专利名称:衍生自lgECε2区的表位或模拟表位、其拮抗剂以及它们的治疗用途的制作方法图1,采用Padlan和Davies 1986模型的IgE氨基酸表面暴露。图2,化学方案1,固相肽合成。图3,化学方案2和方案3,修饰的载体制备。图4,化学方案4,肽/载体缀合。图5,C67-8抗IgE数据。(A)用25μg BSA-IgE C67-8(用PTL化学缀合的)或3μg HepB核心-IgE C67-8构建体免疫的Balb C小鼠血清抗平板结合IgE的反应性。(B)用25μg BSA-IgE C67-8(用PTL化学缀合的)或3μg HepB核心-IgE C67-8构建体免疫的Balb C小鼠血清抗受体结合IgE的反应性。图6,用可溶性IgE和IgE C67-8肽进行的竞争测定。将来自BSA-IgE C67-8或HBC-IgEC67-8免疫的小鼠的血清与可溶性IgE(10μg/ml)或IgE C67-8肽(25μM)或不相关肽PT326(25μM)预温育,然后加入到IgE包被的ELISA板中。数据为平均值±S.E.M(n=10)。图7,PT1079抗IgE数据。(A)用25μg BSA-PT1079(用PTL化学缀合的)或3μg HepB核心-1079构建体免疫的Balb C小鼠血清抗平板结合IgE的反应性。(B)用25μg BSA-1079(用PTL化学缀合的)或3μg HepB核心-1079构建体免疫的Balb C小鼠血清抗受体结合IgE的反应性。图8,用可溶性IgE和PT1079肽进行的竞争测定。将来自BSA-1079或HBC-1079免疫小鼠的血清与可溶性IgE(10μg/ml)或PT1079肽(25μM)或不相关肽PT326(25μM)预温育,然后加入到IgE包被的ELISA板中。数据为平均值±S.E.M(n=10)。
图9,PT1078抗IgE数据。(A)用25μg BSA-PT1078(用PTL化学缀合的)免疫的Balb C小鼠血清抗平板结合IgE的反应性。(B)用25μgBSA-1078(用PTL化学缀合的)免疫的Balb C小鼠血清抗受体结合IgE的反应性。
图10,用可溶性IgE和PT1078肽进行的竞争测定。将BSA-1078免疫小鼠的血清与可溶性IgE(10μg/ml)或PT1078肽(25μM)或不相关肽PT326(25μM)预温育,然后加入到IgE包被的ELISA板中。数据为平均值±S.E.M(n=10)。
图11,PT1079gs抗IgE数据。(A)用3μg HBC-1079gs免疫的BalbC小鼠血清抗平板结合IgE的反应性,(B)用3μg HBC-1079gs免疫的Balb C小鼠血清抗受体结合IgE的反应性。
图12,用可溶性IgE和PT1079肽进行的竞争测定。将HBC-1079gs免疫小鼠的血清与可溶性IgE(10μg/ml)或PT1079肽(25μM)或不相关肽PT326(25μM)预温育,然后加入到IgE包被的ELISA板中。数据为平均值±S.E.M(n=10)。
图13,BSA-C67-8诱导的小鼠抗血清的抑制活性。来自LolP1敏感性供体的细胞用小鼠血清(以1/50稀释)处理,然后用LolP1触发以释放组胺。数据为平均值±S.E.M.(n=10)。
图14,用BSA-1078和BSA 1079诱导的小鼠抗血清的抑制活性。来自LolP1敏感性供体的细胞用小鼠血清(BSA和BSA-1078抗血清以1/50稀释;BSA-1079抗血清以1/1250稀释)处理,然后用LolP1触发以释放组胺。数据为平均值±S.E.M.(n=10)。
图15,用HBC-C67-8、HBC-1078、HBC-1079和HBC-1079gs诱导的小鼠抗血清的抑制活性。来自LolP1敏感性供体的细胞用小鼠血清(HBC野生型(wt)和HBC-IgEC67-8抗血清以1/50稀释;HBC-1079和HBC-1079gs抗血清以1/1250稀释)处理,然后用LolP1触发以释放组胺。数据为平均值±S.E.M.(n=10)。
图16显示依赖于浓度的抗体PTmAb0005和PTmAb0011与IgE的结合。
图17,显示与对照相比的抗体PTmAb0005和PTmAb0011对IgE与FcεR1α/IgG构建体结合的浓度依赖性抑制。
图18,显示与对照比较的、抗体PTmAb0005对IgE与直接结合于塑料板的FcεRIα的修剪胞外域结合的浓度依赖性抑制。
图19,显示采用抗体PTmAb0005(GE-1)和PTmAb0011的IgE与FcεRII(CD23)的结合。
图20,显示与对照比较的、抗体PTmAb0005和PTmAb0011对变应性人血嗜碱性粒细胞组胺释放的浓度依赖性阻断。
图21,PTmAb0005和PTmAb0011两者对LolP1触发的变应性人嗜碱性粒细胞组胺释放的抑制。
图22,PTmAb0011与不同IgE的结合;(A)PTmAb0011与嵌合IgE的结合;(B)PTmAb0011与骨髓瘤IgE的结合;(C)PTmAb0011与抗原定向IgE的结合;(D)PTmAb0011与热变性IgE的结合图23,PTmAb0011对IgE与FcεR1α结合的抑制。
图24,PTmAb0011与受体结合IgE的结合。
图25,(A)PTmAb0011对IgE与RPMI 8866细胞上FcεRII结合的影响。将RPMI 8866细胞(1×106/ml)在冰上与嵌合IgE(1μg/ml)和抗IgE mAb(10-0μg/ml)孵育1小时。使IgE和抗IgE于室温温育1小时,然后加入细胞中。用FITC-山羊抗人IgE检测结合的IgE。结果显示通过流式细胞术分析10,000个活的门控(gated)事件测定的复份样品的平均通道(channel)荧光(MCF)。(B)非P1特异性抗体PTmAb0017。
图26,PTmAb0011对IgE与原代人B细胞上FcεRII结合的影响。将外周血单核细胞(1×106/ml)在冰上与嵌合IgE(1μg/ml)和抗IgEmAb(10-0μg/ml;空心)或相同浓度的同种型匹配的对照mAb(实心)孵育1小时。将所述IgE和抗IgE于室温预温育1小时,然后加入细胞中。用FITC-山羊抗人IgE检测结合的IgE,用PE缀合的抗CD19显示原代B细胞。显示通过流式细胞术分析5,000个活的门控事件测定的复份样品的平均通道荧光(MCF)。
图27,PTmAb0011对原代人B细胞分泌IgE的影响。
外周血单核细胞(2×105/孔)在补充IL-4(10ng/ml)和抗CD40抗体(1μg/ml)的培养液中培养。加入PTmAb0011或一种同种型匹配的对照mAb(1μg/ml)达14天,然后收获细胞上清液,并通过ELISA分析总IgE含量。结果以在缺乏任何抗体的情况下分泌的IgE量的百分比表示。
图28,抗人IgE单克隆抗体在变应性(A)和非变应性(B)人嗜碱性粒细胞中的过敏原性。来自变应性供体或用1μg/ml嵌合IgE被动敏化的非变应性供体的PBMC用mAb于37℃处理30分钟。通过特异性EIA测定组胺的释放。数据为每个不同供体3个独立实验的平均值。
图29,抗人IgE单克隆抗体在敏化(A)和非敏化(B)人肺肥大细胞中的过敏原性。敏化或非敏化的粗制人肺肥大细胞悬浮液用抗体于37℃处理45分钟。通过比色分析,测定上清液中类胰蛋白酶的释放。数据为来自一个代表实验的复份测定的平均值。
图30,抗人IgE抗体在RBL J41细胞中通过人FcεR1(A)和小鼠FcεR1(B)的过敏原性。RBL J41细胞用嵌合人IgE或小鼠IgE敏化,然后用抗体于37℃处理30分钟。通过比色分析,测定上清液中的β-氨基己糖苷酶释放。数据为来自一个代表性实验的三份平行测定的平均值。
图31,PTmAb0011对人嗜碱性粒细胞中变应原触发的组胺释放的抑制。将PBMC与PTmAb0011或者直接(变应性测定(A))于37℃温育30分钟,或者将它们与IgE(阻断测定(B))一起于37℃温育30分钟。随后细胞用抗原于37℃触发30分钟,然后通过特异性EIA测定组胺的释放。数据为不同供体的3个独立实验的平均值±s.e.m.。
图32,PTmAb0011和PTmAb0005对猴皮肤中被动皮肤过敏反应的抑制。单克隆抗体Dec7B(stanworth十肽)用作对照。
通过以下实施例说明本发明,但本发明不限于以下实施例。部分1 本发明的模拟表位和免疫原实施例1.1.1表面暴露表位的鉴定、化学缀合和血清学方法用Padlan和Davies描述的人IgE的建模结构(Mol.Immunol.,23,1063-75,1986),鉴定IgE Cε2区的表面暴露表位。鉴定出连续的溶剂暴露的肽。这通过以下步骤完成采用分子模拟软件(MSI)计算每种IgE氨基酸的可及性,在5残基滑动窗口范围平均所述可及表面,由此鉴定出IgE肽中5-mer内平均值大于80?2的区域。试验结果示于图1。结果从图1以及采用1990 Helm等模型(于2/10/90以PDB存储的2IgE模型结构(Protein Data Bank,Research Collabarotory for StructuralBioinformatics))的同一方法的多次重复来看,有许多天然肽可以用作用以产生抗IgE抗体的免疫原。表1,天然表面暴露的连续IgE肽。
合成这些肽或其模拟表位,并且或者将其与载体蛋白缀合,或者将其置于肝炎核心抗原构建体中,以形成表达重组肽的病毒样粒子。1.2采用琥珀酰亚胺-马来酰亚胺交联剂合成IgE肽/D蛋白缀合物采用马来酰亚胺-琥珀酰亚胺交联剂,可以将D蛋白直接与IgE肽缀合,形成本发明的抗原。这种化学通过固定琥珀酰亚胺基团提供载体残基的受控NH2活化。所述马来酰亚胺基团是一个半胱氨酸结合位点。因此,对于以下实施例的目的,待缀合的IgE肽需要加入一个N末端半胱氨酸。
所述偶联剂是一种选择性异双功能交联剂,该化合物的一端通过琥珀酰亚胺基酯活化蛋白载体的氨基,而另一端通过马来酰亚胺基团偶联所述肽的巯基。反应方案如下a.通过赖氨酸和琥珀酰亚胺基酯之间的反应活化蛋白 b.通过与马来酰亚胺基反应在活化蛋白和所述肽的半胱氨酸之间偶联 1.3IgE肽-D蛋白缀合物的制备将D蛋白以2.5mg/ml的浓度溶于pH7.2的磷酸缓冲盐溶液中。将偶联剂(N-[γ-马来酰亚胺基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯-GMBS)以102.5mg/ml溶于DMSO中,并加入所述蛋白溶液中。1mg D蛋白使用1.025mg GMBS。将反应溶液于室温温育1小时。通过在sephacryl200HR渗透凝胶上脱盐步骤除去副产物。所用的洗脱液是磷酸缓冲盐溶液Tween 80 0.1%pH6.8。收获并合并所述活化蛋白。将所述肽(在表1中鉴定的,或其衍生物或模拟表位)以4mg/ml溶于0.1M乙酸中,以避免形成二硫键。偶联使用每1分子活化D蛋白2-20个肽的摩尔比。将所述肽溶液缓慢加入到所述蛋白中,并且将混合物于25℃温育1小时。在偶联期间,将pH保持在6.6。通过于25℃、pH6.5下加入半胱氨酸(以4mg/ml溶于0.1M乙酸中每mg活化PD 0.1mg半胱氨酸)达30分钟,进行一个猝灭步骤。对NaCl 150mM Tween 80 0.1%透析2次,以除去过量的半胱氨酸或肽。
最后一个步骤是在0.22μm膜上进行过滤除菌。终产物是澄清的可过滤溶液,将其保存于4℃。可以通过氨基酸分析测定最终的肽/PD比。
以类似的方式,可以将本发明的肽与其它载体包括BSA缀合。
一种P1的模拟表位是合成的CLEDGQVMDVDLL(P15,SEQ IDNO.8),采用上述技术将其与D蛋白和BSA两者缀合。1.4ELISA法抗肽或抗肽载体ELISA用以下概述的ELISA技术,研究抗肽和抗载体免疫应答。微量滴定板(Nunc)用PBS中的特定抗原包被(4°过夜),然后进行以下两者之一2μg/ml链霉抗生物素蛋白(然后与生物素酰化肽(1μM)于37℃温育1小时)、洗涤3X PBS-Tween 20 0.1%。用PBS-BSA 1%-Tween 200.1%(饱和缓冲液)将板于37°饱和1小时。加入第一(1°)抗体=以两步稀释的血清(于饱和缓冲液中),于37°温育1小时30分钟。洗涤3次。加入与HRP偶联的第二(2°)抗小鼠Ig(或抗小鼠同种型特异性单克隆抗体),于37°温育1小时。洗涤5次。用TMB于室温避光显色10分钟。用0.4N H2SO4阻断反应。检测小鼠血清中抗人IgE反应性的方法(IgE板结合ELISA)ELISA板用pH9.6碳酸盐/碳酸氢盐包被缓冲液中的1μg/ml人嵌合IgE于37℃包被1小时,或于4℃包被过夜。用含5%w/v Marvel奶粉的PBS/0.05%Tween-20于37℃ 1小时封闭非特异性位点。随后加入小鼠血清在PBS/0.05%Tween-20/1%w/v BSA/4%新生小牛血清中的连续稀释液于37℃达1小时用山羊抗小鼠IgG-生物素(1/2000),然后用链霉抗生物素蛋白-HRP(1/1000),检测多克隆血清结合。。用TMB底物于450nm检测缀合的抗体。在每个板上包括一条PTmAb0011标准曲线,以便可以以μg/ml计算血清样品中的抗IgE反应性。检测小鼠血清中抗人受体结合IgE反应性的方法ELISA板用pH9.6碳酸盐/碳酸氢盐包被缓冲液中的0.5μg/ml重组人FcεR1α于37℃包被1小时,或于4℃包被过夜。用含5%w/vMarvel低脂奶粉的PBS/0.05%Tween-20于37℃ 1小时封闭非特异性位点。然后加入1μg/ml人IgE于37℃达1小时。随后加入小鼠血清在PBS/0.05% Tween-20/1% w/v BSA/4%新生小牛血清中的连续稀释液于37℃达1小时。用山羊抗小鼠IgG-生物素(1/2000),然后用链霉抗生物素蛋白-HRP(1/1000),检测多克隆血清结合。用TMB底物于450nm检测缀合的抗体。在每个板上包括一条PTmAb0011标准曲线,以便可以以μg/ml计算血清样品中的抗IgE反应性。用模拟表位肽-可溶性IgE或PTmAb0011竞争IgE结合在预封闭的聚丙烯96孔板中,将多克隆小鼠血清的单一稀释液与单一浓度的或者模拟表位肽或人IgE混合。将混合物于37℃温育1小时,然后加入到IgE包被的ELISA板中于37℃达1小时。用山羊抗小鼠IgG-生物素(1/2000),然后用链霉抗生物素蛋白-HRP(1/1000),检测多克隆血清结合。用TMB底物于450nm检测缀合的抗体。对于血清和PTmAb0011竞争IgE的结合,将血清和PTmAb0011-生物素的混合物加入到IgE包被的ELISA板中。用链霉抗生物素蛋白-HRP(1/1000)检测PTmAb0011的结合。1.5人嗜碱性粒细胞测定用人嗜碱性粒细胞(HBA)进行两种类型的测定,一种测定是测定所述单克隆抗体的过敏原性,包括将所述抗体加入到分离的PBMC中;第二种测定是测量通过所述HBA与所述单克隆抗体的预温育对LolPI(一种强变应原)触发的组胺释放的抑制。
通过静脉穿刺术从变应性供者将血液收集到含有0.1体积2.7%EDTA,pH7.0的试管中。然后将其用等体积的含0.1%人血清白蛋白的HBH培养液(HBH/HSA)以1/2稀释。将所产生的细胞悬浮液铺在50%体积的Ficoll-Paque上,然后以400g于室温离心30分钟。收集位于界面的外周血单核细胞(PBMC)层,并弃去沉淀。细胞在HBH/HAS中洗涤1次,对其计数,将其重悬于HBH/HAS中,细胞密度为2.0×106/mL。将100μl细胞悬浮液加入到含100μl稀释的试验样品或单克隆抗体的V形底96孔板各孔中。以一定范围的稀释液测试每种试样样品,每种稀释液6个孔。用平板摇动器将孔内容物短暂混合,然后于37℃温育30分钟,同时以120rpm振摇。
对于每种血清稀释液,通过加入10μl LolpI提取物(最终稀释度为1/10000)触发3个孔,而3个孔含有加入的10μl HBH/HSA,以评价过敏原性。用平板摇动器再次将孔内容物短暂混合,然后于37℃再温育30分钟,同时以120rpm振摇。通过以500g离心5分钟终止温育。取出上清液,以采用市售组胺EIA测量试剂盒(Immunotech)进行组胺测定。常规包括含有细胞但无试验样品的对照孔,以测定自发释放和触发释放。也包括含细胞+0.05%Igepal去污剂的孔,以测定总细胞组胺。
结果如下表示过敏原性测定由试验样品引起的组胺释放=来自试样样品处理的细胞的组胺释放的百分比-自发组胺释放的百分比。阻断测定采用下式可以计算组胺释放的抑制程度抑制百分比=1-(来自试样样品处理的细胞的组胺释放*)×100(来自抗原刺激的细胞的组胺释放*)根据自发释放校正数值。实施例2,用P15缀合物(P15-BSA或P15-PD)免疫小鼠,诱导抗人IgE抗体的产生。
将在1.4中描述的包含模拟表位P15(25μg蛋白/剂量)的缀合物给予各组的10只BalbC小鼠,用WO 95/17210中描述的含有QS21和3D-MPL的水包油乳液作为佐剂。在第21天和第42天进行加强,并且可以在第42天和第56天收集血清。用实施例1所述方法,测定免疫应答抗肽和抗平板结合IgE。结果在第3次接种后第14天测量的抗肽和抗IgE应答的结果示于表2中。表2,P15免疫原性结果
实施例3,用缀合物免疫后在小鼠中诱导的抗IgE是非过敏原性的可以在存在从变应性患者新收集的外周血的嗜碱性粒细胞的情况下,测试全血清或从缀合物免疫小鼠纯化的IgG的几种稀释液。
如下所述,通过测量由待测试抗体诱导的组胺释放,可以评价过敏原性■在葡萄糖葡聚糖梯度上从外周血中取出红细胞■洗涤细胞,并且加入待测试样品(例如变应原、抗体、变应原+抗体、...)■温育后,收集上清液,按照生产商的说明(Immunotech,组胺酶免疫测定试剂盒)测量组胺释放用或者P15-BSA或者P15-PD产生的抗血清都未表现出过敏原性。实施例4,用缀合物免疫后在小鼠中诱导的抗IgE能够阻断变应原触发变应性患者的嗜碱性粒细胞诱导的IgE介导的组胺释放。
可以测量在存在或缺乏全血清或从缀合物免疫小鼠纯化的IgG的几种稀释液的情况下用不同浓度变应原触发的嗜碱性粒细胞样品中的组胺释放。通过测量由所述变应原诱导的组胺释放的抑制,评估抗血清中抗P15抗体的阻断活性。如实施例3所述,测量组胺释放和抑制。由于P15是一种P1的模拟表位,因此将PTmAb0011用作对照,因为已知它与同一表位(P1)结合。结果示于表3中。表3,对变应性人嗜碱性粒细胞组胺释放的抑制
实施例5,P2和P3的模拟表位的免疫原性用实施例1.2所述技术,将以下模拟表位与BSA缀合,并且采用实施例2所述的相同制剂和方案,用所述缀合物免疫小鼠。
在最后一次免疫后给小鼠放血,并在IgE平板结合ELISA中测试抗IgE反应性。以下总结了单个结果、平均结果(Av)、几何平均结果(GM)(SD=标准偏差)。表4,P16和P17免疫原性结果
实施例6,P1模拟表位的产生和其免疫原性/功能活性6.1免疫原的产生通过噬菌体展示技术或通过对IgE Cε2区的C-D环分子建模进行合理设计,衍生P1的模拟表位。合成以下肽,并将其构建为BSA-肽缀合物,也将其构建到HepB核心抗原重组构建体中。
如下产生所述肽/蛋白载体构建体。如方案1(图2)所示,在固相上制备酰基肼肽衍生物。用众所周知的‘Fmoc’法,在全自动仪器中,采用或者聚酰胺或者聚乙二醇-聚苯乙烯(PEG-PS)支持体,通过本领域众所周知的技术[用于固相合成的技术和方法由E.Atherton和R.C.Sheppard描述于‘Solid Phase Peptide SynthesisA Practical Approach’,由IRL at Oxford University Press出版(1989)],可以容易地制备这些肽衍生物。酸介导的切割提供了线性、去保护、经修饰的肽。用D.Andreau等在‘Methods in Molecular Biology,第35卷PeptideSynthesis Protocols(M.W.Pennington和B.M.Dunn编著),第7章,第91-171页中概述的方法,可以容易地将这种肽氧化和纯化,得到二硫桥修饰的表位。
采用以下技术,可以将由此合成的肽与蛋白载体(在这种情况下为牛血清白蛋白,BSA)缀合6.2修饰载体的合成采用如方案2所述(图3,有关进一步的细节参见WO 98/17628)制备的琥珀酰亚胺基活性酯(BAL-OSu),引入芳基醛官能团。将BAS(牛血清白蛋白)的氨基官能取代至约50%,得到常规可溶性的修饰蛋白。对所述BSA进行更多的取代,产生不溶性构建体。在DMSO/缓冲液(参见方案3,图3)中将等摩尔浓度的BSA和BAL-OSu混合2小时。这种实验性衍生的方案导致通过荧光胺试验判断,BSA中约50%游离氨基被取代。6.3肽-BSA构建体修饰的肽和衍生化BSA的简单组合提供容易通过透析分离的肽-BSA构建体(方案4,图4)。用SDS-PAGE来证实分子量的增加。6.4肝炎核心抗原构建体用EP 0 421 635 B中描述的分子生物学技术,也制备了肝炎核心抗原重组构建体(HBC)。在这些HBC实验中,对PT1079加以修饰,以除去末端赖氨酸。
通过用PTmAb0005和PTmAb0011进行BIAcore实验,证实P1模拟表位肽的表达。用仅为3μg/剂HBC的剂量产生免疫原性结果。6.5免疫原性研究纯化所述模拟表位/HBC和模拟表位/BSA构建体,将其配制为疫苗,并且用WO 95/17210中描述的含有QS21和3D-MPL的水包油乳液作为佐剂(25μg BSA缀合物剂量)。将这些疫苗给予各组的10只BalbC小鼠,并且在第14天和第28天进行加强,然后在第42天收集血清。然后用实施例1.4中描述的技术,研究对抗平板结合IgE和受体定向IgE的免疫应答。此外,用1.5中描述的技术,测量抗血清在抑制变应性嗜碱性粒细胞释放组胺方面的活性。6.6结果当所述IgE直接结合于ELISA板时,以及定向到高亲和性受体时,所有BSA和HBC构建体均诱导高效价的抗IgE抗体。而且,证实所有这些应答均是特异性的,因为它们受到游离IgE和所述模拟表位本身的竞争,并且不受非特异性肽的竞争。由这些免疫原诱导的抗IgE能够抑制来源于变应性供体(黑麦草,LOLP1)的人嗜碱性粒细胞释放组胺。
C67-8的结果参见图5、6、13和15。PT1078的结果参见图9、10、14和15。PT1079的结果参见图7、8、14和15。PT1079GS的结果参见图11、12和15。
此外,由这些肽模拟表位产生的免疫应答不是过敏原性的。表5,P1模拟表位抗血清的过敏原性
表的脚注,来自LolP1过敏性供体的细胞用稀释的小鼠血清处理30分钟。通过市售的组胺特异性EIA测定释放的组胺。数据为平均值±S.E.M.(n=10)。部分2 与本发明的表位和模拟表位结合的配体肽免疫原为部分1中描述的肽免疫原,它们在以疫苗形式给予哺乳动物后,诱导免疫应答,所述免疫应答(a)识别IgE,和(b)能够体外抑制组胺释放。部分2描述了能够与本发明的表位或模拟表位结合的配体,并且描述了其功能。已经鉴定出两种识别IgE Cε2的c-d环的单克隆抗体-PTmAb0005和PTmAb0011。在部分1中已经表明这种肽的模拟表位是免疫原性的,并且在活性疫苗中有功能。这一节描述这些单克隆抗体的表征,并且提供它们在被动疫苗接种方面用途的证据。
采用噬菌体淘选技术,即多个噬菌体靶的序列对比,鉴定所述抗体的靶表位,随后精选,并通过结构域作图和定点诱变加以证实。所述抗体的功能活性不仅在体外通过分析抗IgE的识别和变应性介质释放的抑制得以证实,而且在体内通过猴被动皮肤过敏性(PCA)研究而得以证实。实施例7,7.1单克隆抗体靶的噬菌体作图用噬菌体展示文库,采用3种不同的噬菌体文库,在噬菌体gVIIIp的N末端展示或者XCX15、XCX10或者XAX10肽序列(其中X为任何氨基酸),将所述单克隆抗体的结合位点作图。表6和表7显示分别用抗人IgE单克隆抗体PTmAb0005和选择肽配体的结果。所述肽和人IgE之间的氨基酸模式的相似性表明与IgE Cε2区中的c-d环的强同源性匹配。由噬菌体回复产生的同源性模式是Qhhahah(其中h=疏水性氨基酸,而a=酸性氨基酸),并且这与人IgE Cε2区C-D环中的序列QVMDVDL(SEQ ID NO.17)是匹配的。
在IgEC67中,也对得自噬菌体淘选实验并且对PTmAb0005具有最高亲和性的肽进行表位作图。通过经PCR诱变引入随机突变,并且亚克隆到Fuse 5载体中用于次要丝状噬菌体蛋白gIIIp展示,进行这种作图。将IgEC67突变体按与PTmAb0005结合的顺序分等级,如表8中所示。这些结果和其它结果表明了IgEC67中与所述Cε2表位匹配的氨基酸的重要性。例如,L8P、D10G、L11M、E12G和L13R突变体均降低与抗IgE PTmAb0005的结合(数据未显示)。其它位点的突变对与PTmAb0005的亲和性几乎没有影响。
由最高亲和性PTmAb0005和PTmAb0011噬菌体展示衍生肽制备随机亚文库,以采用先前描述的方法(Yu,J.和Smith,G.P.(1996)“噬菌体展示的肽配体的亲和性突变”Methods in Enzymology,267,3-27)增强所述肽对所述抗体的亲和性,这涉及借助一个随机PCR步骤,将DNA亚克隆从所述主要外壳蛋白(gVIIIp)丝状噬菌体展示载体转移至较低拷贝数的次要噬菌体外壳蛋白(gIIIp)展示载体。由包括最高亲和性PTmAb0005配体IgEC67和IgE C67-8在内的几个噬菌体序列制备亚文库。C67和C67-8的亲和性成熟(matured)序列分别示于表8和表9。在所述表中包括等级次序,也包括BIAcore亲和性(如果可得到的话)。当用表达IgEC67-8的噬菌体作为免疫原时,IgEC67-8能够在小鼠中诱导抗人IgE应答。7.2通过结构域作图证实靶产生大量构建体,以将PTmAb0005和PTmAb0011对IgE恒定区的结合特异性作图。产生以下构建体Cε2-4、Cε2-3、Cε3-4、Cε3-4L(Cε3-4加Cε2区和Cε3区之间的接头序列)和单独的Cε2。
用衍生自杂交瘤系JW8/5/13的cDNA,克隆包含不同人IgE Fc区的片段,所述杂交瘤系表达嵌合人IgE(Neuberger,MS等(1985)Nature 314 268-270;Bruggemann,M等(1987)J Exp Med 166 1351-61)。用合适的引物对并用JW8/5/3 cDNA作为模板,扩增所述IgE Fc片段。cε2-4片段编码氨基酸(aa)S225-K547。cε3-4片段编码aaG335-547。cε3-4L片段(结构域3-4加连接cε2至cε3的接头序列)编码aa E322-K547。cε2-3片段编码aa S225-G436。cε2片段编码aa S225-S324。所有的构建体均含有一个COOH末端六组氨酸尾,以用于检测和纯化。将这些片段克隆到真核生物表达载体中,且与得自CD33的前导编码序列符合读框,以指导所表达片段的分泌。这使得能够在哺乳动物细胞系中表达。该载体衍生自pcDNA3.1+(Invitrogen)。为了表达所克隆的片段,将合适的克隆转染到COS-7细胞中,并且在转染后48-60小时收获所产生的条件培养液。
通过ELISA测定,通过使所述构建体与EILSA板结合,然后与PTmAb0005和PTmAb0011温育,并且用抗小鼠抗体显示,研究PTmAb0005和PTmAb0011与所表达的IgE区的结合。此外,通过众所周知的蛋白质印迹技术,研究与变性构建体的结合。
PTmAb0005的结果显示,与天然形式的Cε2-4、Cε2-3和Cε2强结合,在蛋白质印迹中也与变性后的Cε2-4和Cε2结合。在两种测定中都未观察到与Cε3-4或Cε3-4L的结合。
PTmAb0011也与天然形式的Cε2-4、Cε2-3和Cε2结合;也与变性形式的Cε2-4和Cε2结合。
因此,显然这两种抗体均识别IgE Cε2区中存在的一个靶表位。7.3通过定点诱变证实靶结构域作图研究证明,两种mAb均能够与单独的Cε2区结合。对衍生自噬菌体展示肽文库的生物淘选序列的分析表明,PTmAb0005衍生序列显示出与P1的显著相似性。在IgE模型结构中该区在Cε2的C-D β链之间形成一个环。进行定点诱变研究以证实该序列对于PTmAb0005和PTmAb0011为表位。
经淘选的噬菌体序列的分析和所述IgE模型结构(Helm等1990,参见上文)与已知的人IgG1 Fc结构(Deisenhoffer,J.,1981,Biochemistry,20,2361-2370)的比较,导致鉴定出3个可能参与抗体识别的残基。这些残基是谷氨酰胺(Q)273、甲硫氨酸(M)275、天冬氨酸(D)276。将这3个残基中的每个残基变为丙氨酸(A),而至少另一个氨基酸残基如下。
Q273A和E(谷氨酸)M275A;Q和K(赖氨酸)D276A和N(天冬酰胺)所述丙氨酸突变既改变所述靶残基的结构,又改变所述靶残基的化学,而另一突变保持结构(尽可能地接近),但改变电荷,例如Q273E。这里,谷氨酸具有与谷氨酰胺基本相同的结构,但带负电,而不是中性的。
在Cε2-4构建体中独立地产生每种突变。每种突变多肽的表达水平与野生型(WT)Cε2-4相似,并且在基于ELISA的测定中,每种突变多肽均能够同WT cε2-4产物同样有效地与重组FcεR1α胞外域结合。总之,这些数据表明,所述突变对在所述表达系统中所述多肽的产生/分泌没有影响,并且大体上不影响cε2-4片段的结构。
除D276N外,所有的突变均基本上消除了与PTmAb0005和PTmAb0011的结合,D276N将与PTmAb0005的结合仅降低约50%(表10)。进行Cε2内的可变谷氨酰胺残基Q317的突变,以作为这些实验的对照。产生Q317E和Q317K突变体,并且发现它们对PTmAb0005和PTmAb0011识别Cε2-4的能力没有影响。同样,不影响FcεR1α的识别。
因此,PTmAb0005和PTmAb0011的结合活性特异性地受Cε2的C-D环内突变的影响。
总之,序列P1包含对PTmAb0005和PTmAb0011两者的主要结合决定簇。表10,PTmAb0005和PTmAb0011对IgE结构域构建体的识别
7.4 IgE Cε2的C-D环的精细建模由于尚未确定人IgE的实际结构(尽管可得到一种模型),因此在详细水平上检查后该模型结构仍有可能出错。因此,本发明人通过将IgE的Cε2环区作图至人IgG1 Cγ2的等同区(Deisenhoffer J 1981参见上文),改进了IgE的Cε2环区的这种模型。
根据关于所述结构特征范围的这一新信息,设计了一种环化肽,所述环化肽当合成时,应该采取非常类似全IgE分子环境中Cε2的C-D环构象的构象。这种肽-Ac-CLEDGVQMDVDLCPREAAEGDK(Ac)-NH2被命名为PT1079(SEQID NO.14)。
用BIAcore技术,测量PT1079与PTmAb0005和PTmAb0011两者的亲和性,发现PT1079表现出对这两种单克隆抗体非常强的识别(被PTmab0005和PTmAb0011两者识别,其表观亲和性分别为~20nM和~250nM)。对照为其中环化位点仅移动一个氨基酸残基的PT1079的衍生肽,并因此将所述环化位点之间的肽长度减少一个氨基酸残基(PT1078),所述对照降低了所述肽与或者PTmab0005或者PTmAb0011的结合。此外,将PT1078修饰,以便加入一个额外残基,使得环区的残基数与PT1079相同,然而这一修饰不能恢复与PTmAb0005或PTmAb0011的结合。因此,表明正确呈递本发明的肽以使其采取非常类似全IgE分子环境中所述天然靶的形状的重要性。 总结本文描述的研究表明,单克隆抗体PTmAb0005和PTmAb0011特异性地识别P1。这些抗体已经用于噬菌体展示研究,以鉴定被所述单克隆抗体以高亲和性识别的IgE Cε2区中c-d环的模拟表位。7.5 PTmAb0005和PTmAb0011特征的功能特征以下实验描述了PTmAb0005和PTmAb0011的功能特征。因此,应用这些抗体的靶将诱导PTmAb0005和PTmAb0011样免疫应答。因此,采用基于这些肽的免疫原的疫苗接种将具有相同的功能特征。实施例8,8.1材料和方法8.1.1 FcεRIα结合测定(A蛋白平板)在该测定中,用重组形式的IgE高亲和性受体α链的胞外域(α胞外域),结合嵌合IgE。将所述α胞外域的羧基末端与人IgG1 Fc序列融合。这使得所述重组分子能够通过所述Fc区,结合A蛋白包被的微量滴定板。因而,大多数所述α胞外域分子应该可得到结合配体,并且提供一种用于分析IgE-受体相互作用的系统。下述测定形式的目的是检测阻断抗IgE抗体活性的(高亲和性)受体。8.1.2用于检测IgE与高亲和性受体α链胞外域结合的ELISA方案用在封闭缓冲液(PBS/5% BSA/0.05% Tween-20)中稀释至0.25μg/ml的100μl/孔α胞外域(α-ecto)-Ig融合蛋白包被A蛋白板。于37℃温育1小时。在10%猪血清中将嵌合IgE稀释至0.03125μg/ml。在该IgE溶液中将抗IgE抗体稀释至合适的试验浓度。于室温温育1小时。运用洗板机,用PBS/0.05%Tween-20洗板3次。加入100μl/孔的IgE抗IgE溶液(每个抗IgE浓度分析4个平行测定)。于37℃温育1小时。运用洗板机,用PBS/0.05%Tween-20洗板3次。加入100μl/孔的山羊抗小鼠λ链HRPO缀合的抗体在封闭缓冲液中稀释的1∶6000稀释液。于37℃温育1小时。运用洗板机,用PBS/0.05% Tween-20洗板3次。加入200μl/孔的OPD底物,并于室温避光温育2-10分钟。加入25μl 25%H2SO4终止反应。在平板摇动器上慢速混合已终止的反应物。于490nm读出OD。
可以计算出关于对IgE与其受体结合的抑制百分比的图。根据仅在10%猪血清中含有IgE(即无抗IgE)的一组孔的平均值,确定IgE的最大结合值。
因此,抑制百分比值计算为(最大IgE值-抗IgE平行测定的平均值)/最大IgE值×1008.1.3 FcεRIα结合测定(经修剪的胞外域)该测定基本上与前一测定相同,只是FcεRIα胞外域/IgG构建体用蛋白水解酶-因子X处理,以切割所述两个部分。用A蛋白微珠(bead)除去IgG Fc部分,而用链霉抗生物素蛋白微珠除去因子X,因此留下基本纯的α链胞外域产物。在该测定形式中,所述α胞外域直接与塑料微量滴定板结合,所有其它测定细节如上所述。8.1.4 CD23结合测定(FcεRII,低亲和性受体)该测定或者在RPMI 8866细胞上或者在原代人B细胞上进行;可以使用两种形式,一种形式用于检测与结合了FcεRII的IgE结合的mAb,而第二种形式分析所述mAb是否干扰结合了FcεRII的IgE。对于第一种测定,在PBS,1%FBS,0.1%NaN3中,在冰上向细胞加入嵌合IgE(1μg/ml)达1小时。除去过量的IgE并加入抗IgE mAb。结合的mAb均用FITC缀合的大鼠抗小鼠IgG1抗体显现。对于第二种测定,将嵌合IgE(1μg/ml)与抗IgE mAb于室温预温育1小时,同时温和混合,然后将其加入到细胞中。将该混合物与所述细胞在冰上孵育1小时,然后洗涤以除去未结合的IgE。用FITC-山羊抗人IgE检测结合的IgE,或者用FITC-缀合的大鼠抗小鼠IgG1抗体检测结合的抗IgE mAb。当在PBMC上进行研究时,用PE缀合的抗CD19抗体鉴定组分B细胞。通过流式细胞术分析样品。8.2结果PTmAb0005和PTmAb0011的结果示于图16-21。
图16显示单克隆抗体与平板结合的IgE的浓度依赖性结合。图17显示PTmAb0005和PTmAb0011对IgE与FcεR1α/IgG构建体结合的浓度依赖性抑制。图18显示抗体PTmAb0005和PTmAb0011对IgE与直接结合于塑料板的FcεRIα经修剪的胞外域结合的抑制。图19显示抗体PTmAb0005(克隆GE-1)和PTmAb0011对IgE与FcεRII(CD23)的结合没有抑制作用。图20和21显示抗体PTmAb0005和PTmAb0011对变应性人血液嗜碱性粒细胞组胺释放的浓度依赖性阻断作用。
PTmAb0011是一种对人IgE有特异性的小鼠单克隆抗体,表明与其它人Ig同种型或大鼠/小鼠IgE没有交叉反应性。当以随机方向与ELISA板结合时,PTmAb0011与天然IgE和经热处理的IgE均结合,表明IgE上的其识别位点不是热不稳定的。当通过抗原与ELISA板结合时,PTmAb0011也识别IgE。重要的是,这种mAb可以完全阻断人IgE与高亲和性IgE受体(FcεRI)的α链结合组分之间的相互作用。然而,这种mAb当预结合于FcεRI时仍识别人IgE,表明该mAb结合位点在受体结合时未丧失。实施例9,9.1通过普通EILSA和抗原定向ELISA分析PTmAb0011的IgE结合特性如实施例1中所述,通过用人嵌合IgE、骨髓瘤IgE、人Ig同种型或啮齿动物IgE(1μg/ml,在pH9.6碳酸盐/碳酸氢盐包被缓冲液中)包被平板,进行普通的IgE结合ELISA法。对于抗原定向ELISA,以饱和浓度包被NP-BSA,然后加入嵌合IgE(1μg/ml)。另一方面,包被可溶性人FcεRIα链(0.25μg/ml),然后包被嵌合IgE。如实施例1所述(用于检测小鼠抗人IgE mAb的ELISA方案)进行其余的ELISA。9.2结果图22说明,PTmAb0011当以随机定向方式结合于ELISA板时,与人/小鼠嵌合IgE和人骨髓瘤IgE均结合。同样,与抗原定向IgE的结合(即与平板结合NP-BSA结合的IgE)是剂量依赖性的。也分析了PTmAb0011识别在56℃热处理一定时间后的嵌合IgE的能力。图22也表明,PTmAb0011对IgE的结合容量不受热处理影响。
进一步扩展所述mAb的表征,以确定PTmAb0011是否能够抑制IgE与高亲和性IgE受体的α链组分的相互作用(图23)。将IgE与PTmAb0011预温育,然后加入到平板结合的FcεRIα链中,导致对IgE与FcεRIα链相互作用的剂量依赖性抑制。PTmAb0011也(图24)以剂量依赖性方式识别FcεRIα链连接的IgE。实施例1010.1原代人B细胞分泌IgE的分析在96
衍生自lgECε2区的表位或模拟表位、其拮抗剂以及它们的治疗用途制作方法
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