专利名称：人stim1基因的用途及其相关药物的制作方法RNA干扰(RNA interference, RNAi)利用双链RNA介导序列特异性的转录后基因沉默，已成为研究基因功能的一种新兴的有效手段，并有望成为肿瘤等疾病基因治疗的工具(Izquierdo M. Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy. Cancer Gene Ther. 2005 ； 12 (3) :217-27.)。慢病毒(Ientivirus)载体是高效的基因转导工具，较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，可将外源的发夹结构RNA(short hairpin RNA, shRNA) 序列稳定导入非周期性和有丝分裂后的细胞。shRNA在细胞内会自动被加工成为小干扰 RNA (small interferingRNA, si RNA)，引起具有相同序列的mRNA发生降解。由于慢病毒载体具有具有携带基因片段容量大、转染效率高、不易诱发宿主免疫反应等优点，已被广泛应用于基因治疗、疫苗生产以及科学研究等领域(Sinn PL, Sauter SL,McCray PB. Gene therapy progress and prospects :development of improved lentiviral and retroviral vectors-design, biosafety, and production. Gene Ther 2005 ； 12 1089-98.)。内质网的钙离子信号参与很多重要生理活动，如基因转录、细胞凋亡等，并在肿瘤发展和进程中发挥重要作用(Feng M，Grice DM，Faddy HM, Nguyen N，Leitch S， Wang Y，Muend S，Kenny PA, Sukumar S，Roberts-Thomson SJ, Monteith GR, Rao R. Store-independent activation of Orai 1 by SPCA2 in mammary tumors. Cell. 2010 ； 143(1) :84-98.)。因此调节钙离子进入细胞的精确反馈机制至关重要。基质相互作用分子 l(stromal interaction molecule 1, STIM1)编码分子量约为77KDa的I型膜蛋白，主要定位在内质网膜上Oiang SL, Yu Y，Roos J，Kozak JA, Deerinck TJ, Ellisman MH, Stauderman KA, Cahalan MD. STIMl is a Ca2+sensor that activates CRAC channels and migrates from the Ca2+store to the plasma membrane. Nature. 2005 ；437 (7060) :902-5.)，少量分布于细胞膜上(Manji SS, Parker NJ, Williams RT, van Stekelenburg L, Pearson RB, Dziadek M, Smith PJ. STIMl :a novel phosphoprotein located at the cell surface. Biochim Biophys Acta. 2000 ； 1481(1) :147-55. )。STIMl被认为是哺乳动物细胞的内质网膜钙离子感受器(Liou J， Kim ML, Heo WD, Jones JT, Myers Jff, Ferrell JE Jr, Meyer Τ. STIM is a Ca2+sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+influx.Curr Biol.2005 ； 15(13) :1235-41. Roos J, DiGregorio PJ, Yeromin AV, Ohlsen K, Lioudyno M, Zhang S, Safrina 0, Kozak JA, Wagner SL, Cahalan MD, Velicelebi G, Stauderman KA. STIMl, an essential and conserved component of store-operated Ca2+channel function. J Cell Biol. 2005 ；169 (3) :435-45.)。当细胞内钙内存被损耗时，STIMl能感受到内质网内钙离子的损耗并向细胞膜方向移动，激活Orail从而形成钙池操纵的钙通道(store-operated calciumchannel, S0C)，介导细胞夕卜 丐离子的进入(Hewavitharana T, Deng X，SoboloffJ,Gill DL. Role of STIM and Orai proteins in the store-operated calcium signaling pathway. Cell Calcium. 2007 ；42 (2) :173-82.)。 人染色体11ρ15区域聚集着大量的抑癌基因，该区域的缺失与肾母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肾上腺癌、肝母细胞瘤、膀胱癌、肺癌、卵巢癌及睾丸癌的发生密切相关(Zhao B， Bepler G. Transcript map and complete genomic sequence for the 310 kb region of minimal allele loss on chromosome segment 1 lpl5.5 in non—small_cel1 lung cancer. Oncogene.2001 ；20(56) :8154-64. Parker NJ, Begley CG, Smith PJ, Fox RM. Molecular cloning of a novel human gene(D11S4896E)at chromosomal region llpl5. 5. Genomics. 1996 ；37 (2) :253-6. Williams RT，Manji SS，Parker NJ，Hancock MS， Van Stekelenburg L，Eid JP，Senior PV，Kazenwadel JS，Shandala T，Saint R，Smith PJ, Dziadek MA. Identification and characterization of the STIM(stromal interaction molecule)gene family :coding for a novel class of transmembrane proteins. Biochem J. 2001 ;357 (Pt3) :673-85.)。而 STIMl 基因恰好位于 llpl5. 5 区域，因此该基因在肿瘤中的调控功能格外引人注目。然而，在不同的肿瘤细胞株中，STIMl可能引起不同的生物学效应。研究发现STIMl在横纹肌肉瘤细胞系和横纹肌样瘤细胞系中低表达或者不表达，过表达 STIMl 可导致细胞生长阻滞(Sabbioni S, Barbanti-Brodano G，Croce CM, Negrini Μ· GOK :a gene at llpl5involved in rhabdomyosarcoma and rhabdoid tumor development. Cancer Res. 1997 ；57 (20) :4493-7. Sabbioni S，Veronese A，Trubia M， Taramelli R,Barbanti-Brodano G，Croce CM，Negrini M. Exon structure and promoter identification of STIMl(alias GOK)， a human gene causing growth arrest of the human tumor cell lines G401 and RD. Cytogenet Cell Genet. 1999 ；86 (3-4) :214-8.)， 提示STIMl作为一个重要的抑癌基因，在横纹肌肉瘤发生和发展中发挥作用。在内皮细胞中降低该基因的表达后，细胞内的钙离子浓度降低，细胞周期发生改变，从而使细胞增殖减 ■ (Abdullaev IF, Bisaillon JM, Potier M， Gonzalez JC, Motiani RK, Trebak Μ. Stim land Orai lmediate CRAC currents and store-operated calcium entry important for endothelial cell proliferation. Circ Res. 2008 ;103 (11) : 1289-99.)；也有报道表明内皮细胞中该基因的高表达，会促进细胞的凋亡(Chiu WT，Tmg MJ，Jao HC，Shen MR. Soft substrateup-regulates the interaction of STIMl with store-operated Ca2+channels that lead to normal epithelial cell apoptosis. Mol Biol Cell. 2008 ； 19(5) :2220-30.)。此外，还发现STIMl与在恶性肿瘤的转移有关。在乳腺癌细胞中通过阻断STMl和Orail这两个基因可以抑制肿瘤血管的生成，抑制肿瘤细胞扩散和转移 (Yang S, Zhang JJ, Huang XY. Orail and STIMl are critical for breast tumor cell migration and metastasis. Cancer Cell. 2009 ；15 (2) :124-34.)。在宫颈癌中 STIMl 表达降低抑制宫颈癌细胞增生，使细胞周期停留在G2/M期；在重度免疫缺失小鼠中皮下注射不同STIMl表达水平的宫颈癌细胞株，发现高表达STIMl的细胞株促进肿瘤生成及增加血管密度，而低表达STIMl的细胞株则延迟肿瘤生长并降低血管密度；在子宫颈癌临床样本中STIMl过表达，STIMl的表达水平与肿瘤大小、骨盆淋巴结转移这两个不良预后因素呈正相关性(沈孟儒.基质交互分子(STIMl)对癌细胞增生及转移的重要性。成大研发快讯， 第十六卷第一期)。另外，在胶质瘤组织中也检测到STIMl基因的高表达(Scrideli CA,Carlotti CG Jr，0kamoto OKiAndrade VSiCortez MAiMotta FJ,Lucio-Eterovic AKiNeder L，Rosemberg S，Oba—Shinjo SM, Marie SK, Tone LG. Gene expression profileanalysis of primary glioblastomas and non—neoplastic brain tissue -identification of potential targetgenes by oligonucleotide microarray and real-time quantitative PCR. J Neurooncol. 2008 ；88 (3) :281-91.)。此外，已经有文献报道 STIMl 的 SiRNA 能够抑制人 MDA-MB-231 乳腺癌细胞的增长和转移。(Ymg SY, Zhang JL, Huang XY. Orail and STIMl Are Critical for Breast Tumor Cell Migration and Metastasis，Cancer Cell， 2009 ；15 (2) :124-134))综上所述，STIMl在肿瘤进程中发挥着具有重要的角色，但关于该基因在除胶质瘤、宫颈癌和乳腺癌外其他肿瘤细胞增殖中的功能研究尚无深入报道。
本发明的目的在于公开与人STIMl基因相关的治疗方法及药物。为了深入研究 STIMl在肿瘤发生中的调节功能，本发明选取人肺癌H1299细胞、肝癌SMMC-7721细胞、乳腺癌MCF-7细胞、前列腺癌PC-3细胞和胰腺癌Panc-I细胞为模型，以RNAi为手段研究STIMl 在上述肿瘤细胞的存活和凋亡命运中的作用。本发明第一方面，公开了将人STIMl基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物，或者将人STIMl基因用于制备肿瘤诊断药物。人STIMl基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容其一，将人STIMl 基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将人STIMl基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。所述将人STIMl基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标具体是指将人 STIMl基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞产生RNA干扰作用的靶标，从而能降低肿瘤细胞人STIMl基因的表达水平。所述将人STIMl基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指将人STIMl基因作为作用对象对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人STIMl基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如之后所述的人STIMl 基因小分子干扰RNA即是以人STIMl基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。诸如抗体药物，小分子药物等也可将STIMl基因作为作用对象。所述将人STIMl基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将人STIMl基因表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。所述的肿瘤可以为其肿瘤细胞的增殖与人STIMl基因的表达相关的任一种肿瘤， 更进一步的，为一种恶性肿瘤，例如选自肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌所述肿瘤治疗药物可以为小分子化学药，抗体药，也可以为核酸类药物。进一步的，所述肿瘤治疗药物能降低人STIMl基因的表达水平从而抑制肿瘤细胞的增殖。采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过降低人STIMl基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗目的的。具体的，治疗时，将能有效降低人STIMl基因表达水平的物质给药于患者。进一步的，所述的能有效降低人STIMl基因表达水平的物质，包括能够特异性沉默人STIMl基因表达的小分子干扰RNA(siRNA)。该小分子干扰RNA(siRNA)可以起到特异性沉默肿瘤细胞中内源STIMl基因的表达的作用。进一步的，所述小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO :1巧4之任一的序列作为特异性沉默人STIMl基因表达的靶点序列。所述小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO 1-54之任一的序列作为特异性沉默人 STIMl基因表达的靶点序列是指该小分子干扰RNA能与SEQ ID NO :1巧4中的任一种序列所编码的mRNA片段特异性结合，并特异性沉默人STIMl基因的表达。进一步的，所述能够特异性沉默人STIMl基因表达的小分子干扰RNA (SiRNA)经由慢病毒载体表达。具体而言，这个过程包括将编码所述人STIMl基因小分子干扰RNA的 DNA片段克隆入慢病毒载体获得人STIMl基因干扰慢病毒载体，进而利用该人STIMl基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞并最终表达所述 SiRNA0人STIMl基因干扰慢病毒载体为将编码所述人STIMl基因小分子干扰RNA的DNA 片段克隆入慢病毒载体后获得，能产生人STIMl基因小分子干扰RNA。进一步的，所述的慢病毒载体可选自pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.I-CMV-Neo, pLKO.l_Neo、 pLKO.l-Neo-CMV_tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV_TagYFP、pLKO. l-puro-CMV_TagRFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC_TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、ρ LP U pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5_GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一种慢病毒载体，本发明实施例具体列举了以PGCSIL-GFP为载体。慢病毒载体可在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒。本发明第二方面，公开了一种分离的人STIMl基因小分子干扰RNA (SiRNA)靶标片段，其序列为SEQ ID NO :1-54中任意一条序列。所述分离的人STIMl基因小分子干扰RNA(SiRNA)靶标片段可应用于人STIMl基因小分子干扰RNA的筛选与制备。本发明第三方面，公开了一种人STIMl基因小分子干扰RNA(SiRNA)，能够特异性沉默人STIMl基因的表达。所述人STIMl基因小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO 1-54之任一的序列作为特异性沉默人STIMl基因表达的靶点序列。进一步的，所述人STIMl基因小分子干扰RNA包含正义RNA片段和反义RNA片段， 所述正义RNA片段和所述反义RNA片段互补，所述正义RNA片段含有SEQ ID中之任一序列编码的RNA。所述正义RNA片段和反义RNA片段存在于两条不同的RNA链上或者存在于同一条 RNA链上。所述正义RNA片段和反义RNA片段的长度均为15_27个核苷酸；较佳的，长度均为 19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。进一步的，所述人STIMl基因小分子干扰RNA为发夹型单链RNA，包括正义RNA片段、茎环片段和反义RNA片段，正义RNA片段和反义RNA片段中间由茎环片段分隔；其中，正义RNA片段和反义RNA片段互补，正义RNA片段的序列选自SEQ ID NO 1-54之任一。所述茎环片段结构包括6个或9个碱基。进一步的所述茎环片段的序列选自以下任一 UUCAAGAGA、AUG、CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU、CCACACC。本发明具体列举了以 UUCAAGAGA 为茎环。如实施例列举的，所述人STIMl基因小分子干扰RNA的序列为SEQ ID NO 55 :(XU GGAUGAUGUAGAUCAUAAUUCAAGAGAUUAUGAUCUACAUCAUCCAGG。本发明第四方面，公开了一种人STIMl基因干扰核酸构建体，包含编码前述人 STIMl基因小分子干扰RNA的基因片段，能表达前述人STIMl基因小分子干扰RNA。所述的人STIMl基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人STIMl基因小分子干扰 RNA的基因片段克隆入已知载体获得。进一步的，所述人STIMl基因干扰核酸构建体为人STIMl基因干扰慢病毒载体，为将编码所述人STIMl基因小分子干扰RNA的基因片段克隆入慢病毒载体后获得，能产生人 STIMl基因小分子干扰RNA。所述慢病毒载体可以选自pLK0.1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.I-CMV-Neo, pLKO.l_Neo、 pLKO.l-Neo-CMV_tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV_TagYFP、pLKO. l-puro-CMV_TagRFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC_TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、ρ LP U pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5_GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人STIMl基因干扰核酸构建体,命名为 pGCSIL-GFP-STIMl-shRNA。进一步的，编码所述人STIMl基因小分子干扰RNA的基因片段的序列含有SEQ ID NO 1-54中之任一序列及其互补序列。本发明的人STIMl基因小分子干扰RNA可用于抑制肿瘤细胞的增殖，进一步地可以用作治疗或诊断肿瘤的药物或制剂。人STIMl基因干扰核酸构建体则可用于制备所述人 STIMl基因小分子干扰RNA。当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的人STIMl基因小分子干扰 RNA施用于哺乳动物。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明第五方面，公开了一种人STIMl基因干扰慢病毒，由前述人STIMl基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生人STIMl基因小分子干扰RNA，从而抑制肿瘤细胞的增殖。本发明第六方面，还公开了一种药物组合物，含有治疗有效量的人STIMl基因小分子干扰RNA或人STIMl基因干扰慢病毒。进一步的，所述药物组合物含有1 99wt%如前所述的人STIMl基因小分子干扰 RNA或人STIMl基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括湿润剂、乳化剂、防腐剂 (如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。综上所述，本发明设计了针对人STIMl基因的M个RNAi靶点序列，构建相应的 STIMlRNAi 载体，其中编码序列 SEQ ID NO 40 的 RNAi 载体 pGCSIL-GFP_STIMl_shRNA 能够显著下调STIMl基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv) 作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-GFP-STIMl-shRNA能够靶向地将针对STIMl基因的RNAi序列高效导入人肺癌H1299细胞、肝癌SMMC-7721细胞、乳腺癌MCF-7细胞、前列腺癌PC-3细胞和胰腺癌Panc-I细胞，降低STIMl基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的STIMl基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。本发明提供的SiRNA或者包含该SiRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人STIMl基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中 STIMl基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要眉、ο
图1表示pGCSIL-GFP质粒DNA图谱图2表示表示STIMlshRNA慢病毒侵染5天后，人肺癌H1299细胞、肝癌SMMC-7721 细胞、乳腺癌MCF-7细胞和前列腺癌PC-3细胞中的STIMl mRNA的表达水平降低图3表示STIMl shRNA慢病毒侵染5天后，人肺癌H1299细胞的增殖能力被抑制图4表示STIMl shRNA慢病毒侵染5天后，人肝癌SMMC-7721细胞的增殖能力被抑制图5表示STIMl shRNA慢病毒侵染5天后，人乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力被抑制图6表示STIMl shRNA慢病毒侵染5天后，人前列腺癌PC_3细胞的增殖能力被抑制图7表示STIMl shRNA慢病毒侵染5天后，人胰腺癌Panc-I细胞的增殖能力被抑制图8使用STIMl抗体在肿瘤组织样本上的免疫组化检测结果.a为乳腺癌，b、c为肺癌，d为胰腺癌



本发明公开了人STIM1基因的用途及其相关药物。本发明公开了人STIM1基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途。本发明还进一步构建了人STIM1基因小分子干扰RNA、人STIM1基因干扰核酸构建体、人STIM1基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人STIM1基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中STIM1基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。