一种构建工程化脂肪的方法[0002]构建工程化脂肪有多种方式，成功构建工程化脂肪取决于四个因素:种子细胞、支架、细胞因子、微环境，该四因素可组成多种方案。目前，国内外均着重于支架的改造，通过各种方式将壳聚糖、胶原、透明质酸钠、明胶、丝素蛋白组合来寻找理想的支架，通过支架的改进来构建工程化脂肪。
[0003]本发明的目的在于提供一种构建工程化脂肪的方法，以解决上述的问题。[0004]在本发明的实施例中提供了一种构建工程化脂肪的方法，包括以下步骤:[0005](a)构建携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒；[0006](b)将所 述携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞，得到转染人胰岛素的人脐带间充质干细胞；[0007](C)将所述转染人胰岛素的人脐带间充质干细胞与支架复合培养，得到人脐带间充质干细胞-支架复合物；
[0008](d)将所述人脐带间充质干细胞-支架复合物移植到体内。
[0009]优选地，在所述步骤(a)中，所述构建携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒包括以下步骤:
[0010]合成人胰岛素基因序列，对其扩增后测序；
[0011]将测序正确的人胰岛素基因与pLenti6.3-1RES-EGFP载体连接，得到慢病毒表达载体 pLenti6.3-1nsulin-1RES-EGFP ；
[0012]将所述慢病毒表达载体pLenti6.3-1nsulin-1RES-EGFP转入DH5 α感受态细胞，筛选出阳性克隆体；
[0013]对所述阳性克隆体进行培养繁殖，提取阳性克隆体的质粒；
[0014]将所述阳性克隆体的质粒转染至细胞293Τ，得到携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒。
[0015]优选地，在所述步骤(b)中，将所述携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞前，检测所述人脐带间充质干细胞表面抗原，所述表面抗原包括CD13、CD14、CD34、CD44 及 CD3。
[0016]优选地，在所述步骤(b)中，将所述携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞前，检测人脐带间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的能力。
[0017]优选地，所述检测人脐带间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的能力采用观察脂肪滴形成的情况进行鉴定。
[0018]优选地，在所述步骤(b)中，将所述携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞前，检测人脐带间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的能力。
[0019]优选地，在所述步骤(b)中，将所述携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞具体为:
[0020]将不同感染复数的慢病毒颗粒感染293T细胞，筛选出最适感染复数；
[0021]将人脐带间充质干细胞以4-6 X IO5个/孔接种于6孔培养板中，培养8_16h，在LG-DMEM培养基中加入终浓度为7-9mg/L的聚凝胺后，加入最适感染复数的慢病毒颗粒；
[0022]所述慢病毒颗粒加入5_7h后，将所述LG-DMEM培养基更换为不含聚凝胺的LG-DMEM培养基，然后放置在36-38°C、体积分数4.5-5.5% CO2的培养箱中培养；所述慢病毒颗粒加入70-75h后收集细胞，得到携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞。
[0023]优选地，在所述步骤(C)中，所述支架为丝素蛋白支架、透明质酸衍生酯海绵支架和聚乳酸一聚乙醇酸共聚物支架中的任一种。
[0024]优选地，在所述步骤(C)中，在所述复合培养前，将所述支架剪切成
0.9-1.1cmX0.9-1.1cmX0.15-0.25cm大小，置于蒸馏水中，用Y射线灭菌，辐射剂量为IOkGy ；
[0025]将灭菌后的所述支架在超净台内用LG-DMEM细胞培养液浸泡24h，更换培养液2_4次，得到处理后的支架。
[0026]优选地，所述步骤(C)具体为:取所述转染人胰岛素的人脐带间充质干细胞的细胞浓度为2-5 X IO6个/ml的细胞悬液100 μ 1，滴在所述支架上，然后放置于36-38°C CO2恒温培养箱内3-4h ;添加LG-DMEM培养基完全淹没细胞和所述支架，置于36_38°C CO2恒温培养箱内培养，22-26h后更换为成脂诱导剂，培养5-7d，得到所述人脐带间充质干细胞-支架复合物。
[0027]本发明实施例提供的构建工程化脂肪的方法，是将胰岛素基因转入人脐带间充质干细胞后与支架复合培养，得到的人脐带间充质干细胞-支架复合物移植到体内来完成构建工程化脂肪。其中，人脐带间充质干细胞具有诱导分化的能力，其携带的人胰岛素基因可在体内持续表达，使人脐带间充质干细胞在分化过程中，有胰岛素的持续表达从而来促进成脂。



[0028]图1示出了本发明实施例2重组慢病毒颗粒转染至293T包装细胞后的显微镜观察图；
[0029]图2示出了本发明实施例3成脂诱导14天油红O染色的显微镜观察图；
[0030]图3示出了本发明实施例3成骨诱导14天茜素红染色的显微镜观察图；
[0031]图4示出了本发明实施例4重组慢病毒颗粒在293T细胞中的包装的显微镜观察图；
[0032]图5示出了本发明实施例4不同转染复数值重组慢病毒颗粒载体转染人脐带间充质干细胞的显微镜观察图；
[0033]图6示出了本发明实施例5中的对照组和转染组的人胰岛素表达状况；
[0034] 图7示出了本发明实施例5中的丝素蛋白支架的扫描电镜图；[0035]图8示出了本发明实施例5中扫描电镜观察玻片图；
[0036]图9示出了本发明实施例5中苏木精-伊红染色后显微镜下观察玻片图；
[0037]图10示出了本发明实施例5中油红O染色后显微镜下观察玻片图；
[0038]图11示出了本发明实施例5中荧光原位杂交检测标本中的性染色体荧光原位杂交图。

[0039]下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。
[0040]实施例1
[0041]本发明实施例中提供了一种构建工程化脂肪的方法，包括以下步骤:
[0042](a)构建携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒；
[0043](b)将所述携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞，得到转染人胰岛素的人脐带间充质干细胞；
[0044](C)将所述转染人胰岛素的人脐带间充质干细胞与支架复合培养，得到人脐带间充质干细胞-支架复合物；
[0045](d)将所述人脐带间充质干细胞-支架复合物移植到体内。
[0046]本发明实施例提供的构建工程化脂肪的方法，是将胰岛素基因转入人脐带间充质干细胞后与支架复合培养，得到的人脐带间充质干细胞-支架复合物移植到体内来完成构建工程化脂肪。其中，人脐带间充质干细胞具有诱导分化的能力，其携带的人胰岛素基因可在体内持续表达，使人脐带间充质干细胞在分化过程中，有胰岛素的持续表达从而来促进成脂。
[0047]实施例2
[0048]携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒的构建
[0049]登陆Genebank查询人胰岛素基因(Genebank N0.NM000207)。根据文献设计人胰岛素基因cDNA的特异突变序列，由美国Invitrogen公司进行全基因合成,得到人胰岛素基因，其序列为: