专利名称：一种能对目标重组蛋白进行离心法快速分离纯化的方法近年来随着对蛋白质的研究和生产的需要，基因重组技术突飞猛进，出现了很多基因工程产品，深刻地影响人类自身及其环境。而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。据统计，基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60% 80%。因此越来越多的生物工作者从事重组蛋白的分离纯化工作。与传统蛋白质分离纯化方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小，形状，溶解度，等电点，亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。当前重组蛋白质的纯化主要是依靠层析和电泳技术。目前，亲和标签已成为后基因组学时代纯化重组蛋白常用手段。此方法无需了解蛋白质的生化特性或生理活性， 就可通过带标签的重组融合蛋白选择性地与层析基质上的配体结合，从而得以纯化任何蛋白质。此方法与常规的层析方法不同之处在于，针对不同的蛋白质需要开发特定的配体和方法。采用保护蛋白质结构和功能完整性的温和条件，已成功地通过一步亲和层析从粗提物中纯化出了多种重组蛋白，纯度达90%以上。其中6组氨酸标签的亲和层析是目前的代表。但是，此方法依然存在一些不足如与融合标签结合的特异配基价格昂贵、镍柱纯化时金属镍离子容易脱落流出混入蛋白溶液、柱子有时会非特异性吸附蛋白质；因此，限制了在大规模分离纯化中的应用。因此，发展简单易行、廉价、可靠的重组蛋白质纯化方法对于大规模生产重组蛋白及高通量蛋白质组学研究具有重要意义。
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种能对目标重组蛋白进行离心法快速分离纯化的方法。本发明通过加入一定浓度盐诱发融合标签蛋白发生相变聚集，通过优化操作条件，采用离心法分离重组蛋白，效果显著；该方法简单、快速、高效、经济，不需要特殊仪器，适用范围广、易于操作，生产成本低廉，因而适宜进行工业化生产。为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案一种能对目标重组蛋白进行离心法快速分离纯化的方法，包括如下步骤1)通过融合标签蛋白基因上的限制性酶切位点，将目标蛋白基因与融合标签蛋白基因连接，并导入到宿主菌中；2)使用不同盐离子及相应的浓度的缓冲溶液，在特定pH值中，通过控制溶液温度使融合标签蛋白发生相变聚集得到蛋白质溶液；幻对蛋白质溶液通过离心法纯化目标蛋白。所述的一种能对环境条件敏感的融合标签蛋白及其基因，其命名为[KV8F]n，其中 η为重复数，其数值在1-1000之间，该序列已进行菌种专利保藏(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO. 4185，保藏日期2010年9月17日)并申请了专利(专利申请号:201010562100. 5)。所述的步骤1)中限制性内切酶采用 ApaI、BglII、KpnI、NheI、SphI, XbaI, SacI、 Nde I, Sfi I, EcoR I、pflMI、Hind III和Xho I中的一种或多种；限制性内切酶与融合标签蛋白基因相连接；或者在目标蛋白与融合标签蛋白基因间加入一段无规则结构的序列， 然后插入到表达载体中，进一步转化到大肠杆菌BL21(DE!3)或者BLR菌株中(二者均为商业化菌株，可直接从上海超研生物科技有限公司、上海博亚生物科技有限公司购买)，筛选出阳性转化子，阳性转化子经异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导使编码基因(购于Sigma公司)获得融合高效表达，然后进行细胞破碎。所述的无规则结构的序列为(AGAGAGPEG)n, η的取值范围在1_150。所述的高效表达为低温诱导表达，包括如下步骤1)将甘油菌(购于上海捷瑞生物工程有限公司)按1 100的体积比接入到含氨苄青霉素(Amp) (100mg/L)的LB液体中培养(OD6tltl值为0. 6-1. 0，时间为10-12h)，4°C保存，离心收集细胞；2)将细胞重悬浮于2ml 的含氨苄青霉素(Amp) (100mg/L) 2ml的Luria-Bertani培养基(LB)，(其配方为蛋白胨 (Tryptone) 10g，酵母提取物(Yeast extract) 5. 0g, NaCl 10g，蒸馏水 1000ml，pH7. 0。)液体中，再培养(OD6tltl值为0.6-1. 0，时间为10-12小时)，以此接种；按1 100的接种量接种于TB培养基，(每900ml体积的TB培养基配方为蛋白胨12g，酵母粉Mg，丙三醇8ml ；) 中，置于37°C摇床，以200r/min的速度，培养4-5小时；加入IPTG诱导剂(终浓度为ImM) 诱导7小时；之后，4°C下以4000r/min的速度，离心15分钟，按照IL菌液40mlPBS缓冲液重悬菌体。所述的细胞破碎采用超声波法，包括如下步骤1)取出加入IPTG诱导剂，诱导7 小时后的锥形瓶，冰浴，使细胞停止生长，将菌液分装于100ml离心管中，使处于对称位置的离心管质量相等(配平)，离心，离心条件转速4000r/min，时间15min ；2)离心机停止后， 取离心管，弃上清，按1 25 (PBS缓冲溶液菌液)的比例加入PBS缓冲溶液洗涤菌体，在旋涡混合器上充分振荡，直至将离心管底的菌体冲洗干净，收集；幻用超声波破碎机进行细胞破碎，条件为超^，停2s，80个循环，之后收集细胞破碎液。所述的步骤2)中的溶液温度依据目标蛋白的特性，选择4°C -45°C范围内。所述的步骤2、中盐离子缓冲溶液的盐类型采用氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、磷酸二氢钠、碳酸钠，氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、磷酸二氢钾、碳酸钾，硝酸铵、硫酸铵和氯化铵中的一种，其浓度范围为0. lmol/L-2. 5mol/L，缓冲溶液的pH值范围为5. 5-8. 5 ；将上述盐加入到破壁后的细胞粗提液中，以诱发融合标签蛋白相变聚集。所述的步骤3)离心法包括如下步骤1)加入终浓度为0. 5% W/V聚乙烯亚胺， 振荡，使其充分混勻，去除核酸；2)将步骤2)得到的蛋白质溶液分装于IOml的离心管，冰浴15min，离心，其条件为4°C，14000r/min，离心时间15min ；3)取出离心管，将上清液移到干净的离心管，弃沉淀，按盐溶液上清液=1 2的体积比加入盐溶液，使溶液终浓度在0. 1-2. 5mol/L之间。4°C _45°C恒温水浴15min，离心，离心条件为温度:4°C _38°C， 转速:12000-13500r/min，时间为5_15min ；4)取出离心管，迅速弃上清，每管加2mlPBS缓冲溶液，沿管壁缓慢滴加，使壁上的蛋白质充分溶解，冰浴15min后离心，离心条件为4°C， 12000-15000r/min，时间为5-10min ；5)重复步骤3)和4) 一次；最终弃沉淀，收集上清，保存在-20°C冰箱中；6)透析后冷冻干燥；其中盐溶液采用氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、磷酸二氢钠、碳酸钠，氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、磷酸二氢钾、碳酸钾，硝酸铵、硫酸铵和氯化铵中的任意一种。所述的PBS缓冲溶液由A液和B液组成，其配方为A液0. 2mol/L磷酸氢二钠溶液，包括Nei2HPO4 28. 4g, Na2HPO4 ·Η20 31. 6lg, Na2HPO4 · 2Η20 35. 6g, Na2HPO4 · 7Η20 53. 63g, Na2HPO4 · Iffl2O 71. 64g，加双蒸水至 1000ml ；B 液0. 2mol/L 磷酸二氢钠溶液=NaH2PO4 24. 0g, NaH2PO4 · H2O 27. 6g，NaH2PO4 · 2H20，31. 21g，加双蒸水至 1000ml ；将 A 液和 B 液混合得到PH在5. 5-8. 5之间的缓冲液。本发明的有益效果是使用类弹性蛋白多肽(Elastin-Like Polypeptide, ELP) [KV8F]n，将其基因与目标蛋白基因通过酶切连接，经基因表达后，通过使用适宜的盐及相应的浓度，控制溶液的PH，使其在特定温度下发生相变聚集，之后使用离心法对目标蛋白进行纯化。每纯化Ikg蛋白质所需原材料的费用分别为利用His尾巴亲和层析$838124. 73， 使用MPACT-CN纯化系统$989606. 23，而采用ELP体系仅$74509. 75，不到前两者的10%。 采用ELP进行非色谱纯化操作简易、成本低廉，有望给重组蛋白的分离纯化技术带来革命性的变化。也就是说本发明提供了一套快速有效的控制ELP相变的方法，可用离心简便的将目标蛋白纯化，同时可浓缩蛋白溶液，避免了色谱分离的繁琐操作及对蛋白样品的稀释。 且具有以下特点1)能简单、快速与目标蛋白基因链接，实现高效表达；2)对目标蛋白结构和正常功能无明显影响，安全性高；3)蛋白表达条件简单，纯化方便，生产成本低廉，因而适宜进行工业化生产。本发明为重组蛋白的分离提供了一条新途径，在生物分离领域具有广阔的应用前景。图1是本发明实施例1中的表达质粒pET-22b-ELP-dhaT的构建图；图2是本发明实施例1的SDS-PAGE蛋白电泳检测1，3丙二醇氧化还原酶的电泳图谱；图3是本发明实施例2中的表达质粒pET-22b-SoxB-M2-S_ELP的构建图；图4是本发明实施例2中融合蛋白木聚糖酶的电泳分析图谱。
下面通过具体实施例，对本发明作进一步的描述。实施例1本实施例以该方法分离1，3丙二醇氧化还原酶首先构建融合蛋白表达质粒，步骤如图1所示，图1是本发明实施例1中的表达质粒pET-22b-ELP-dhaT的构建图；过程为将 PUC19-ELP从大肠杆菌DH5 α (为商业化菌株，可直接从上海超研生物科技有限公司、上海博亚生物科技有限公司购买)中抽提出来，用限制性内切酶Nde I和Hind III双酶切产生 318bp的ELP基因片段，切胶回收。用相同的双酶切割pET-22b(+)质粒，并用Nde I和Hind III将刚才回收的ELP基因片段连接上去得到pET-22b-ELP，转化到E. coli DH5 α中保存。 抽提pUC57-dhaT质粒，经PCR扩增，得到大量含有Xho I和Hind III识别位点的dhaT基因。经切胶纯化后的dhaT基因长度为1211bp，将之前得到的pET_22b_ELP用Hind III和 Xho I双酶切处理，然后与dhaT基因序列相连接形成pET-22b-ELP-dhaT质粒。该重组质粒构建完成后分别用Hind III and Xho I双酶切鉴定；Nde I and Xho I双酶切鉴定；Hind III单酶切鉴定；将阳性克隆送到Genscript Co. ,Ltd.测序。最后将测序正确的质粒抽提并分别转化到E. coli BL21 (DE3)和BLR(DE3)菌株(为商业化菌株，可直接从上海超研生物科技有限公司、上海博亚生物科技有限公司购买)。之后步骤为1.菌株活化将含质粒pET-22b-ELP_dhaT的E. coli BL21 (DE3)和 BLR(DE3)1)将甘油菌按1 100的体积比接入到含氨苄青霉素Amp (100mg/L)的LB液体中培养，其中OD600值为0. 6-1. 0，时间为10-12h ；4°C保存，离心收集细胞；2)将细胞重悬浮于2ml的含氨苄青霉素Amp(100mg/L)2ml的Luria-Bertani培养基LB (其配方为蛋白胨 (Tryptone) 10g，酵母提取物(Yeast extract) 5. Og, NaCl 10g，蒸馏水 1000ml，pH7. O。)液体中，再培养，其中0D_值为0.6-1. 0，时间为10-12小时；以此接种；按1 100的接种量接种于TB培养基(配方每900ml体积的TB培养基配方为蛋白胨12g，酵母粉Mg，丙三醇8ml)中，置于37°C摇床，以200r/min的速度，培养4-5小时；加入终浓度为ImM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导剂，诱导7小时；之后，4°C下以4000r/min的速度，离心 15分钟，按照IL菌液40mlPBS缓冲液(其配比见表IpH为7. 0的配方)重悬菌体。之后进行细胞破碎，其步骤为1)将低温诱导表达后的菌液冰浴，使细胞停止生长，将菌液分装于 IOOrnl离心管中，使处于对称位置的离心管质量相等，离心，离心条件转速4000r/min，时间 15min ；2)离心机停止后，取离心管，弃上清，按PBS缓冲溶液菌液=1 25的比例加入 PBS缓冲溶液洗涤菌体(其配比见表IpH为7. 0的配方)，在旋涡混合器上充分振荡，直至将离心管底的菌体冲洗干净，收集；幻用超声波破碎机进行细胞破碎，条件为超^，停2s， 80个循环，之后收集细胞破碎液。将得到的细胞粗提液按一下步骤处理，得到纯化的1，3丙二醇氧化还原酶。1)加入终浓度为0.5% W/V聚乙烯亚胺，振荡，使其充分混勻，去除核酸；2)将步骤2)得到的蛋白质溶液分装于IOml的离心管，冰浴15min，离心，其条件为4°C，14000r/min，离心时间 15min ；3)取出离心管，将上清液移到干净的离心管，弃沉淀，按盐溶液(氯化钠、硫酸钠、 硝酸钠、磷酸二氢钠、碳酸钠，氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、磷酸二氢钾、碳酸钾，硝酸铵、硫酸铵和氯化铵溶液中的一种)上清液=1 2的体积比加入盐溶液，使其终浓度在0. Imol/ L-2. 5mol/L之间，pH值范围为5. 5-8. 5 ；以诱发融合标签蛋白相变聚集。4°C _45°C恒温水浴15min，离心，离心条件为温度:4°C _38°C，转速:12000_13500r/min，时间为5_15min ；4) 取出离心管，迅速弃上清，每管加anlPBS缓冲溶液，(所述的PBS缓冲溶液由A液和B液组成，其配方为=A 液0. 2mol/L 磷酸氢二钠溶液，包括=Na2HPO4 28. 4g，Na2HPO4 · H2O 31. 61g， Na2HPO4 · 2H20 35. 6g, Na2HPO4 · 7H20 53. 63g, Na2HPO4 · 12H20 71. 64g，加双蒸水至 1000ml ；B 液0. 2mol/L 磷酸二氢钠溶液=NaH2PO4 24. 0g, NaH2PO4 · H2O 27. 6g，NaH2PO4 · 2H20，31. 21g， 加双蒸水至1000ml ；将A液和B液按照表1配比混合即可得到pH在5. 5-8. 5之间的缓冲液。)沿管壁缓慢滴加，使壁上的蛋白质充分溶解，冰浴15min后离心，离心条件为4°C， 12000-15000r/min，时间为5-10min ；5)重复步骤3)和4) 一次；最终弃沉淀，收集上清，保存在-20°C冰箱中；6)透析后冷冻干燥。最后得到纯化的1，3丙二醇氧化还原酶，电泳图见图2 ；图2是本发明实施例1的 SDS-PAGE蛋白电泳检测1，3丙二醇氧化还原酶的电泳图谱；其中M泳道是蛋白Marker ；1 泳道是无细胞抽提物；2泳道是经2. OM NaCl纯化一次的融合蛋白；3泳道是经0. 5M K2CO3纯化一次后的融合蛋白；4泳道是经0.5M Na2CO3纯化一次后的融合蛋白。经计算，其纯度可达98%。实施例2本实施例以该方法分离木聚糖酶，首先构建表达质粒pET-22 b-SoxB-M2-S-ELP, 在本例中，目的基因SoxB-M2-S-ELP为全基因合成，表达载体和宿主菌分别为pET_22b和 E. coli BLR(DE3)。重组表达质粒pET-22b-SoxB-M2-S_ELP的构建流程见图3。之后提取质粒，将其转化到大肠杆菌BLR(为商业化菌株，可直接从上海超研生物科技有限公司、上海博亚生物科技有限公司购买)中。图3是本发明实施例2表达质粒pET-22b-SoxB-M2-S-ELP 的构建图。pET-22b-ELP为我们自行设计的序列，已进行菌种专利保藏(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC N0.4185，保藏日期2010年9月17日。)； 其中的 SoxB-M2 基因序列来源于文献 Zhang S, Zhang K, Chen X，et al. Five mutations in N-terminus confer thermostability on mesophilic xylanase. Biochemical and biophysical research communications, 2010, 395 (2) :200-206.；而 S 的序列来源于另一篇文献 Wheeldon IR, Campbell Ε, Banta S. A chimeric fusion protein engineered withdisparate functionalities-enzymatic activity and self-assembly. Journal of molecular biology, 2009, 392 (1) :129-142.两篇文献均已公开发表。质粒导入重组菌后，菌体培养及收集步骤为1)将甘油菌按1 100的体积比接入到含氨苄青霉素Amp (100mg/L)的LB液体中培养，其中OD6tltl值为0. 6-1. 0，时间为 10-1 ;4°C保存，离心收集细胞；2)将细胞重悬浮于2ml的含氨苄青霉素Amp (lOOmg/ L)2ml的Luria-Bertani培养基LB (其配方为蛋白胨(Tryptone) 10g，酵母提取物(Yeast extract) 5. 0g, NaCl 10g，蒸馏水 1000ml，pH7. 0。)液体中，再培养，其中 OD6tltl 值为 0. 6-1. 0， 时间为10-12小时；以此接种；按1 100的接种量接种于TB培养基(配方每900ml体积的TB培养基配方为蛋白胨12g，酵母粉Mg，丙三醇8ml)中，置于37°C摇床，以200r/min 的速度，培养4-5小时；加入终浓度为ImM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导剂，诱导 7小时；之后，4°C下以4000r/min的速度，离心15分钟，按照IL菌液40mlPBS缓冲液(其配比见表IpH为7.0的配方)重悬菌体。之后进行细胞破碎，其步骤为1)将低温诱导表达后的菌液冰浴，使细胞停止生长，将菌液分装于100ml离心管中，使处于对称位置的离心管质量相等，离心，离心条件转速4000r/min，时间15min ；2)离心机停止后，取离心管，弃上清，按PBS缓冲溶液菌液=1 25的比例加入PBS缓冲溶液洗涤菌体(其配比见表IpH 为7. 0的配方)，在旋涡混合器上充分振荡，直至将离心管底的菌体冲洗干净，收集；幻用超声波破碎机进行细胞破碎，条件为超^，停^，80个循环，之后收集细胞破碎液。将得到的细胞粗提液按一下步骤处理，得到纯化的木聚糖酶。将得到的细胞粗提液按一下步骤处理，得到纯化的1，3丙二醇氧化还原酶。1)加入终浓度为0.5% W/V聚乙烯亚胺，振荡，使其充分混勻，去除核酸；2)将步骤2)得到的蛋白质溶液分装于IOml的离心管，冰浴15min，离心，其条件为4°C，14000r/min，离心时间 15min ；3)取出离心管，将上清液移到干净的离心管，弃沉淀，按盐溶液(氯化钠、硫酸钠、 硝酸钠、磷酸二氢钠、碳酸钠，氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、磷酸二氢钾、碳酸钾，硝酸铵、硫酸铵和氯化铵溶液中的一种)上清液=1 2的体积比加入盐溶液，使其终浓度在0. Imol/L-2. 5mol/L之间，pH值范围为5. 5-8. 5 ；以诱发融合标签蛋白相变聚集。4°C _45°C恒温水浴15min，离心，离心条件为温度:4°C _38°C，转速:12000_13500r/min，时间为5_15min ；4) 取出离心管，迅速弃上清，每管加anlPBS缓冲溶液，(所述的PBS缓冲溶液由A液和B液组成，其配方为=A 液0. 2mol/L 磷酸氢二钠溶液，包括=Na2HPO4 28. 4g，Na2HPO4 · H2O 31. 61g， Na2HPO4 · 2H20 35. 6g, Na2HPO4 · 7H20 53. 63g, Na2HPO4 · 12H20 71. 64g，加双蒸水至 1000ml ；B 液0. 2mol/L 磷酸二氢钠溶液=NaH2PO4 24. 0g, NaH2PO4 · H2O 27. 6g，NaH2PO4 · 2H20，31. 21g， 加双蒸水至1000ml ；将A液和B液按照表1配比混合即可得到pH在5. 5-8. 5之间的缓冲液。)沿管壁缓慢滴加，使壁上的蛋白质充分溶解，冰浴15min后离心，离心条件为4°C， 12000-15000r/min，时间为5-10min ；5)重复步骤3)和4) 一次；最终弃沉淀，收集上清，保存在-20°C冰箱中；6)透析后冷冻干燥。最后得到纯化的木聚糖酶，电泳图见图4。图4是本发明实施例2中融合蛋白木聚糖酶的电泳分析图谱。经计算，其纯度可达64. 3%。
由于融合标签蛋白ELP-KV8F能发生相变现象，同时它对要分离的其它目标蛋白的结构无明显影响。因此，将其编码基因与需要分离的目标蛋白进行融合后，表达出的融合蛋白，可通过精确控制盐类型及浓度和缓冲液PH值，使融合标签蛋白ELP发生独特的相变现象，经高速离心分离，从而达到对目标蛋白的快速、简单的分离，而且该方法不需要借助目前常用的色谱法。


本发明涉及一种能对目标重组蛋白进行离心法快速分离纯化的方法，包括如下步骤1)通过融合标签蛋白基因上的限制性酶切位点，将目标蛋白基因与融合标签蛋白基因连接，并导入到宿主菌中；2)使用不同盐离子及相应的浓度的缓冲溶液，在特定pH值中，通过控制溶液温度使融合标签蛋白发生相变聚集得到蛋白质溶液；3)对蛋白质溶液通过离心法纯化目标蛋白。本发明通过加入一定浓度盐诱发融合标签蛋白发生相变聚集，通过优化操作条件，采用离心法分离重组蛋白，效果显著；该方法简单、快速、高效、经济，不需要特殊仪器，适用范围广、易于操作，生产成本低廉，因而适宜进行工业化生产。