抑制人细胞分裂周期蛋白42基因表达和增殖的miRNA模拟物及其表达载体和应用的制作方法[0002]Rho家族蛋白是Ras超家族中小分子G蛋白的成员之一，具有GTP酶活性。⑶C42全称为细胞分裂周期蛋白42，其基因定位于1ρ36.1，是Rho家族中的代表成员，其在肿瘤发生发展中具有重要作用。国内外研究证实，细胞分裂周期蛋白42反义寡核苷酸可以在体外抑制胶质瘤细胞的增殖，但该技术也存在转染效率低，作用时间短的不足，使其抑瘤作用受到限制，另外，人工合成寡核苷酸的费用昂贵，也使该技术的应用遇到技术困难。[0003]MicroRNAs (miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20-25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体(RNA-1nduced silencingcomplex, RISC)，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。miRNA模拟物是模拟生物体内源的miRNAs，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能近年来人工合成的miRNA (artificial miRNA,amiRNA)已经成功应用于沉默预期祀基因的表达及其功能研究，人工合成的miRNAs既能够特异性地沉默单一基因，也可以同时沉默多个相关但不相同的基因。miRNA模拟物进一步增强内源miRNA的沉默作用，降低细胞内蛋白表达量，进行功能获得性(gain-of-function)研究；相反,使用化学合成的方法合成miRNAinhibitors,特异的祀向和敲除单个的miRNA分子,可以削弱内源miRNA的基因沉默效应，提高蛋白表达量，进行功能缺失性(loss-of-function)研究,可以用来筛选miRNA祀位点，筛选调控某一基因表达的miRNA，筛选影响细胞发育过程的miRNA。化学合成miRNA模拟物和inhibitors是近年来研究的一个新热点，已经成为研究动植物基因家族功能的有用工具，并有望成为癌症治疗和临床研究的一种新策略。[0004]从miRNA模拟物的作用机制中可见，这种基因表达调控方法属于转录后的调节并具有明显优势:miRNA模拟物基因抑制效果确切，应用微量的模拟物即可使其编码致病基因产物的含量下降90%以上、甚至可以达到基因敲除的效果；其次，miRNA模拟物抑制具有严格的序列特异性，治疗的针对性强，因而应用此项技术能够同时抑制同一基因的多个靶点或多个不同基因而不致相互干扰；同时，RNAi的作用具有级联式放大效应和高穿透性更适合恶性肿瘤的实验研究；此外，RNAi序列识别的特异性即或对由野生型点突变形成的癌基因也能够产生准确有效的封闭效果而对细胞分裂周期蛋白42野生型基因没有影响。在对多种肿瘤细胞系实验中也证实:肿瘤细胞中均存在着RNAi的机制，化学合成、质粒/病毒或其他方式介导的RNAi可以有效地抑制内源性RNA的表达。
[0005]本发明就是为了解决胶质瘤等肿瘤基因治疗问题，以RNA干扰机制为基础，通过人工合成或表达质粒序列转录形成的小双链miRNA模拟体可以祀向作用于细胞分裂周期蛋白42基因的mRNA，从而阻断其翻译过程，达到使细胞分裂周期蛋白42基因表达降低的结果，而提供一种抑制人细胞分裂周期蛋白42基因表达和增殖的miRNA模拟物及其表达载体和应用。 本发明以RNA干扰技术为基础,从microrna数据库中中获得能够与细胞分裂周期蛋白42mRNA 3’UTR区域结合的miRNA，选择其中参考分值较高的miR-139_5P针对细胞分裂周期蛋白42基因设计了 I条长度为19个核苷酸的miRNA模拟物(见表1)(由上海吉玛公司合成)。通过一系列体外实验证实(实施例1)，该模拟体对细胞分裂周期蛋白42的抑制效果最好。将miR-139-5p序列设计ShRNA正义链和反义链，以loop环相连，称为ShRNA。合成每条ShRNA的DNA模板的两条单链，两条单链DNA退火即为DNA双链模板(ShDNA Sense:5’-GTG TAT TCT ACA GTG CAC GTG TCT CCA GTG TGG CTC GGA GGC TGG AGA CGC GGCCCT GTT GGA GTA AC-3’Antisense: 5’-CT TAC TCC AAC AGG GCC GCG TCT CCA GCC TCCGAG CCA CAC TGG AGA CAC GTG CAC TGT AGA ATA CAC-3’ )； 再克隆至含U6启动子的pGenesil-Ι质粒中，构建质粒表达载体pGPU6/GFP/Ne0-sh-139-5p，并进行酶切鉴定和测序。酶切结果证明构建的shRNA已插入载体，经测序证明与设计的序列相同(实施例2)。然后采用脂质体介导的方法将PGPU6/GFP/Neo-sh-139-5p转染入高表达细胞分裂周期蛋白42的胶质瘤细胞系U251中。根据绿色荧光蛋白表达情况检测转染效率，同时应用MTT法观察转染细胞的增殖活性的变化。应用RT-PCR法检测转染细胞mRNA表达的变化。用Annexin V-FITC / PI双色标记的流式细胞仪法检测转染细胞的凋亡状态。
[0006]本发明是按照以下技术方案实现的。
[0007]—种抑制人细胞分裂周期蛋白42基因表达和增殖的miRNA模拟物，其具有特异性抑制肿瘤细胞的作用，其碱基序列如序列表Sequence I所示，其作用部位如下:
5’-UCUACAGUGCACGU⑶CUCCAdtdt-3’
5，-UGGAGACACGUGCACUGUAGAdtdt-3，
作用于人细胞分裂周期蛋白42mRNA 3’ UTR区的第45至52位。
[0008]所述抑制人细胞分裂周期蛋白42基因表达和增殖的miRNA模拟物，其是采用合成的方式形成3’端有2-4个dt修饰的miRNA。
[0009]一种抑制人细胞分裂周期蛋白42基因表达和增殖的miRNA模拟物质粒表达载体，其包含上述的siRNA模拟物，其具有特异性抑制人细胞分裂周期蛋白42基因表达，特异性抑制人胶质瘤细胞的作用，其碱基序列如序列表Sequence 2所示。
[0010]所述抑制人细胞分裂周期蛋白42基因表达和增殖的miRNA模拟物质粒表达载体，其DNA序列中真核质粒载体是pGPU6/GFP/Afeo
所述抑制细胞分裂周期蛋白42基因表达和增殖的miRNA模拟物质粒表达载体，其DNA序列中病毒表达载体是腺病毒。
[0011]如上述一种抑制人细胞分裂周期蛋白42基因表达和增殖的miRNA模拟物在制备抑制胶质瘤药物中的应用。
[0012]如上述一种抑制人细胞分裂周期蛋白42基因表达和增殖的miRNA模拟物质粒表达载体在制备抑制胶质瘤药物中的应用。
[0013]结果表明:pGPU6/GFP/Neo-sh-miR-139-5p可通过脂质体介导作用成功转染入胶质瘤细胞内。转染pGPU6/GFP/Ne0-sh-139-5p后的细胞代谢受抑制，细胞生长减慢。MTT吸收值在转染后48小时和72小时下降，与正常对照组和阴性对照组相比都具有统计学意义。RT-PCR结果显示:转染了不同浓度pGPU6/GFP/Neo-sh-miR-139-5p的细胞mRNA表达均受抑制。流式细胞分析实验表明:miR-139-5p模拟物组在24小时和48小时早期凋亡与晚期凋亡都较正常对照组和阴性对照组明显增多。
[0014]这样设计的本发明，能够特异性、高效地抑制人细胞分裂周期蛋白42基因表达，能有效抑制肿瘤细胞的增殖活性，还可诱导细胞凋亡。从而达到抑制肿瘤发生和生长的目的。该miRNA模拟物及其质粒表达载体可用于制备高效、快速、特异性强的抗肿瘤药物。



[0015]图1转染后48小时PCR扩增细胞分裂周期蛋白42基因电泳图；
图2转染后48小时PCR扩增β -actin基因电泳图；
图3是M = Marker; lanel:正常对照组转染后72小时PCR扩增细胞分裂周期蛋白42基因电泳图；
图4是lane2:阴性对照组转染后72小时PCR扩增β -actin基因电泳图；
图5是正常对照组转染LN229细胞48小时后细胞分裂周期蛋白42的表达；
图6是siRNA-4组转染LN229细胞48小时后细胞分裂周期蛋白42的表达；
图7是质粒重组载体的酶切鉴定；
图8是转染后24小时绿色荧光蛋白表达情况；
图9是转染后48小时绿色荧光蛋白表达情况；
图10是转染后各时间点MTT吸收值；
图11是实验组转染后流式测定细胞凋亡情况；
图12是阴性对照组转染后流式测定细胞凋亡情况；
图13是pGPU6/GFP/Afeo质粒载体图谱；
图14是miR-139-5P模拟物碱基序列。
[0016]其中:图7 中显示 M: Lamda/Ecol30 I ; 1-6: EcoR I 酶切;.8-13: BamH I 酶切。

[0017]下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。
[0018]实施例一:干扰人细胞分裂周期蛋白42基因表达的miRNA模拟物序列设计
1.miRNA模拟物序列设计
利用microrna数据库检索能够与细胞分裂周期蛋白42基因3’UTR区域结合的miRNA，根据数据库所给出的参考分值选择能够与细胞分裂周期蛋白423’ UTR区结合的miRNA。将网站所给序列加入dt尾以防止其降解。将序列发送至上海吉玛公司，由上海吉玛公司合成。参见图14。
[0019]表1干扰人细胞分裂周期蛋白42基因表达的siRNA序列