专利名称：单壁碳纳米管转载抗肿瘤药物技术及其应用的制作方法目前，癌症已经成为危害全世界人类健康的一大疾病，全世界每年约600万人死于恶性肿瘤，中国现有癌症患者约450万人，死亡率逾30%，造成了严重的社会问题。用于肿瘤治疗的化疗药物能够杀死肿瘤细胞，但缺乏对肿瘤细胞的特异性。同时，我们也应该看到，以蛋白质与核酸为主体的生物大分子药物在实际应用中也存在着一些区别于化学药物的特殊问题，诸如，这些大分子药物难于进入细胞起作用，而且在血液或者体液中被降解，产生免疫反应等问题，因此，研究副作用小、载药量大、靶向性好、生物相溶性生物抗肿瘤药物已成为全球医药研究领域的最重要目标和方向。传统的药物给药方式不能通过生物屏障，无法对特殊病灶部位进行有效治疗。靶向给药充分体现了以生物分子为靶点治疗的潜力。如何使高效递送生物活性分子(肽、蛋白、DNA等)进入肿瘤细胞特定部位是重点，开发新型药物载体有积极意义。 虽然前几年已经有多种纳米材料应用于药物传递与诊断，特别是金属纳米材料，但同时也发现在应用性能、载药量、可控性与靶向性等方面还是存在比较多的缺陷。单壁碳纳米管 (SCNTs)具有独特的中空结构和纳米管径，SCNTs具有高纯度和尺寸一致等优点，对人体毒性较小，在结构上表面积大，能携带大量药物。因此，国际上许多科学技术机构的科学家正着手对抗癌药物传送系统进行试验。本发明在优选适合的单壁碳纳米管的基础上，利用PL-PEG5000-Amine对其进行功能化修饰以提高SWCNTs的溶解性，然后与核酸药物分子偶联，对乳腺癌细胞B-cap的转染性进行研究，同时在SWCNTs空载情况下，对细胞的毒性进行研究。研究表明低浓度的 SffCNTs对细胞几乎没有毒性，转染效率略低于传统的lip2000脂质体转染。SWCNTs作为药物载体有其独特的优势，并以几种核酸与蛋白药物作为目标药物进行抗肿瘤生物治疗，显示出一定的优势，是一种适合有效的生物大分子抗肿瘤药物技术。
本发明的目的在于提供一种单壁碳纳米管转载抗肿瘤药物技术。本发明的第二个目的是提供所述单壁碳纳米管转载抗肿瘤药物技术在促进所述药物靶向性中的应用。为实现以上目的，本发明公开以下技术方案单壁碳纳米管转载抗肿瘤药物技术， 包括以下步骤(1)单壁碳纳米管的分散、质量检测与单壁碳纳米管PL-PEG-Amine功能化；(2)功能化的单壁碳纳米管与目标分子连接，所述目标分子是指生物大分子抗肿瘤药物，包括核酸药物或者蛋白药物；(3 )单壁碳纳米管介导的步骤(2 )所述目标分子转载。步骤(1)获得的单壁碳纳米管直径1-4纳米、长度4-500纳米。步骤(1)获得的功能化的单壁碳纳米管保存在4摄氏度、PL-PEG过量的溶液中。步骤(2)功能化的单壁碳纳米管通过-NH2或-SH与目标分子连接。步骤(2)所述核酸药物或者蛋白药物是指生存素(survivin)及其突变体与剪接体、P53 及其突变体、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 抗体与单链抗体、MDM2癌基因(murinedoubleminute 2，MDM2)、成纤维细胞激活蛋白 (FAP)、贝塔联蛋白(β -Catenin)中的一种或几种。单壁碳纳米管转载抗肿瘤药物技术在促进所述药物靶向性中的应用。本发明的优点在于单壁碳纳米管转载的药物制剂对细胞的毒性低，转染效率接近于传统采用的脂质体LIP2000，而且相对稳定，在用量上比较小，由于它与目标大分子是通过化学键连接，因此对目的生物大分子的结合上比较牢固、易与运载，具有重要的发展前景。本发明中所采用的单壁碳纳米管偶联其它与肿瘤细胞特异结合的基团或抗体分子，使其有效的靶向肿瘤细胞，可以针对体外细胞，也可以针对人或动物。图1为SWNT溶液RAMAN光谱检测结果。图2为SWNT分散与连接效果图，连接后PEG-SWNT浓度为5. 29mg/L,浓缩后浓度为 13.90mg/L。图3为PEG-SWNT溶液稀释10倍后的分散与连接效果图，最终PEG-SWNT浓度为 53. 68mg/L。图4为808nm吸收值与碳纳米管浓度标准曲线(molar extinction coef cient of SffNT, ε =7. 9X106 ifW1)。图5为单壁碳纳米管载体与脂质体lip2000转染效率检测结果表。图6为单壁碳纳米管载体与脂质体lip2000转染效率比较图。图7为对单壁碳纳米管载体转染细胞的效果与脂质体(LIP2000)效率检测结果， 其中，A为Mh的检测结果，B为48h的检测结果。图8为不同SWNTs浓度Mh，48h，72h的细胞增值率数据表。图9为不同SWNTs浓度Mh，48h，72h的细胞增值率比较图，评价单壁碳纳米管载体毒性。图10为SWNTs与LIP2000相对比的转染实验结果。图11为流试细胞检测结果，显示被SWNT携带入细胞内的被选siRNA，与对照相比，对乳腺癌细胞有明显的促凋亡作用。图12为SWCNT与目标蛋白的连接结果示意图，其中，①SWCNT(l-2nm，IOOnm)； ②磷脂；③支链PEG (15h)；④二硫键；⑤靶向分子(TFR/CD71)；⑥Survivin (T34A)； ⑦ RFP(635nm)。图13为SWCNT与目标蛋白的连接方式示意图。

下面结合附图对本发明做详细说明，实施例的作用仅是解释而非限定本发明。实施例一单壁碳纳米管(SWCNT)转载核酸药物。步骤(1)单壁碳纳米管的分散、质量检测与单壁碳纳米管PL-PEG-Amine功能化。1)向20ml玻璃闪烁瓶中加入Img SffNTs和5mgPL-PEG_Amine，加入5ml水，震荡至PL-PEG完全溶解。2)注意SWNTs非常轻，易扩散，要避免吸入SWNTs。操作时穿戴眼镜、实验服和面罩。3)将1)中的闪烁瓶置于超声水槽中超声60min，每20min更换一次水槽的水，避免水温过热。4)注意将闪烁瓶置于水槽的最佳位置，以期获得最佳超声效果。5)离心上述SWNT悬浮液，24，000g，6h，室温(22°C)。收集上清。6)用UV-VIS-OTR测定获得的SWNT溶液的808nm的吸光度，如图4所示。确定 SWNT的浓度，4摄氏度保存。7) PL-PEG功能化的SWNT在结合其他基团前能在4摄氏度保存1_2个月，强烈建议将SWNT保存在PL-PEG过量的溶液中。8)将Iml得到的SWNT溶液加入細1微量过滤浓缩装置(MWCOlOOkDa)。加入3ml 水，室温4000g离心lOmin，残留的体积应该小于0. 5ml。再补充水到細1，离心，重复5_6次， 洗去SWNT溶液中多余的PL-PEG。加入适量的水，调节SWNT的浓度为50mg/L。(UV-VIS-NIR 在808nm测定的质量吸光比为0. 0465mg/ (L*cm))。步骤(2)目标分子SiRNA与功能化的SWNT连接。1)将 500 μ IPL-PEG-Amine 功能化的 SffNT 与 0. 5mgSuIfo-LC-SPDP 混合，加入 50 μ 110XPBS中，室温孵化2h。2)在1)开始的同时，配制IOmM的DTT (1. 54mgDTT溶解于Iml水中)。将15μ1 100 μ MsiRNA 与 1· 5 μ IDTT 混合，室温反应 1. 5h。3)在1)结束后，用微量过滤浓缩装置(MWCO=IOOkDa)去除多余的Sulfo-LC-SPDP， 重复洗涤5-6次(用3-鈿1 DNAse / RNAse水，IOOOOg离心6_8min)，使得终体积低于10 μ 1。注意得到的活化的SWNT必需立即用于SiRNA结合。4)在2)结束后，与3)同时进行，使用ΝΑΡ-5柱子用纯净的DTT处理siRNA (按照 NAP-5柱子使用说明书)。用DNAse / RNAse free IX PBS从柱子上洗脱下siRNA。5)重悬3)得到的活化的SWNTs和500 μ L经4)纯化后的siRNA，4摄氏度结合反应24h。SffNT和siRNA的终浓度分别为40mg/L和2. 5 μ Μ。SWNT-siRNA结合后立即使用， 这样降低污染和siRNA降解的风险。研究结果显示，利用PL-PEG5000-Amine合理地对单壁碳纳米管进行功能化修饰，使其溶解性与生物相容性得到提高。同时可以与选择的目标分子，包括=Survivin及其突变体与剪接体、P53及其突变体、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor , VEGF)抗体与单链抗体、MDM2癌基因(murinedoubleminute 2，MDM2)、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、贝塔联蛋白(β -Catenin)进行偶连，以用于肿瘤防治。步骤(3) =SffNTs与Lip2000脂质体分别介导的siRNA转染(Lip2000脂质体为对照)。
1)准备细胞。贴壁细胞转染前M hrs，在500 L无抗培养基中接种0. 5-2X105 个细胞，转染时细胞融合度为30-50% (注铺板时要将细胞消化完全混勻，避免细胞堆积生长)。2)悬浮细胞。转染前M虹8，在500 1^无抗培养基中接种0.5-2105个细胞， 转染时细胞数量应在4-8X IO5/孔。对于每个转染样品，按下面的方法准备。3)用50 μ L Opti-MEM稀释siRNA (转染细胞的终浓度为33 nM)，轻轻吹吸3_5 次混勻。轻轻颠倒混勻转染试剂，用50 μ L Opti-MEM稀释1.0 yL LipofectamineTM2000, 轻轻吹吸3-5次混勻，室温下静置5 min。混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹吸3_5次混勻，室温下静置20 min.转染复合物加入到M孔细胞板中，100 μ L/孔，前后轻摇细胞板混合均勻。细胞板置于37 oC、5% CO2培养箱中培养18-48 hrs。转染4_6 hrs后可换新鲜培养基。单壁碳纳米管载体与脂质体lip2000转染效率检测结果表见图5，单壁碳纳米管载体与脂质体lip2000转染效率绘图比较见图6。由结果可见，在稍高浓度时，其转染效率可接近传统脂质体转染效率。实施例二 SWNTs的细胞毒性实验——MTT法(与脂质体LIP2000作为对照)。1)接种细胞用含10%胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000 -10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。2)培养细胞同一般培养条件，培养3 — 5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。3)呈色培养3 - 5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS溶解)20ul.继续孵育 4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMS0，振荡10分钟，使结晶物充分融解。4)比色选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以碳纳米管浓度为横坐标，细胞增殖率为纵坐标绘制条形图。对单壁碳纳米管载体转染细胞的效果与脂质体(LIP2000)效率检测结果如图7所
7J ο5)单壁碳纳米管载体的细胞毒性评价通过对SWNTs的功能化，利用超滤浓缩，制备不同浓度梯度的SWNTs浓度，检测Mh，48h，72h的细胞增值率，结果见图8，绘图比较见图 9。结果显示，低浓度的单壁碳纳米管对细胞几乎没有毒性，可作为良好的载药系统。实施例三单壁碳纳米管转载核酸药物(siRNA)对肿瘤细胞的作用(与脂质体 LIP2000作为对照)。1)连接方法将 500 μ IPL-PEG-Amine 功能化的 SWNT 与 0. 5mgSuIfo-LC-SPDP 混合，加入50 μ 110XPBS中，室温孵化浊。2)在1)开始的同时，配制IOmM的DTT (1. 5%igDTT溶解于Iml水中)。将15μ1 100 μ MsiRNA 与 1· 5 μ IDTT 混合，室温反应 1. 5h。3)在1)结束后，用微量过滤浓缩装置(MWCO=IOOkDa)去除多余的Sulfo-LC-SPDP， 重复洗涤5-6次(用3-4ml DNAse / RNAse水，IOOOOg离心6_&ι η)。使得终浓度低于10 μ 1。 (注得到的活化的SWNT必需立即用于siRNA结合)。4)上述2)结束后，与3)同时进行，使用ΝΑΡ-5柱子用纯净的DTT处理siRNA (按照NAP-5柱子使用说明书)。用DNAse / RNAse free IX PBS从柱子上洗脱下siRNA。5)重悬3)得到的活化的SWNTs和500 μ L经4)纯化后的siRNA。4摄氏度结合反应24h, SffNT和siRNA的终浓度分别为40mg/L和2. 5 μ Μ。(注SWNT_siRNA结合后立即使用，以降低无所谓污染和siRNA降解)。6)MTT实验方法检测转化效率与对肿瘤细胞的作用效果。设定MTT实验药物浓度为20匪、30匪、44匪、67匪、100匪。细胞铺板调稀，控制铺板时细胞浓度为30-50%。铺板后6小时培养基中不加血清。LIP2000组和SWNTs组浓度相同，分别设定载有100匪的阴性siRNA作为对照。 图10为与阳离子脂质体相对比的转染实验结果，显示其进入细胞的效率与通常采用的 LIP2000作用效果是相接近的。7)通过流试细胞检测结果显示，被SWNT携带入细胞内的被选siRNA，与对照相比， 对乳腺癌细胞有明显的促凋亡作用(图11所示)，显示了这种技术应用于转导核酸抗肿瘤药物是有效的。实施例四单壁碳纳米管(SWCNT )转载蛋白药物。将直径l-2nm，长度在Γ ΟΟηπι的单壁碳纳米管(SffCNT)通过混分散后，利用混酸处理和活化后，依次与合成的磷脂分子交联，利用支链PEG修饰15h;通过二硫键与靶向肿瘤细胞的分子(如叶酸、抗体分子或受体分子)相连接；同时与目标蛋白(如 Survivin (T34A)、P53、MDM2等)，同时，为了显示这种转载体系在肿瘤组织中的位置，还将 63(T700nm 的荧光蛋白，如红色荧光蛋白(Red Fluorescent Proteins，RFP s)与 SWCNT 上的目标药物蛋白，通过基因工程融合表达制备，然后相连接而成一个具有示踪功能的单壁碳纳米管转载抗肿瘤蛋白体系。其中一种连接结果示意图如图12。实施例五单壁碳纳米管(SWCNT)转载蛋白药物。SffCNT与目标蛋白的连接技术利用一定比例的硝酸与硫酸混酸处理后的单壁碳纳米管(SWCNT)在氯仿中与己二胺反应得到多氨基终端的碳纳米管即CNT-NH。酸化的碳纳米管与十六烷基溴等在一定条件下反应得到CNT-NH。功能化碳纳米管在Tris-HCl缓冲液中超声后加入酶液震荡离心。固定化酶量利用Brandford测定上清中蛋白含量。单壁碳纳米管与目标蛋白连接产物的表征采用CNT - C00H的FIlR光谱与拉曼光谱，结果皆展现出典型的条带。然后对比分析CNT-C00H、CNT-NH、CNT-R固定化效率，发现 CNT-C00H效率最高，装载量也最大。在此基础上，将连接好的对照蛋白与目标蛋白分别孵育肿瘤细胞，然后收集各时间段细胞。进行荧光显微镜观察和流式细胞检测蛋白进入细胞的情况，裂解细胞进行 ffesternbolt检测蛋白被切割的情况与作用效果。图13为一种单壁碳纳米管(SWCNT)与目标蛋白的连接方式示意图。SffCNT对候选蛋白药物的转载技术为了检测单壁碳纳米管(SWCNT) 对候选蛋白药物的转载技术的有效性，作为对照，先在pET-22b上构建表达 ① TAT—I inker—UbGG-mCherry、② TAT—1 inker—mCherry、③ TAT—linker—UbGV— mCherry三个示范性蛋白，并用his柱纯化，用TAT代替SWCNT检测肿瘤细胞质中的泛素专一性酶对泛素切割的有效性。判断依据①与②为了说明具有WdGG能在细胞质内被切割； ①与③为了说明泛素专一性酶对泛素的切割发生在两个GG之后，把GG突变为GV后会阻止泛素专一性酶的切割。在上述检测有效的基础上，构建目标载体系统=SWCNT-Iinker-UbGG-Protein,其中的蛋白质ftOtein为本发明中候选的下列蛋白质=Survivin及其突变体与剪接体、P53及其突变体、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗体与单链抗体、癌基因(murinedoubleminute 2，MDM2)、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、贝塔联蛋白 (β -Catenin)。在前一步的基础上，检验了泛素专一性酶对泛素切割的有效性后，将蛋白转移到 SffCNT上，在pTWim构建下列3个表达质粒
①linker—UbGG-mCherry ；
②Iinker-UbGG-Pr (P53、Sm34 或抗 Survivin 多肽)；
③scFv单链抗体(在pTXBl上表达，几丁质纯化)。通过构建上述三个质粒以实现下列目标①起示范作用；②需要转载的蛋白；③ 靶向性作用。选用不同的scFv可以靶向不同的肿瘤细胞。在pTWim上表达，纯化出来的蛋白在N端具有一个半胱氨酸，便于通过二硫键与SWCNT连接；在pTXBl上表达，纯化出来的蛋白在C端具有一个硫酯，便于通过酰胺键与SWCNT连接。酰胺键比二硫键牢固，不易断开。具体实验方法采用1 inker—UbGG-P与scFv通过摩尔比(如10 1)与SWCNT连接构成载体系统SWCNT-Iinker-UbGG-Pr。然后进行靶向性，有效性评价。通过具体的优化与检测后，证明单壁碳纳米管(SWCNT)通过转载候选蛋白药物，起到了靶向传递蛋白质药物与抗肿瘤功效。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。


本发明公开一种单壁碳纳米管转载抗肿瘤药物技术及其应用，包括以下步骤(1)单壁碳纳米管的分散、质量检测与单壁碳纳米管PL-PEG-Amine功能化；(2)功能化的单壁碳纳米管与目标分子连接，所述目标分子是指生物大分子抗肿瘤药物，包括核酸药物或者蛋白药物；(3)单壁碳纳米管介导的步骤(2)所述目标分子转载。单壁碳纳米管转载的药物制剂对细胞的毒性低，转染效率接近于传统采用的脂质体LIP2000,而且相对稳定，在用量上比较小，由于它与目标大分子是通过化学键连接，因此对目的生物大分子的结合上比较牢固、易与运载，具有重要的发展前景。