日本血吸虫组织蛋白酶b基因、其编码蛋白及其应用的制作方法 【技术领域】 [0001] 本发明涉及基因工程【技术领域】，具体地说涉及一类日本血吸虫组织蛋白酶B的蛋 白质、其编码核苷酸和编码氨基酸序列以及其作为药物靶点和疫苗的作用。 [0002] 目前研究表明，血吸虫病由血吸虫的感染引起，在世界上有76个国家，受感染者 约1.5亿。致病的血吸虫有3种，即日本血吸虫（Schistosoma japonicum)，曼氏血吸虫 (S. mansoni)和埃及血吸虫（S. haematobium)。在我国流行的是日本血吸虫。 [0003] 研制新的治疗血吸虫病和抗血吸虫的药物，首先必须找到合适的药物作用靶点。 自然选择是适应性进化（即生物体对环境的适应）的机制。血吸虫是寄生虫，经历了从非寄 生到寄生生活的自然历史过程。血吸虫寄生于动物宿主体内，宿主的免疫系统无时无刻不 在攻击和排除血吸虫，而血吸虫进化出了攻击宿主、逃避宿主免疫攻击的分子机制，以适应 寄生生活。生存压力迫使血吸虫在分子水平不断进化，尤其是对其生存和寄生至关重要的 蛋白，而这正是药物作用的最佳靶点。基因的适应性进化，体现在编码氨基酸的密码子的碱 基替换上，DNA分子显著出现非同义替代，改变编码蛋白质的氨基酸组成，并产生新的功能， 这就是阳性进化选择，或称适应性进化、达尔文进化。基因的阳性进化选择可以通过分析不 同物种同源基因（ortholog)之间的碱基替换、基因在同一物种群体的变异及同一物种基因 扩增产生的paralog的碱基替换来发现。

[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一类组织蛋白酶B的蛋白质、其编码核苷酸、及 编码氨基酸序列日本血吸虫组织蛋白酶B。
[0005] 本发明的要解决的另一个技术问题是上述日本血吸虫组织蛋白酶B作为药物作 用靶点和候选疫苗方面的作用。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供一种DNA分子，它编码日本血吸虫组织蛋白酶B 基因而且含有序列表中SEQ ID NO. 1?SEQ ID NO. 30所述序列中任一序列的喊基序列。
[0007] 由于密码子的简并性以及部分氨基酸具备相似的功能，本发明的编码日本血吸虫 组织蛋白酶B基因还包括在中度严紧条件下与序列表中SEQ ID NO. 1?SEQ ID NO. 30所 示的序列中任一条序列杂交的序列；或者它是与序列表中SEQ ID NO. 1?SEQ ID NO. 30所 示的序列中任一条序列有至少70 %同源性的序列。
[0008] 在本发明的优选例中，所述的编码日本血吸虫组织蛋白酶B基因的DNA分子的序 列如序列表中SEQ ID NO. 1?SEQ ID NO. 30所示的序列中任一条序列所示。
[0009] 所述的编码日本血吸虫组织蛋白酶B基因的DNA分子，可以按照序列表中SEQ ID NO. 1?SEQ ID NO. 30所述序列人工合成。
[0010] 也可以按照基因工程方法的常规操作完成。
[0011] 本发明还提供一种氨基酸序列，它具有日本血吸虫组织蛋白酶B得活性而且含有 序列表中SEQ ID NO. 31?SEQ ID NO. 60所述序列中任一序列的氨基酸序列；或者它是与 序列表中SEQ ID NO. 31?SEQ ID NO. 60所示的序列中任一条序列有至少70%同源性的序 列。
[0012] 在本发明的优选例中，它是包含有序列表中SEQ ID NO. 31?SEQ ID NO. 60所示 的序列中任一条序列的氨基酸序列。
[0013] SEQ ID NO. 31?SEQ ID NO. 60所示的序列中任一条序列的氨基酸序列与SEQ ID NO. 1?SEQ ID NO. 30所示的DNA序列是依次分别对应的。
[0014] 上述多肽也可以按照其序列人工合成。
[0015] 另一方面，本发明还提供了上述多肽和DNA分子的用途。
[0016] 例如，所述的的多肽在制备血吸虫免疫蛋白的免疫原方面的用途，该多肽在筛选 抗血吸虫类药物方面的用途，该多肽在筛选抗血吸虫的潜在药物靶点方面的用途，以及该 多肽在制备血清学诊断需要的蛋白质方面的用途。
[0017] 本发明的编码日本血吸虫组织蛋白酶B基因的DNA分子，则可以用于制备用于基 因治疗的试剂。
[0018] 本发明通过大规模的基因进化选择研究，发现了 30个日本血吸虫组织蛋白酶B蛋 白质，这些蛋白质，都是可能的药物作用靶点和候选疫苗。血吸虫病的流行给人民身体健康 和经济发展都造成巨大的损失，因此，防治血吸虫病、开发研制治疗血吸虫病和抗血吸虫的 药物具有巨大的社会和经济效益。




[0019] 图1是日本血吸虫基因大规模Paralog进化选择分析策略。
[0020] 图2是血吸虫组织蛋白酶的进化关系。
[0021] 图3是日本血吸虫Cathepsin (组织蛋白酶）家族的进化。
[0022] 图4是日本血吸虫组织蛋白酶B有4个氨基酸位点处于阳性进化选择中。其中， 有3个阳性选择位点在酶功能域？印1〇1中。图4A、图4B、图4C是图4D上部序列比对图 的放大图。
[0023] 图5是日本血吸虫组织蛋白酶B的阳性选择的氨基酸位于分子的表面侧面图。
[0024] 图6是日本血吸虫组织蛋白酶B的阳性选择的氨基酸位于分子的表面俯视图。
[0025] 图7是日本血吸虫基因大规模Paralog进化选择分析结果(部分)。
[0026] 图8是日本血吸虫Hemoglobinase，SjCB，SjCC，SjCL2基因存在阳性进化选择。


[0027] 申请人:在前期研究中分析了日本血吸虫基因扩增及进化特征，发现组织蛋白酶家 族多个分支，如组织蛋白酶B (Cath印sin B)，存在阳性进化选择。日本血吸虫组织蛋白酶 负责消化宿主血红蛋白以提供血吸虫营养，更重要的是组织蛋白酶B可能与血吸虫入侵宿 主皮肤有关。在曼氏血吸虫，入侵皮肤的关键酶是弹性蛋白酶（Elastase)， 申请人:研究表 明活性最强的弹性蛋白酶Ia和Ib分支正是处于阳性进化选择中。日本血吸虫能入侵的宿 主范围比曼氏血吸虫广泛，入侵过程更快速，而这也是进化的结果，其关键入侵酶很可能处 于阳性进化选择中。
[0028] 本发明通过进化分析，明确了日本血吸虫组织蛋白酶处于阳性选择中最主要的是 B亚型，这可以作为药物作用靶点和候选疫苗。
[0029] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
[0030] 实施例1日本血吸虫蛋白潜在的家族Paralog的分析
[0031] 1.日本血吸虫蛋白序列的收集
[0032] 从公共数据库下载日本血吸虫基因及蛋白序列，共24167条（2010年6月24日）。 去除蛋白序列长度小于50氨基酸的序列，得到23766条；去除重复序列，得到14685条；检 验蛋白与DNA序列是否匹配，最后得到14656条日本血吸虫基因序列。
[0033] 从公开数据库下载日本血吸虫基因组测序预测的基因，共13469条，除去短序列 (小于50氨基酸)，除去重复序列，除去蛋白与DNA不匹配的序列，得到13440条序列。
[0034] 作为对照分析，下载曼氏血吸虫基因组预测基因，共13191条，同前处理，得到 11934条序列。
[0035] 2.日本血吸虫基因 paralog分析
[0036] 日本血吸虫14656条蛋白序列，用BLASTCLUST程序，根据序列相似度进行聚类，参 数S=l, L=O. 7。得到711个蛋白cluster,每个cluster含3个蛋白序列，包含4117个蛋白 序列。这包括潜在的基因组扩增的paralog。从基因组预测基因出发，分析得到74个类似 的蛋白cluster,含372个蛋白。而曼氏基因组基因的分析，得到172个蛋白cluster,含 884个蛋白序列。
[0037] 以上序列分析及以下进化筛选过程在图1中表示。
[0038] 实施例2日本血吸虫基因的大规模Paralog进化选择分析
[0039] 1.蛋白序列排比（Alignment)
[0040] 蛋白cluster中所包含的蛋白序列，用ClustalW程序进行序列排比，参数： MATRIX=BL0SUM。用pal2nal程序，利用DNA序列，将蛋白序列排比结果转换成密码子 (codon)的排比，而保持原蛋白序列排比位置不变。程序参数：-〇utput paml-nogap。
[0041] 2.基因进化树分析
[0042] 用最大似然法（Maximum likelihood)算法，利用PHYML程序，用蛋白序列 排比结果，构建每个蛋白cluster的进化树。参数：datatypel (protein)，sequence format:i(interleaved), nb datasets:I, bootstrapped data sets:1000, substitution model:JTT for protein,prop invariable sites:e,nb categories:4is default,gamma parameter:Iis default,starting tree:BI0NJ, Optimise topology:y, optimise brance length&rate parameters:y〇
[0043] 3.基于基因密码子排比的大规模进化选择分析
[0044] 利用Codeml程序计算所有蛋白cluster的进化选择。模型7 (Model7)是中性模 型，假定有10类dN/dS比例，值在0到1之间，呈beta发布。模型8(Model8)是基因选择模 型，含有同模型7个10类dN/dS，但多了第11类dN/dS，值没有限制。比较这两个模型的结 果，统计的显著性用开平方的方法评估两个模型得到的2* (log-likelihood values (delta ML))，p〈0. 05则认为否定中性模型是显著的，也即认为有阳性选择存在。同时，大规模分析 得到的P值进一步用软件R分析q值，q值在〈〇. 05时，认为p值的结果是可信的。
[0045] M8的结果进一步与M8a的结果比较，M8a指第11类dN/dS=l，如果比较的p〈0. 05， 则认为M8得到的dN/dS是显著>1的。
[0046] 日本血吸虫14656蛋白分析的结果，得到332个蛋白cluster,符合M7vs M8，p〈0. 05，q〈0. 05 ;M8vs M8a，p〈0. 05。在结果列表中，发现组织蛋白酶家族的3个亚型，即 B，D及hemoglobinase被识别，提示组织蛋白酶可能存在阳性进化选择。结果见图7 (部分 结果)。
[0047] 日本血吸虫基因组基因13440蛋白序列分析的结果，共32个蛋白cluster，符合 M7vsM8，p〈0. 05，q〈0. 05 ;M8vs M8a，p〈0. 05。在结果中也有组织蛋白酶B存在阳性进化选 择。
[0048] 曼氏血吸虫基因组11934预测基因的分析结果，共有97个蛋白cluster，符合 M7vsM8, p〈0. 05, q〈0. 05 ;M8vs M8a，p〈0. 05。在结果中没有组织蛋白酶存在。这与曼氏血吸 虫与日本血吸虫使用不同的蛋白酶入侵宿主相符合。
[0049] 4.蛋白序列中阳性选择位点的确定
[0050] 用Codeml程序中的Bayes Empirical Bayes (BEB)算法分析处于阳性进化选择中 的特定氨基酸位点。
[0051] 实施例3日本血吸虫组织蛋白酶基因家族的进化分析
[0052] 为了进一步明确血吸虫组织蛋白酶基因家族处于阳性进化选择的成员，针对该家 族深入分析其进化特征。
[0053] 1.血吸虫组织蛋白酶基因家族序列收集
[0054] 从公共数据库收集下载了血吸虫（Schistosoma)组织蛋白酶基因及蛋白序列，经 过去除不合适的序列及重复序列，得到276条。
[0055] 2.不同血吸虫组织蛋白酶蛋白进化树构建
[0056] 276个蛋白序列，用Megalin软件，进行序列排比。利用Mega4软件，构建邻位连接 树（Neibour joining tree)。发现血吸虫组织蛋白酶主要分为5个分支，17^，(3，13，!^1^和 D。发现一些扩增的蛋白为日本血吸虫所特有，而这些序列，是基因扩增的结果，则扩增后因 为进化选择，可能存在适应性进化分支，这就是阳性进化选择基因。血吸虫组织蛋白酶的进 化关系及日本血吸虫可能存在的基因扩增情况见图2。
[0057] 3.日本血吸虫组织蛋白酶各分支的进化分析
[0058] 本发明中针对日本血吸虫组织蛋白酶进行了进化分析。所使用的序列共159条， 利用Mega4软件构建了邻位连接树(见图3)，并用codeml程序分析了各个分支的进化选择 特征，在图3中，存在潜在的阳性进化选择的分支用*或**表示。详细结果列在图8中，可 见日本血吸虫组织蛋白酶的多个分支存在潜在的阳性进化选择。
[0059] 4.日本血吸虫组织蛋白酶B的阳性选择位点
[0060] 本实施例中用codeml中的BEB算法，分析发现，日本血吸虫组织蛋白酶B有4个 特定氨基酸位点处于阳性进化选择中（如图4所示);用Genedoc展示由Megalign软件分析 得到的蛋白序列排比，并用SMART (http://smart. embl~heidelberg. de/)软件分析了组织 蛋白酶B蛋白的功能域，发现4个阳性选择位点位于propeptide_cl和pept_cl功能域中。 这4个位点是Arg68, Leul73, Gln283和Ser330,结果表明，阳性进化位点可影响组织蛋白 酶B的酶活性。
[0061] 5.日本血吸虫组织蛋白酶B的空间构型
[0062] 本实施例中进一步用Rasmol软件分析了日本血吸虫组织蛋白酶B的空间构型，发 现4个阳性选择的位点位于分子的表面，并且Arg68, Gln283和Ser330非常接近，可能构成 与蛋白酶底物相互作用的界面，影响到组织蛋白酶B对底物的识别和酶解作用（如图5和图 6所示)。