专利名称：一种海带配子体克隆培育方法海带，学名Laminaria japonica Aresch,褐藻的一种，生长在海底的岩石上，形状像带子，含有大量的碘质，属于褐藻门，褐子纲，海带目，海带科，海带属。藻体褐色，长带状，革质，一般长2 6米，宽20 30厘米。藻体明显区分为固着器、柄部和叶片。固着器假根状，柄部粗短圆柱形，柄上部为宽大长带状的叶片。海带具有极高的养殖价值，然而优良养殖品种的选育过程复杂、漫长。海带配子体在单独分离培养时可进行营养生长形成无性繁殖系(克隆)，其遗传性纯一，可长期保存，具有发育全能性并可杂交。海带配子体克隆作为海带种质资源保存和利用的主要材料，在育种、育苗研究中发挥着重要作用。利用海带雌雄 配子体克隆配对杂交技术可以有效缩短选育周期，获得性状优良的杂交海带。这一技术在近些年的海带育种工作中得到有效运用。目前常规采用的海带配子体克隆培育方法，是通过简单擦洗(用120°C烘干消毒的脱脂棉沾取制冷至10°C的煮沸消毒海水擦洗种海带，去除表面的杂藻等附着物)种海带后进行游孢子放散、附着，待游孢子发育成配子体后用微吸管分离获得单个雌、雄配子体，在一定条件下将雌雄单独个体分离成功的海带配子体克隆培养在含营养盐的培养液中，放置于温度8 10°C、持续光照、光照强度800 12001ux的光照培养箱中培养，在此条件下，海带配子体可进行营养生长，形成无性繁殖系，培养使配子体进行无性繁殖形成单克隆系，所有操作在常规室内进行。但该方法由于种海带和环境空气消毒不彻底，极易发生细菌、真菌及杂藻污染，从而影响了配子体生长和成活率，不利于长期保存，又极大地增加了污染处理的工作量，最终导致种质资源损失。而且该方法体系稳定性较差，难以进行长期保存。
本发明要解决的技术问题是提供一种可以长期保存，且可以保持稳定生长状态的海带配子体克隆培育方法。本发明的技术解决方案是一种海带配子体克隆培育方法，其步骤是(I)剪取种海带块剪取带有成熟孢子囊的种海带块；(2)种海带块的预处理用灭菌脱脂棉蘸取经制冷至10°C的煮沸消毒海水，对带有成熟孢子囊的种海带块进行充分擦洗；(3)种海带块的消毒在无菌室超净工作台内，预处理过的种海带块首先用无菌双抗海水浸泡30分钟，然后用I. 5%浓度的碘化钾无菌海水溶液浸泡10分钟，最后用无菌海水浸泡20分钟；(4)游孢子的放散、过滤在无菌室超净工作台内，用无菌镊子夹取消毒后的种海带块，快速移入装有无菌海水的血清瓶中进行游孢子放散，放散后的无菌海水成为含有游孢子的孢子水，孢子水经筛絹过滤，滤出粘液及杂质；(5)游孢子的附着和培养在无菌室超净工作台内，过滤后的孢子水倒入装有载玻片的立式染色缸中，当游孢子附着于载玻片上形成胚孢子后，倒掉孢子水，加入无菌双抗海水，使载玻片完全浸泡在无菌双抗海水中，然后用酒精灯烤干立式染色缸的缸口后，盖上染色缸盖，在立式染色缸口外侧用封口膜拉伸封口进行培养即可得到发育成雌、雄可辨的配子体，再用微吸管将单个雌雄配子体分别分离至两个不同的血清瓶中，每个血清瓶分别用无菌双抗海水进行培养，即可得到单细胞的海带配子体克隆团。上述步骤(4)中，所述筛絹为400目的经过高温高压灭菌的筛絹。上述步骤(5)中，所述无菌双抗海水中含有有效氮、有效磷、青霉素和链霉素，有效氮浓度为IOppm,有效磷浓度为Ippm,青霉素浓度为120ppm,链霉素浓度为lOOppm。所述 培养条件是温度8 10°C、持续光照、光照强度800 12001UX。上述无菌海水、I. 5%浓度的碘化钾无菌海水和无菌双抗海水均在无菌室超净工作台内，经O. 22um滤膜抽滤。本发明的技术效果是本发明对种海带和培养环境进行全面消毒，除预处理外所有操作均在无菌条件下进行，以无菌双抗海水作为培养液，在培养箱中持续光照培养，可有效避免污染，而且海带配子体生长和发育状态正常，使用本发明方法培育获得的海带配子体克隆性状稳定，生长正常，成活率高，能有效避免污染，适于长期保存，可大大减少工作量，降低培育成本，根本上解决现有方法中的污染问题。应用本发明方法，不仅可以使海带配子体克隆在无菌的条件下长期保存，且可以保持稳定的生长状态。I、图I为本发明微吸管分离后培育10天放大100倍的海带配子体克隆照片。2、图2为本发明微吸管分离后培养45天的海带配子体克隆(直径O. 5 Imm)照片。3、图3为本发明微吸管分离后培养4个月的海带配子体克隆(直径约4 5_)照片。4、图4为本发明微吸管分离后培养8个月的海带配子体克隆(克隆团松散后)照片。3、种海带块的消毒在无菌室超净工作台内，种海带块首先用无菌双抗海水浸泡30分钟，然后用I. 5%浓度的碘化钾无菌海水溶液浸泡10分钟，最后用无菌海水浸泡20分钟。上述操作步骤均在直径为9厘米的培养皿中进行。4、游孢子的放散、过滤在无菌室超净工作台内，用无菌镊子夹取消毒后的种海带块，快速移入装有150ml无菌海水的200ml血清瓶中进行游孢子放散。上述灭菌处理种海带的过程相当于进行了阴干处理，放入血清瓶后，海带孢子囊壁破裂，游孢子放出。当游孢子密度达到每视野(目镜16X物镜10倍)15 25个时，孢子水(含有游孢子的无菌海水)经400目的高温高压灭菌过的筛絹过滤，滤出粘液及杂质。5、游孢子的附着和培养在无菌室超净工作台内，过滤后的孢子水倒入装有载玻片的立式染色缸中，在8 10°C条件下，经O. 5 3小时，游孢子附着于载玻片上形成胚孢子，当载玻片附着密度达到每视野(16X10倍)5 10个时结束，倒掉孢子水，加入无菌双抗水作为培养液，使载玻片完全浸泡在无菌双抗水中即可，然后用酒精灯烤干立式染色缸的缸口后，盖上染色缸盖，在立式染色缸口外侧用封口膜拉伸封口，即在立式染色缸缸口与 缸盖结合缝处用封口膜封口，放置于温度8 10°C、持续光照、光照强度800 12001ux的光照培养箱中培养15天左右，即可发育成雌、雄可辨的配子体，再用微吸管将单个雌(雄)配子体分别分离至两个不同的IOml血清瓶中，每个血清瓶分别用5 IOml无菌双抗水作为培养液进行培养，培养也在温度8 10°C、持续光照、光照强度800 12001ux的光照培养箱中培养，培养10天左右形成肉眼可见的海带配子体克隆团。本发明煮沸消毒海水、无菌海水、I. 5%浓度的碘化钾无菌海水和无菌双抗海水制作方法I、制备煮沸消毒海水即生海水经煮沸消毒的海水，生海水装入玻璃三角烧瓶内，在煤气灶上煮沸，沸腾2 3分钟即可，然后在玻璃三角烧瓶口用纸盖封口，用冰箱在5 IO0C的温度下冷藏保存备用。2、制备无菌海水在无菌室超净工作台内，弱风条件下，酒精灯火焰前，煮沸消毒海水经高温高压湿热灭菌后的O. 22um滤膜抽滤，首先将O. 22um(0. 22微米)滤膜装入IL的筒式正压过滤器后通过高温高压湿热灭菌和烘干，在超净工作台内，将煮沸消毒海水添加至筒式正压过滤器中，用抽滤泵抽滤，使液体通过滤膜流到已灭菌的血清瓶中，盖上瓶盖，制成无菌海水。由于煮沸消毒的海水不能达到无菌要求，经O. 22um滤膜可以有效滤出海水中的微小杂质及细菌，可以达到除菌99. 99%的要求，在血清瓶的瓶口与瓶盖结合缝处用封口膜封口，封口膜为半透明、有韧性的热塑性塑料，能紧紧而且自动密闭形成在瓶口，起到密封作用，用冰箱在5 10°C的温度下冷藏保存备用。3、制备I. 5%浓度的碘化钾无菌海水15克碘化钾(化学式KI，分析纯)溶于IOOOml的煮沸消毒海水后，在无菌室超净工作台内，弱风条件下，酒精灯火焰前，经高温高压湿热灭菌后的O. 22um滤膜抽滤至血清瓶，制成I. 5%浓度的碘化钾无菌海水，用封口膜封口，温度5 10°C下保存备用。I. 5%浓度的碘化钾无菌海水的O. 22um滤膜抽滤同制备无菌海水的O. 22um滤膜抽滤相同。4、制备无菌双抗海水称取O. 243克硝酸钠(分子式NaNO3,分析纯)、0· 018克磷酸二氢钾(分子式KH2PO4，分析纯)、0. 48克青霉素(医用，80万单位)、0. 4克链霉素(医用，每克100万单位)溶于4000ml煮沸消毒海水后，在无菌室超净工作台内，弱风条件下，酒精灯火焰前，经高温高压湿热灭菌后的O. 22um滤膜抽滤至血清瓶，制成含有效氮(NO3-N) IOppm(即浓度为百万分之十的有效氮)、有效磷(PO4-P) lppm(即浓度为百万分一的有效磷)，青霉素120ppm(即浓度为百万分之一百二十的青霉素)和链霉素100ppm(即浓度为百万分之一百的链霉素)的无菌双抗海水，封口膜封口，5 10°C保存备用。制备无菌双抗海水的O. 22um滤膜抽滤同制备无菌海水的O. 22um滤膜抽滤相同。本发明实施例采用如下试剂和器材碘化钾(KI):上海银典化工有限公司，分析纯硝酸钠国药集团化学试剂有限公司，分析纯磷酸二氢钾国药集团化学试剂有限公司，分析纯青霉素山东鲁抗医药股份有限公司，注射用青霉素钠，80万单位
链霉素山东鲁抗医药股份有限公司，注射用硫酸链霉素，100万单位立式染色缸玻璃材质，可放5片载玻片，50 60ml的容量压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂，型号为LDZX-75KB超净工作台苏州净化设备有限公司，型号为SW-CJ-IDO. 22um滤膜上海市新亚净化器件厂，混合纤维膜筒式正压过滤器上海市新亚净化器件厂，规格为I升，材质为不锈钢电热恒温鼓风干燥箱上海新苗医疗器械制造有限公司，型号为0HG-924385-III。本实施例无菌室采用提前2小时臭氧消毒或紫外灯消毒，臭氧消毒采用臭氧发生器持续消毒30分钟，臭氧浓度为80mg/m3。超净工作台提前10分钟用紫外灯消毒,紫外灯持续消毒30分钟。本实施例种海带块的消毒、游孢子的放散和过滤、游孢子的附着和培养均在无菌室超净工作台内完成。本实施例所用物品，如培养皿，装有滤膜的筒式正压过滤器，夹取种海带的镊子，放散用的血清瓶，过滤用的400目筛絹，放有载玻片的立式染色缸，附着结束后盛放废弃孢子水的烧杯均经压力蒸汽灭菌器的高温高压湿热灭菌，即上述需要消毒的物品用牛皮纸包好，装入灭菌用的布袋中，扎好布袋口，入压力蒸汽灭菌器，在温度120°C，压力O. 165Mpa，灭菌15分钟，灭菌后装有物品的布袋再放入电热恒温鼓风干燥箱在温度120°C下干燥120分钟进行烘干。本实施例灭菌脱脂棉系脱脂棉在电热恒温鼓风干燥箱中，在温度120°C下灭菌120分钟。


本发明公开一种海带配子体克隆培育方法，其步骤是剪取带有成熟孢子囊的种海带块；用灭菌脱脂棉蘸取煮沸消毒海水，对种海带块进行擦洗；预处理过的种海带块分别用无菌双抗海水浸泡30分钟，1.5％浓度的碘化钾无菌海水溶液浸泡10分钟，无菌海水浸泡20分钟；在血清瓶中进行游孢子放散和过滤过滤后的孢子水倒入装有载玻片的立式染色缸中，当游孢子附着于载玻片上形成胚孢子后，倒掉孢子水，加入无菌双抗海水，再用微吸管将单个雌雄配子体分离至血清瓶中，然后用无菌双抗海水进行培养，即可得到单细胞的海带配子体克隆团。使用本发明方法培育获得的海带配子体克隆性状稳定，成活率高，能有效避免污染，适于长期保存。