4a)。此外,本发明还用RT_PCR(图4b)以及western blot (图4c)的方法进一步验证了该现象。实施例5 :干扰片段可以显著抑制微小染色体维持蛋白6的表达水平；本发明针对微小染色体维持蛋白6的cDNA序列设计了干扰片段，其特征在于具有SEQID8和SEQ ID9所述的序列。将该片段转染到体外培养的树突状细胞中，结果表明，干扰片段可以显著抑制树突状细胞中微小染色体维持蛋白6的mRNA(图5a)以及蛋白表达水平(图 5b)。实施例6 :微小染色体维持蛋白6抑制后的树突状细胞应对雌激素与CpG的应答起到了抑制作用；
本发明验证了干扰片段抑制微小染色体维持蛋白6后树突状细胞的功能，发现微小染色体维持蛋白6的表达降低不影响树突状细胞的增殖、凋亡、吞噬功能(图6a)，也不影响其⑶86分子的表达，但是⑶40的表达水平却明显得到抑制(图6b)。实施例7 :微小染色体维持蛋白6抑制后的树突状细胞对T细胞的刺激能力明显减弱。本发明验证了微小染色体维持蛋白6抑制后的树突状细胞对其他免疫细胞的作用，发现微小染色体维持蛋白6抑制后，树突状细胞对T细胞的活化能力明显减弱(图7)。根据这些实施例，本发明证明了微小染色体维持蛋白与系统性红斑狼疮的密切关系，在系统性红斑狼疮患者的PBMCs和DCs中，都能够检测到高水平的微小染色体维持蛋白的表达，这揭示了其可以作为系统性红斑狼疮的一个辅助的检测指标。系统性红斑狼疮伴随着免疫系统的紊乱，尤其是免疫细胞的过度活化。本发明通过体外实验，证明了在人为降低了微小染色体维持蛋白6的表达之后，可以明显降低免疫细胞的活化水平以及它们之 间的相互作用。这也使得微小染色体维持蛋白成为了系统性红斑狼疮预防及治疗的一个靶点，并且也可能直接应用其抗体进行系统性红斑狼疮的治疗。在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种改动，这些等价形式同样落于本申请所附的权利要求书所限定的范围之内。


本发明属于生物技术领域，公开了一类微染色体维持蛋白的功能，它们在系统性红斑狼疮(SLE)的免疫紊乱中发挥重要作用。本发明还公开了可用于检测所述微染色体维持蛋白水平、进而用于辅助诊断系统性红斑狼疮的方法。本发明首次证明了所述微染色体维持蛋白家族与系统性红斑狼疮密切相关，调节和干预微染色体维持蛋白水平可以改善免疫细胞的功能，这也为系统性红斑狼疮的防治提供了新的药物靶点。