专利名称：没食子提取物在制备抑制结肠癌细胞增殖的药物中的用途的制作方法维吾尔医药是维吾尔民族在长期生活，生产和同疾病斗争中积累起来的经验和智 慧的结晶，是祖国医药的一个重要组成部分，无论在基础理论方面，还是在医疗方法和用药 规则方面都独树一帜，并已形成比较完备，独特的理论体系。没食子自古以来在维吾尔医学 中被视为治疗各种急、慢性炎症性疾病的良药，具有消炎、止血、固涩、收敛的功效，用于治 疗牙周炎、泻痢不止、习惯性肠炎等。没食子的主要成分是鞣质，鞣质又称单宁(tannin)，是 存在于自然界的一类结构比较复杂的多元酚类化合物，具有收敛、抗炎、抗过敏、抑菌、抗病 毒、抗肿瘤、止血、镇痛、降血脂、降血糖、增强肾功能等作用。由于鞣质具有较多的邻位酚羟 基，易被氧化，因此，很难获得单体，国内外也对鞣质化学成分的研究很少。溃疡性结肠炎是一种原因未明与自身免疫有关的炎症性肠病，以腹泻、粘膜脓血 症、腹痛及里急后重为主要症状，以结肠粘膜慢性炎症和溃疡形成为病理特点的消化道常 见病和疑难病。研究发现，溃疡性结肠炎和结肠癌发生之间存在联系，认为有部分溃疡性结 肠炎病例最终可发展为结肠癌。结肠炎的癌变主要决定于结肠炎的发生程度、发生部位及 病程长短。虽然临床采用非留体抗炎药物治疗可以降低结肠炎的癌变率，但长期服用，药物 的副作用使病人难以耐受，并且非留体抗炎药物同时增加了消化道溃疡和出血的概率，在 肠道反复出血和末端回肠炎反复发作的患者中，该类药物的使用是相对禁忌的。因此，寻 找新的治疗药物，有效控制结肠炎的发展，并阻止结肠炎的癌变，一直是研究者们关注的热 点ο研究发现，细胞的异常增殖及分化受到抑制是肿瘤发生的主要机制。对细胞凋亡 的研究发现，正常组织的相对稳定实际上是细胞增殖、分化和凋亡之间的动态平衡。肿瘤细 胞的增殖、凋亡不仅受到药物、放射线等多种因素和途径的影响，而且某些肿瘤基因或肿瘤 抑制基因对细胞凋亡也起重要的调控作用。本发明是根据已获得的“防治口腔病的口洁液及制备方法”(专利号为ZL 97116074. 0)的基础上，研制开发没食子(西帕依)固龈液，并被列入为《中华人民共和国 卫生部药品标准_维吾尔药分册》1999年版收载品种(编号02CJ-15-02-13)。将没食子 (西帕依)固龈液通过改变其给药途径增加新的适应症，以灌肠的方式使用于溃疡性结肠 癌的治疗得到了良好的临床疗效。研究表明，药品没食子(西帕依)固龈液的主要成分为没食子提取物，对慢性溃疡 性结肠炎的腹痛、腹泻和脓血症等疗效显著；对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎 双球菌等口腔疾病的常见致病菌有很强的抑制作用；明显抑制角叉菜胶所致小鼠足跖肿胀 及大鼠腹腔白细胞游出；抑制醋酸所致小鼠毛细血管通透性增加；抑制棉球肉芽肿；抑制 醋酸所致小鼠扭体反应及酵母所致大鼠体温升高；延长小鼠游泳时间；抑制DNCB诱导的小 鼠迟发型超敏反应；能使小鼠凝血时间明显缩短，证明其对急、慢性炎症反应均有显著抑制作用，并能有效抑制炎症阶段毛细血管的通透性，减轻渗出反应，同时有较强的解热镇痛及 抗疲劳功能。本发明针对药品名为没食子固龈液在治疗溃疡性结肠炎的临床有效性及溃疡性 结肠炎和结肠癌发生之间的内在联系，对药品没食子固龈液中的主要成分没食子提取物 抑制人结肠癌细胞HT-29增殖及诱导其调亡的应用加以阐述，增加了该制剂的临床使用范 围，为结肠癌的防治提供了新的天然药物。在国内外尚未发现没食子固龈液应用于人体抑 制HT-29增殖及诱导其调亡中的报道。
本发明的目的在于，提供一种没食子提取物在制备抑制结肠癌细胞HT-29的药物 中的用途，本发明是在“防治口腔病的口洁液及制备方法”(专利号为ZL 97116074. 0)的基 础上，对防治口腔病的口洁液提供了新的用途。本发明以人结肠癌HT-29细胞为实验载体， 采用MTT、流式细胞术等实验方法，从癌细胞增殖和凋亡角度阐述”防治口腔病的口洁液“中 的主要成分没食子提取物对人结肠癌HT-29细胞的作用特点，通过抑制细胞增殖及诱导细 胞凋亡的方式，抑制结肠癌细胞的生长，这种作用具有浓度-效应依赖性关系。从分子生物 学水平上揭示了没食子提取物的抗结肠癌作用部位即新靶点，为结肠癌的防治提供新的天 然药物。本发明所述的一种没食子提取物在制备抑制结肠癌细胞HT-29的药物中的用途， 是在浓度为5X IO4个/ml的对数生长期人结肠癌HT-29细胞悬液中加入没食子提取物， 使其最终浓度达到0. 01ug/ul、0. 025ug/ul、0. 05ug/ul、0. lug/ul、0. 25ug/ul、0. 5ug/ul、 1. 0ug/ul、2. 5ug/ul 或 5ug/ul，在 5 % CO2，温度 37°C，共同培育 3，6，12，24，48，72 小时，采 用MTT比色法测定没食子提取物对人结肠癌HT-29细胞增殖的抑制作用，结果证明，没食子 提取物能够以时间依赖性和浓度依赖性的方式抑制人结肠癌HT-29细胞增殖。所述的一种没食子提取物在制备抑制结肠癌细胞HT-29的药物中的用途，是在浓 度为5 X IO4个/ml的对数生长期人结肠癌HT-29细胞悬液中加入没食子提取物，使其最终 浓度达到0. lug/ul、0. 25ug/ul、0. 5ug/ul、l. Oug/ul 或 2. 5ug/ul，在 5% CO2，温度 37°C，共 同培育48，72小时，采用流式细胞术测定没食子提取物对结肠癌HT-29细胞凋亡的诱导作 用，结果证明，没食子提取物能够以浓度依赖性方式诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡。本发明所述的没食子提取物，是将没食子药材20g，粉碎，加水200ml，浸泡1小时 后，煎煮0. 5小时，共煎煮3次，合并煎液，采用板框法过滤，滤液中依次加入2g甜蜜素、Iml 薄荷香精及0. 5g苯甲酸钠，搅拌使溶解均勻，加水使药液体积调整至1000ml，分装、灭菌， 即可。DMEM人结肠癌HT-29细胞胎牛血清无水乙醇MTT胰蛋白酶1. 2主要仪器超净工作台CO2 孵箱电子天平-20°C、4°C 低温冰箱流式细胞仪细胞计数板台式高速冷冻离心机倒置相差显微镜2.实验方法2. 1细胞培养人结肠癌细胞株HT-29生长于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，温度37°C，5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中进行培养，每2-3天更换培养液一次，取对数生长期的细胞用 于实验。2. 2MTT法检测没食子提取物抑制人结肠癌HT-29细胞增殖的作用(1)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为5X IO4个/ml，每孔加入100 μ 1，铺板；(2) 5% CO2，温度37°C孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入没食子提取 物，药物最终浓度达到0. 01ug/ul、0. 025ug/ul、0. 05ug/ul、0. lug/ul、0. 25ug/ul、0. 5ug/ ul、1. 0ug/ul、2. 5ug/ul或5ug/ul，每组设4个复孔，同时设置空白对照组；(3)5 % CO2,温度 37 °C 孵育，继续培养 3h、6h、12h、24h、48h 和 72h，每孔加入 20ulMTT 溶液(5mg/ml，即 0. 5% MTT)，再继续培养 4h ；(4)终止培养，小心吸去孔内培养液；(5)每孔加入150 μ 1 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解， 在酶联免疫检测仪0D490nm处测量各孔的吸光度值(A值)，同时设置调零孔(培养基、MTT、 二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)；(6)实验重复3次； (7)抑制率的计算抑制率=[(对照组A值-空白组A值)_(实验组A值-空白 组A值)]/(对照组A值-空白组A值)X100%。结果见表1表1没食子提取物对人结肠癌HT-29细胞增殖的抑制作用(7 ± ，η = 12)美国Gibeo公司产品 上海生化与细胞生物学研究所 杭州四季青生物工程材料研究所 北京化工厂美国Amresco公司产品 美国Sigma公司产品THEMOR THEMOR 沈阳龙腾 西门子
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本发明涉及一种没食子提取物在制备抑制结肠癌细胞增殖的药物中的用途，本发明以人结肠癌HT-29细胞为实验载体，采用MTT、流式细胞术等实验方法，从癌细胞增殖和凋亡角度阐述没食子提取物对人结肠癌HT-29细胞的作用特点，通过抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡的方式，抑制结肠癌细胞的生长，这种作用具有浓度-效应依赖性关系。从分子生物学水平上揭示了没食子提取物的抗结肠癌作用部位即新靶点，为结肠癌的防治提供新的天然药物。