专利名称：制备嘌呤衍生物的新方法 -2-氨基-1，9-二氢-9-[4-羟基-3-(羟甲基)-2-亚甲基环戊基]-6H-嘌呤-6-酮(恩替卡韦，Entecavir)是由美国施贵宝公司开发研制的抗乙肝病毒新药，为嘌呤衍生物，具有较强的抗乙肝病毒的作用。临床上恩替卡韦用于治疗成年人的慢性乙型肝炎，包括肝炎病毒复制活性上升、血浆中转氨酶(ATL或AST)升高以及肝组织活性病变、HBeAg呈阳性或阴性的伴有代偿性慢性肝疾病的未接受过核苷类药物治疗的患者，以及对拉米夫定有耐受性的患者。公开号为US5206244的美国专利，描述了恩替卡韦、其制备方法及其抗病毒活性。公开号为CN200510074802.8的中国专利申请，描述了马来酸恩替卡韦其溶剂化物和水合物及其制备方法。文献及专利报道的恩替卡韦制备方法，包括1)Bisacchi GS.，et al.BMS-200475，A novel carbocyclic 2’-deoxyguanosine analog with potentand selective anti-hepatitis virus activity in vitro.Bioorganic&medicinal chemistry Letters，1997，7(2)127-132.；2)Zahler etat，US5206244；3)Bisacchi GS.，et al.Improved process for preparing theagent[1S-(1α，3α，4β)]-2-amino-1，9-dihydro-9-[4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-2-methylenecyclopentyl]-6H-purin-6-one，WO9809964；4)Pendri YR.，et al.Process for prepraring theantiviral agent[1S-(1α，3α，4β)]-2-amino-1，9-dihydro-9-[4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-2-methylenecyclopentyl]-6H-purin-6-one，WO20042310。但这些制备工艺都比较复杂，需要用到柱层析分离等不适合放大的分离纯化条件，不适合工业上大规模制备恩替卡韦原料。
本发明的目的是优化[1S-(1α，3α，4β)]-2-氨基-1，9-二氢-9-[4-羟基-3-(羟甲基)-2-亚甲基环戊基]-6H-嘌呤-6-酮马来酸盐一水合物的制备方法，优化原制备工艺中需要柱层析分离等复杂的分离纯化条件，以便于工业化大量、方便和有效的制备恩替卡韦及其盐和水合物。在文献报道的合成工艺基础上，我们出乎意料意料地发现，采用下式化合物， 与环戊二稀钠反应制备中间体A可以得到结晶性的固体，非常适合分离纯化，同时有利于工业化放大生产，文献该步骤反应采用柱层析的方法进行分离纯化，操作复杂，成本也比较高。 中间体A 中间体A为新结构化合物，使用中间体A作为原料制备恩替卡韦及其盐和水合物，涉及的所有中间体包括中间体1-8均为新结构化合物。优化后的制备工艺流程如下
具体的制备过程为a).将中间体A作为原料， 与IPC2BH反应， 得新化合物中间体(1)， b).将中间体(1)氧化得新化合物环氧中间体(2)， c).将中间体(2)与溴苄反应得新化合物中间体(3)，
d).将中间体(3)与2-氨基-6-苄氧基-鸟嘌呤反应得新化合物中间体(4)， e).将中间体(4)与Trt反应得新化合物中间体(5)， f).将中间体(5)氧化得新化合物中间体(6)，
g).将中间体(6)羰基还原亚甲基化得新化合物中间体(7)， h).将中间体(7)除去保护基R-、Bn-和Trt-得到化合物恩替卡韦(Entecavir)， 优化的恩替卡韦(Entecavir)制备工艺还在以下方面进行了改进，1)在环戊二稀钠的制备中，用NaH替换Na砂，简化了操作，提高了产率，使反应条件更容易控制，也更安全；2)在合成中间体(5)时，将二氯甲烷替换为乙腈，收率大幅度提高；3)在中间体(6)的合成中，优选出三氧化铬吡啶络合物(PDC试剂)作为氧化剂，与文献(Bisacchi，et al，Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters，Vol7，No2，pp127-132，1997)对比，简化了合成操作，降低了合成成本。
本发明还涉及马来酸恩替卡韦一水合物的制备方法，由于恩替卡韦在水和常用有机溶剂中溶解度较小，因此按常规的成盐方法难于合成马来酸恩替卡韦一水合物。我们对比研究了多种成盐方法。包括
1)以甲醇为溶剂成盐。将等摩尔的恩替卡韦、马来酸分别溶于甲醇中，过滤，然后将两者混合，放置结晶。实验结果发现，析出产品较少，损失较大，因此该方法不适合生产马来酸恩替卡韦。
2)以甲醇-丙酮混合溶剂成盐。将等摩尔的恩替卡韦、马来酸分别溶于甲醇和丙酮中，过滤，然后将两者混合，放置结晶。实验结果发现，结晶较快，产生包夹，产品不纯，且不易纯化，因此该方法也不适合生产马来酸恩替卡韦。
3)在室温水中成盐。将恩替卡韦溶于水中(较难溶解，溶剂量很大，溶解1克恩替卡韦需要1.2升水)、过滤，加入等摩尔的马来酸，放置不结晶。减压浓缩掉大量溶剂，放置结晶。实验结果发现，产品结晶好，不产生包夹，产品纯，但因需要减压浓缩，操作不方便，因此该方法也不适合生产马来酸恩替卡韦。
4)在温水中成盐。将恩替卡韦加热溶于水中(较难溶解，溶剂量较大，溶解1克恩替卡韦需要100毫升水)、过滤，加入等摩尔的马来酸，放置结晶，析出产品不多，减压浓缩掉部分溶剂，放置结晶。实验结果发现，产品结晶好，不产生包夹，产品纯，但仍然需要减压浓缩，而且恩替卡韦溶解不容易，给操作带来不便，因此该方法也不适合生产马来酸恩替卡韦。
5)在温水中混合成盐。将等摩尔的恩替卡韦和马来酸混合悬浮于水中，加热溶解(较易溶解，溶剂量不大，溶解1克恩替卡韦只需要5毫升水)、过滤，放置结晶。实验结果发现，产品结晶好，不产生包夹，产品纯，操作方便。因此该方法适合生产马来酸恩替卡韦一水合物。

本发明还提供了马来酸恩替卡韦一水合物用于治疗乙型肝炎和/或并发感染的用途。
实验动物选用中国江浙地区的鸭禽种系麻鸭，实验选用十二月龄雌性麻鸭，体重在900克和1100克之间，经筛选确认为垂直传播感染鸭乙型肝炎病毒，鸭乙型肝炎病毒核酸(DHBV DNA)检测呈阳性，并随机分派于各实验组，每组由11只鸭子组成。受试药艾马来酸恩替卡韦一水合物的给药剂量分为高、中、低3组，即3.39μM/Kg、0.34μM/Kg、0.034μM/Kg。采用每日口服给药一次方式，连续给药6周。
检测分析方法1)实验组和对照组的麻鸭分别在给药前、给药后第二周、第四周、第六周和停药后第二周时静脉采血，进行血清DHBV DNA的定量PCR检测；2)DHBV DNA定量方法采用外标准TaqMan实时荧光PCR法检测，由实验室标定的相对标准作为参比，定量线性范围为1×103～1×108copies/ml；3)测定各实验组用药前、用药中、用药后及停药后的DHBV DNA定量结果，取对数后以配对资料的t检验统计分析(SPSS软件)，检验治疗前和治疗不同天数后病毒载量差异是否有显著性，实验结果见表1-3。
表1低剂量治疗组DHBV DNA含量测定结果


表2中剂量治疗组DHBV DNA含量测定结果

表3高剂量治疗组DHBV DNA含量测定结果

统计分析显示，低剂量组，中剂量组，高剂量组在治疗后2，4，6周和停药2周分别比较，马来酸恩替卡韦一水合物对DHBV DNA均有显著的抑制(P值分别为0.0000566、0.000187、0.000675、0.000228；0.000405、0.000569、0.000100、0.00872；0.0000645、0.00000853、0.00000860、0.0000909)。
根据本发明，本发明还涉及一种治疗人/畜乙型肝炎病毒感染和/或并发感染药物的方法，此方法包括给需要治疗的乙型肝炎病毒感染和/或并发感染者施用治疗有效剂量的马来酸恩替卡韦一水合物药物组合物，该组合物每日给药一次，药物组合物优选含有0.1-1mg的马来酸恩替卡韦一水合物。本发明的药物组合物可每日给药一次用于治疗成人患者的乙型肝炎病毒感染和/或并发感染。

，下面的实施例用于说明本发明，但对本发明没有任何限制作用。
实施例1)中间体A制备 将500ml干燥的四氢呋喃置于2000ml三口瓶中，在氮气保护下，用液氮将之冷却至-75℃左右，向反应瓶中加入116.0g(0.68mol)4-甲基-苄基氯甲基醚。将392ml(0.69mol)环戊二稀钠四氢呋喃溶液置于平衡漏斗中，然后将之缓慢滴加入反应瓶中，控制反应温度在-60～-50℃，加完后继续于此温度搅拌反应1小时，得中间体A直接用于下一步反应。
2)中间体(1)制备制备IPC2BH 用注射器抽取800.0ml(0.80mol)硼烷四氢呋喃溶液(1.0mol)，置于精确称重的带有-80℃温度计及搅拌子的250ml二口圆底烧瓶中。通N2保护下，冰浴冷却至0℃，用注射器抽取160.0ml(0.902mol)1R-(+)-α-蒎烯并缓慢注入反应瓶中，滴加完毕后，保持内温为0℃，随后停止搅拌，置冰箱中放置(观察有无色棱柱状结晶(少量)析出，说明α-蒎烯32ml稍微过量)。将溶液在N2保护下转入带温度计的二口瓶中，液体变浑浊，在N2保护下，加入另一部分160.0ml(0.902mol)1R-(+)-α-蒎烯，保持内温为2℃，5分钟加入完毕，反应物变为乳白色的混悬物，随后置冰箱中放置备用。
将IPC2BH的THF溶液(0.80mmol)冷至-78℃，加入中间体A溶液(0.68mmol)，在-78℃反应1小时，随后升温至0-5℃，搅拌反应18小时。减压浓缩去四氢呋喃，加入640ml乙醚，搅拌均匀，并降温至0-5℃，滴加3N NaOH 230ml(0.69mmol)，保持内温低于0℃，随后滴加30％H2O2235ml(2.07mmol)，保持内温低于10℃，随之在0～10℃反应1小时(最后固化)。
分离有机层，水层用3×200ml乙醚提取，合并有机相，用3×30ml饱和NaCl水溶液洗涤，加无水Na2SO4干燥，过滤，抽干得314.2g浅红色油状物，减压蒸馏，收集89-92℃/6Pa馏分，得168g纯品。
3)中间体(2)的制备
将107.0g(0.49mol)中间体(1)置于5000ml三口瓶中，于室温，加入3000ml 1，2-二氯乙烷，1.3g(5.0mmol)乙酰丙酮氧钒(IV)，保持内温低于30℃，滴加180.0ml(0.9-1.08mol)(CH3)3COOH，滴加完毕于室温搅拌3小时，冰浴冷却至0 ℃，加入饱和Na2SO3溶液500ml，反应温度略上升。有白色固体析出。自然升至室温，继续搅拌2小时。分离水层及有机层，水层用200ml二氯甲烷提取1次，合并有机层，用水洗涤，无水Na2SO4干燥。过滤，蒸干得油状液体320.0g。结晶得产物85.1g，收率56％。
4)中间体(3)的制备 将16.4g(0.41mol)NaH(60％)置于2000ml三口瓶中，在氮气保护下于室温加580ml无水四氢呋喃，64.0g(0.27mol)中间体(2)(用150ml无水四氢呋喃稀释)，搅拌反应2小时。加入35.7ml溴苄和0.97g(2.6mmol)四丁基碘化铵，于室温搅拌2.5小时，加入14.8ml乙醇，搅拌反应15分钟。减压旋干溶剂，残余物用等量的乙醚和水(约500ml)溶解，分出有机层，水相用3×100ml乙醚提取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥过夜，减压浓缩至干，得产品86.5g，收率97.9％，TLC检测为单一斑点，此品直接用于下步反应。
5)中间体(4)的制备 称量1.87g(0.23mol)liH(98％)置于3000ml三口瓶中，72.3g(0.30mol)2-氨基-6-苄氧基-鸟嘌呤，加930ml DMF溶解，然后加入反应瓶中，于室温搅拌10分钟后，然后升温至60℃，搅拌15分钟，然后加入48.6g(0.15mol)中间体(3)的DMF溶液466ml，然后升温至125℃(外温)反应2.5小时后，TLC检测，无中间体(3)，停止加热，冷却至室温，加入45ml水，减压蒸干溶剂，残余物用800ml乙酸乙酯溶解，分别用2×20ml水洗涤，20ml饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干，得固体102.1g，用乙酸乙酯结晶，得白色固体70.9g，收率，83％，TLC检测为单一斑点(展开剂为CH2Cl2∶CH3OH＝20∶1)。
6)中间体(5)的制备 将70.0g(0.124mol)中间体(4)置于2000ml三口瓶中，在N2保护下，加入1400ml CH3CN溶解，加入38.3g(0.138mol)Trt-Cl和52.8ml(0.376mol)Et3N，于室温搅拌过夜，减压旋干溶剂，加乙酸乙酯溶解，过滤除去不溶物(Et3N.HCl)，浓缩，加庚烷使沉淀完全、过滤得固体，用乙酸乙酯重结晶得白色细针状结晶92.3g，产率92％，TLC检测为单一斑点，不需精制直接用于下步反应。
7)中间体(6)的制备三氧化铬吡啶络合物(PDC试剂)的准备在装有密闭搅拌器、温度计和干燥管的2升三口瓶中，加入1000ml无水吡啶，在搅拌下，用冰浴冷却到约15℃，在30分钟内，分批加入无水氧化铬136克(1.36mol)，控制加入速度使反应温度不超过20℃并使氧化铬能迅速与吡啶络合。加完后，使反应混合物渐渐热至室温，并继续搅拌1小时，停止搅拌，倾出表面的吡啶，结晶用无水石油醚以倾泻法洗涤数次，每次用500ml，在尽可能避免接触大气的情况下，用砂芯漏斗滤集产品并用无水石油醚洗涤。络合物在10毫米真空下干燥，得到304克红色结晶的氧化铬吡啶。产物置于棕色瓶中于0℃密封保存备用。
将225.6g(0.60mol)三氧化铬吡啶络合物(PDC试剂)置于5000ml三口瓶中，加入2000ml干燥的二氯甲烷使之溶解；80.7g(0.10mol)中间体(5)置于500ml平衡漏斗中，加入250ml干燥的二氯甲烷使之溶解，在氮气保护下，将中间体(5)二氯甲烷溶液加到反应瓶中，搅拌至氧化完全(TLC监测，展开剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶4)。反应混合物用乙酸乙酯稀释，经过短硅胶柱过滤，依次用饱和碳酸氢钠和水洗涤滤液，无水硫酸钠干燥，浓缩，得79.6克中间体(6)，该中间体不经纯化直接用于下步反应。
8)中间体(7)的制备 称取117.7g(1.80mol)Zn粉，2.45g(5mmol)PbCl2，于N2的保护下置于至5000ml三口烧瓶中，加2000ml干燥THF，78.6ml CH2I2，室温搅拌(30℃搅拌10分钟仍无升温现象)后剧烈搅拌，即刻见到温度迅速上升，至溶液沸腾，水浴冷至室温(25-30℃)搅拌30分钟，冷至0℃，加入196ml(0.196mol)1.0M的TiCl4/CH2Cl2溶液，加毕移去冰浴，换成水浴，升至室温反应30分钟，然后加入79.0g(98.1mmol)中间体(6)(溶于500ml无水THF中)，于室温搅拌3小时，HPLC监测反应终点，以产物含量不再增加为终点(流动相为乙腈∶水＝90∶10，色谱柱为ODS4.6×15，检测波长254nM，流速1ml/min)。反应物缓慢倾至1200毫升CH2Cl2和2500毫升饱和NaHCO3混合溶液中，剧烈搅拌，又加入2500毫升饱和NaHCO3，室温搅拌1小时，经硅藻土过滤，500ml乙酸乙酯洗涤，分离水层，用1000ml乙酸乙酯反提水层，合并有机层，用2×50ml饱和NaCl洗涤，Na2SO4干燥、过滤、旋干得79.0g粗品，粗品不经纯化直接用于下步反应。
9)中间体(8)的制备
78.0g(97.1mmol)中间体(7)置于5000ml三口瓶中，加CH3OH-THF(1∶1)2500ML，使固体溶解，加入485ml(0.97mol)HCl(2N)，于50℃搅拌反应2.5小时，冷却，倒入3400ml乙酸乙酯中，用1700ml水稀释，用稀NaOH调节pH至中性，分离有机相，减压浓缩，加入庚烷使沉淀完全，过滤，得粗品，加N，N-二甲基乙酰胺溶解，加入叔丁基甲醚使沉淀完全，冰箱冷冻，过滤，用叔丁基甲醚洗涤，得中间体(8)27.1g，HPLC检测纯度(流动相为乙腈∶水＝90∶10，色谱柱为ODS4.6×15，检测波长254nM，流速1ml/min)，含量在97％以上。
10)恩替卡韦的制备 将27.0g(57.3mmol)中间体(8)分散于1000ml二氯甲烷中，在氮气保护下，冷却至-78℃，加入573ml(573mmol)BCl3/CH2Cl2(1M)，于-78℃反应2小时，然后升温至-40℃反应30分钟，再冷却至-78℃，缓缓加入1000ml甲醇，温热至室温，混合物真空浓缩，然后再次加入甲醇旋干，反复数次，将残留物分散于叔丁基甲醚和水中，分离水层，水层用叔丁基甲醚洗涤，然后用稀氢氧化钠中和至pH7.0，加热使固体完全溶解，加入活性炭脱色，过滤，滤液浓缩，冷却使沉淀，抽滤，用少量水洗涤固体，自然干燥，得恩替卡韦粗品19.5g，用水重结晶两次，得恩替卡韦纯品11.6g，片状结晶，mp240～242℃。
11)马来酸恩替卡韦一水合物的制备 将11.0g(37.3mmol)恩替卡韦，4.33g(37.3mmol)马来酸加热溶于50ml水中，趁热过滤，室温放置，析出大量结晶，冰箱中放置过夜使析晶充分，抽滤，用2×5ml水洗涤，干燥得白色固体14.4g，马来酸恩替卡韦一水合物，收率92.5％，mp156℃分解。
IRvcm-1(KBr)3380.07，3141.5，1691.29，1571.72，1405.87，1307.52，1052.96，1018.24，8，63.96，649.90。1HNMR(600MHz，DMSO-d6)δppm13.25(br，1H)，10.68(s，1H)，7.83(s，1H)，7.04(br，2H)，6.50(s，2H)，6.25(s，2H)5.40～5.35(q，1H)，5.12(s，1H)，4.93(br，1H)，4.83(s，1H)，4.59(s，1H)，4.23(s，1H)，3.54～3.52(m，2H)，2.52(t，1H)，2.26～2.19(m，1H)，2.07～2.02(m，1H)。MS m/e277.2[M+]，259.1，246.1[100]，229.1，216.1，204.1，152.0，151.1，135.1，109.1，95.1，81.1，69.1。


本发明涉及制备式(I)嘌呤衍生物包括其马来酸盐一水合物的方法，含有此化合物的药物组合物及用于治疗乙型肝炎病毒感染和/或并发感染的用途。