发明的详细描述已经开发出利用现代聚合树脂的新的纯化方法，该树脂为刚性的(rigid)并且耐受原位苛刻清洗过程，包括1M NaOH或醋酸。而且，对于生产规模的有效方法，这些树脂有高结合容量并允许高的流率。不使用具有潜在可泄漏配体(如凝集素或染料)由此可能对患者造成问题的树脂。
所实施的纯化步骤有不同的选择性，从而产生具有低量来源于宿主细胞的蛋白质或DNA的非常纯产物。而且，在根据这里概述的本发明纯化方法中，几个、优选至少3个层析步骤有分离单独的同种型的潜力。特别地，在合并第二阴离子交换层析步骤(即，步骤(e)，参见下文)的级分及通过最后凝胶过滤层析进一步处理前可以通过CZE(毛细管区带电泳)进行分析。此外，或者备选地，可以通过CZE(毛细管区带电泳)分析反相层析步骤(即步骤(d)，参见下文)的级分，并且相应地处理该级分。另一种可能性是用第一次阴离子交换层析(即步骤(c)，参见下文)获得的级分进行(备选地或额外地)CZE(毛细管区带电泳)。利用CZE(毛细管区带电泳)，可以将在所分析级分中含有的同种型混合物或组合物形式的糖基化蛋白质或多肽分离为特定的同种型。通过和已知同种型标准比较，特别是比较糖基化模式，例如唾液酸化模式，可以确定通过CZE(毛细管区带电泳)分离的每个同种型的特定结构。在本发明上下文中，这导致具有确定的高糖基化同种型组成的合并级分，而不依赖于来源的质量。更一般而言，在本发明的过程中，确立了CZE(毛细管区带电泳)是独立于蛋白质或多肽本身的属性而生产包含蛋白质或多肽的糖基化同种型的蛋白质性组合物时的有价值工具。因此，本发明提供了CZE(毛细管区带电泳)作为分析工具在具有确定的同种型组成的糖基化蛋白质或多肽的生产中的用途。特别地，该用途可以有利地应用在具有确定同种型组成的重组人红细胞生成素的生产中。因此，本发明包括具有确定同种型组成的糖基化蛋白质或多肽，特别是重组人红细胞生成素的生产方法，所述方法包括利用CZE(毛细管区带电泳)分析包含糖基化蛋白质或多肽的一种或多种同种型的样品(其可以是层析纯化步骤的级分)，并且，当期望时合并含有该糖基化蛋白质或多肽的期望同种型的样品，特别地，其中所述糖基化蛋白质或多肽的同种型是重组人红细胞生成素的同种型。
而且，可以设计本方法，通过降低剪切应力和细胞裂解在最初分离期间仅仅释放非常低量的细胞蛋白酶，并且利用残余蛋白酶没有活性和对产物无害的条件。这可以通过如下方式达到首先，通过密闭设计的盘叠式离心机(disc stack centrifage)进行细胞分离以保持细胞完整，其次，利用在中性pH工作的阴离子交换层析实施捕获步骤。低于6的pH将引起内源低pH活性蛋白酶的切割作用。
最后，此下游处理(DSP)顺序中的几个步骤在病毒除去和/或病毒失活方面是有力的。对于哺乳动物细胞来源的治疗剂而言，因为不能排除病毒污染，这是重要的要求。实施的纳米过滤(nanofiltration)特别有助于除去甚至非常小的无包膜病毒，如细小病毒。反相层析期间和/或之后的溶剂暴露是另一个引起包膜病毒失活的有效步骤。
因此，本发明提供了从包含宿主细胞的细胞培养基回收和纯化重组人红细胞生成素(rhEpo)的方法，该方法包括步骤(a)通过选自(i)离心后深度过滤步骤，(ii)深度过滤步骤，和(iii)离心步骤的方法，从细胞培养基除去宿主细胞、细胞成分和碎片以获得澄清的培养基上清液；(b)调节上清液的电导率到5mS/cm或以下，并调节pH至约7.0到8.0之间；(c)将步骤(b)得到的上清液施加到包含阴离子交换层析介质的柱上，洗柱子，从柱上洗脱重组人红细胞生成素(rhEpo)，收集含有重组人红细胞生成素(rhEpo)的峰级分；(d)利用树脂，将合并的步骤(c)得到的峰级分进行反相层析步骤，该树脂可以在中等压力(＜10bar)下运行并且可以抵抗高浓度的NaOH，利用有机溶剂的线性梯度洗脱重组人红细胞生成素(rhEpo)；(e)将步骤(d)中洗脱的一个或多个含有重组人红细胞生成素(rhEpo)的级分施加到包含阴离子交换层析介质的柱上，洗柱子，利用线性盐梯度洗脱重组人红细胞生成素(rhEpo)；(f)根据重组人红细胞生成素(rhEpo)的唾液酸化程度，选择步骤(e)中洗脱的一个或多个含有重组人红细胞生成素(rhEpo)的级分；和(g)利用凝胶过滤介质，将步骤(f)中一个或多个洗脱的含有重组人红细胞生成素(rhEpo)的级分进行一个或多个大小排阻层析步骤以除去潜在的二聚体和更大的聚集体；收集含有重组人红细胞生成素(rhEpo)的洗脱物。
优选地，利用盘叠式分离器进行步骤(a)中的离心。
在优选实施方式中，在步骤(b)中将电导率调节到2至5mS/cm之间，优选达到约3mS/cm。
有利地，用在步骤(c)中的阴离子交换介质是基于陶瓷的离子交换介质Q-HyperD FTM，可从BioSepra获得。有利地，用在步骤(d)中的树脂是可以抗约0.5M NaOH浓度的树脂；优选地其是聚苯乙烯树脂，有利地其是Source 30RPCTM(可从Amersham Biosciences获得)，而用在步骤(e)中的阴离子交换介质优选琼脂糖凝胶(Sepharose)阴离子交换层析介质，有利地它是Q Sepharose High PerformanceTM(可从AmershamBiosciences获得)。用在步骤(g)中的凝胶过滤介质优选Superdex 75 prepgradeTM(可从Amersham Biosciences获得)。
在优选实施方式中，在步骤(d)前，步骤(c)的峰级分(优选地，可以合并)进行硫酸铵沉淀步骤以沉淀污染的宿主细胞蛋白质，然后将上清液的硫酸铵浓度调到与步骤(d)相容的浓度。在向步骤(d)的反相柱上样前，优选地，该浓度小于0.24M硫酸铵。
通常，在步骤(b)中调节pH到约pH7.5。优选地，用适合的含有盐，如NaCl的含水缓冲液，例如Tris缓冲液进行步骤(c)中的洗涤。在优选实施方式中，利用20mM pH7.5含有50mM NaCl的Tris缓冲液。类似地，用适合的含有盐，如NaCl的含水缓冲液，例如Tris缓冲液进行洗脱。通常利用有100mM至1M，特别是大于125mM，优选150mM盐浓度的缓冲液进行步骤(c)中的洗脱步骤。在优选实施方式中，在该洗脱步骤中利用20mM pH7.5含有150mM NaCl的Tris缓冲液。优选地，步骤(d)中的有机溶剂选自乙腈、乙醇和己二醇(即，2-甲基-2，4-戊二醇)，最优选是乙腈。优选地，在将包含红细胞生成素的级分施行反相层析前，用含有有机溶剂，优选乙腈的含水缓冲液，如20mM Tris/HCl，pH7.0，稀释级分。在将稀释的级分加到反相柱上后，优选地，用含有有机溶剂，优选乙腈的含水缓冲液，如20mM Tris/HCl，pH7.0，洗涤柱子。优选地，利用约10％到约100％的有机溶剂线性梯度在步骤(d)中洗脱红细胞生成素(Epo)多肽。在其特别优选的实施方式中，在步骤(d)中，通常利用约25％到50％的乙腈线性梯度进行洗脱。步骤(e)中线性盐梯度通常为0到300mM。优选地，步骤(c)和(e)中的盐是NaCl。
在本发明一个实施方式中，用适合的含水缓冲液稀释步骤(d)中洗脱的含有有机溶剂，优选乙腈的级分，该缓冲液与下面的阴离子交换层析步骤相容。为了失活病毒污染物，在步骤(e)前，放置稀释的级分一段适合的时间，该段时间将足以达到这种期望的病毒污染物失活效果。例如，可以用0.5倍体积的含水缓冲液(特别是20mM Tris/HCl，pH7.0)稀释该级分，温育至少约20分钟到约40分钟，或者甚至更长，然后用级分原始体积的3.5倍体积的含水缓冲液进一步稀释。
在本发明优选实施方式中，在步骤(a)中方法(i)，(ii)和(iii)之任一后是无菌过滤步骤。通常地，通过利用0.2μm过滤装置进行该无菌过滤步骤。
在本发明进一步实施方式中，在本发明方法中，来源于层析柱的级分可以进行超滤步骤，特别是用于浓缩。因此，在优选实施方式中，在步骤(g)中，在大小排阻层析步骤前对级分进行超滤步骤。在另一个优选实施方式中，在步骤(d)中，在反相层析前，对级分进行超滤步骤。在类似的优选实施方式中，如果本发明的方法包括如上所述的硫酸铵沉淀步骤，那么在该硫酸铵沉淀步骤前，对来自步骤(c)的单个或合并的峰级分进行超滤步骤。优选地，本发明方法利用这里提到的所有三个超滤步骤。例如，具有5kDa至10kDa截断值，例如10kDa，优选5kDa截断值的膜可以用在该超滤方法中。
在优选的实施方式中，在步骤(g)前或优选地在步骤(g)后，包括死端(dead-end)纳米过滤步骤以除去病毒。装置的例子包括Planova 15N(Asahi)，PALL Ultipor VF Grade DV20或Millipore Viresolve NFP柱体或囊。
如上所述，可能期望在纯化步骤期间能筛选优选的同种型，而利用本发明的纯化方法可以达到该目的。具体地，因为不同的同种型会在反相层析步骤和第二个阴离子交换层析步骤期间解析，所以能达到该目的。通过毛细管区带电泳作为生产过程中的控制手段可以测定不同级分的内容物，并在适合时合并或弃去选定级分。在本发明优选的实施方式中，如上所概述，利用毛细管区带电泳进行如上所述步骤(f)中的一个或多个筛选或步骤(d)和步骤(e)间的一个或多个筛选。
在本发明上下文中，这里所述优选或特定的实施方式可以彼此组合，由此产生其进一步的优选的实施方式。
因此，在优选的实施方式中，本发明提供了从收获的细胞培养物回收和纯化重组人红细胞生成素(rhEpo)的方法，该方法包括步骤(a)收获细胞培养物，通过进行选自(i)利用盘叠式分离器的离心及随后的深度过滤步骤，(ii)深度过滤步骤，和(iii)离心步骤的方法，接着通过0.2μm过滤步骤，从培养基除去宿主细胞、细胞成分和碎片，以获得澄清的培养基上清液；和(b)调节上清液的电导率到5mS/cm或以下，并调节pH至约7.0到8.0之间；(c)将步骤(b)得到的上清液施加到用Q-HyperD F填装的阴离子交换柱上，洗柱子，从柱上洗脱重组人红细胞生成素(rhEpo)，收集含有重组人红细胞生成素(rhEpo)的峰级分；(d)利用聚苯乙烯树脂，将步骤(c)得到的合并峰级分进行反相层析步骤，该树脂可以在中等压力(＜10bar)下运行并且可以抵抗NaOH CIP条件，如Source 30RPC，利用乙腈线性梯度洗脱重组人红细胞生成素(rhEpo)；和(e)根据重组人红细胞生成素(rhEpo)的唾液酸化程度，选择步骤(d)中洗脱的一个或多个含有重组人红细胞生成素(rhEpo)的级分，将所述级分施加到用Q-Sepharose HP填装的高效阴离子交换柱上，洗柱子，利用线性盐梯度洗脱重组人红细胞生成素(rhEpo)；(f)根据重组人红细胞生成素(rhEpo)的唾液酸化程度，选择步骤(e)中洗脱的一个或多个含有重组人红细胞生成素(rhEpo)的级分，利用Superdex 75 prep grade对所述级分进行大小排阻层析以除去潜在的二聚体和更大的聚集体；收集含有重组人红细胞生成素(rhEpo)的洗脱物。
优选地，通过毛细管区带电泳确定分别在步骤(d)和步骤(e)中获得的哪一个或多个级分可以被选择分别在步骤(e)和/或步骤(f)中用于进一步层析纯化。作为指导，已证实RPC步骤中重组人红细胞生成素(rhEpo)较高的糖基化形式存在于洗脱峰的前半部分中，而在Q-Sepharose HP步骤中，高度糖基化和唾液酸化同种型存在于洗脱峰的后半部分中。如上所述，在优选实施方式中，在步骤(d)前，对来自步骤(c)的合并峰级分进行硫酸铵沉淀步骤以沉淀污染的宿主细胞蛋白质，然后调整上清液的硫酸铵浓度以和步骤(d)相容。优选地，所述浓度小于0.24M硫酸铵。在本发明上下文中同样优选地，本发明优选的方法进一步包括在步骤(f)前，优选在步骤(f)后进行死端纳米过滤步骤以除去病毒。
关于用于纯化方法的来源材料，优选在无血清培养基中培养宿主细胞。也优选利用不连续补料分批发酵方法培养宿主细胞。特别地，宿主细胞具有表达重组人红细胞生成素和将红细胞生成素分泌到培养基中的能力。通常宿主细胞是哺乳动物细胞。优选的宿主细胞是CHO细胞。
本发明也提供了包含本发明方法产生的纯化重组人红细胞生成素的组合物。本发明进一步提供了可以通过本发明方法获得的纯化重组人红细胞生成素和包含所述纯化红细胞生成素的组合物，特别是药物组合物。
优选地，组合物有确定含量的重组人红细胞生成素(rhEpo)糖基化/唾液酸化同种型。因为不同的同种型会在反相层析步骤和第二个阴离子交换层析步骤期间解析，所以可以达到该目的。通过毛细管区带电泳作为生产过程的控制手段可以测定不同级分的内容物，并在适合时合并或弃去选定的级分。特别地，从RPC步骤合并第一半洗脱峰，因为该处是较高糖基化形式存在的地方。相反地，Q Sepharose HP步骤中的第二半洗脱峰通常含有高度糖基化和唾液酸化的同种型。
优选地，在包含利用本发明方法表达和纯化的重组多肽，特别是红细胞生成素(Epo)的组合物中，重组多肽基本是纯的，如至少90％，95％，99％或99.5％的纯度。
可以体外和/或体内测定纯化的蛋白质的生物学活性。在Hammering等，1996，J Pharm Biomed Anal 14(11)1455-69中描述了适宜的体外测定法，该方法包括测定类红细胞系的增殖刺激。在Ghanem等，1994，同上引文中描述了合适的体内测定法，该方法包括测定红细胞增多症小鼠的红细胞中掺入的59Fe。
在一个优选方面，可以联合核酸载体和宿主细胞进行本发明，其中，(a)第一多核苷酸载体包含(i)编码重组目的多肽的第一核苷酸序列；和(ii)编码选择标记的第二核苷酸序列，当宿主细胞与选择试剂接触时第二核苷酸序列扩增，和(b)第二多核苷酸载体，除了用编码不同选择标记的第三核苷酸序列置换第二核苷酸序列外，第二多核苷酸载体有与第一多核苷酸载体基本相同的核苷酸序列；第一多核苷酸载体和第二多核苷酸载体整合进入宿主细胞的基因组中。
优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，更优选中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
优选地，第二核苷酸序列编码二氢叶酸还原酶多肽，该选择试剂是氨甲蝶呤。优选地，重组目的多肽是人红细胞生成素。在本文件的实施例部分描述了此类系统。
有利地，通过(a)提供包含编码重组目的多肽并可指导重组目的多肽在宿主细胞中表达的核苷酸序列的宿主细胞；和(b)提供(i)包含水、植物来源的胨、摩尔渗透压浓度调节剂、缓冲液、能源、氨基酸、脂源或前体、铁源、非铁的金属离子和一种或多种维生素和辅因子；和(ii)不含有任何全长的多肽的无血清培养基；和(c)在使得重组目的多肽能够表达的条件下，在此培养基中培养宿主细胞，以进行细胞培养。
优选地，重组目的多肽是人红细胞生成素。宿主细胞可以是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在本文件的实施例部分描述了该技术。
除非另外定义，这里所用的所有技术和科学术语有与本领域(例如细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学)普通技术人员通常理解的相同意义。标准技术用于分子、遗传和生物化学方法(通常参见Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第四版，JohnWiley & Sons，Inc.-和名称为Current Protocols in Molecular Biology的完全版本，这里将其并入作为参考文献)和化学方法。
参考如下实施例进一步描述本发明，实施例仅仅是示例性的而非限制性的。特别地，实施例涉及本发明优选的实施方式。
实施例材料宿主细胞系二氢叶酸还原酶缺陷型的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(ATCCCRL-9096)。它们根据布达佩斯条约在2001年8月29日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，(Rockville，Md.20852，USA)，保藏号ATCCPTA-3672。
细胞培养基培养基补加了4mM L-谷氨酰胺，10％FCS，1x HT(次黄嘌呤，胸苷)的DMEM，选择培养基补加了4mM L-谷氨酰胺，10％透析的FCS，和0.5mg/mlG418的DMEM，扩增培养基补加了4mM L-谷氨酰胺，10％透析的FCS，0.5mg/mlG418和4.8×10-8M-1.54×10-6M的MTX(氨甲喋呤)的DMEM，冷冻培养基补加了4mM L-谷氨酰胺，10％FCS和10％DMSO的DMEM，用于重组细胞系的无血清适应培养基补加了6mM L-谷氨酰胺，0.25％大豆胨/UF，1x杂交瘤补料，0.1％Pluronic-F68，0.5mg/ml G418，1.54×10-6M的MTX的1∶1 DMEM/Ham’s F12，无血清的生产培养基补加了0.25％大豆胨/UF，1x杂交瘤补料，0.1％Lutrol，1.54×10-6M的MTX，1g/l葡萄糖，2.5g/l NaHCO3的1∶1DMEM/Ham’s F12，用于重组细胞系的无血清冷冻培养基PBS，20％ PVP-10，5％DMSO，100x杂交瘤补料，2.5×10-3M乙醇胺，2.5×10-2M柠檬酸铁，2.0×10-3M L-抗坏血酸，5.0×10-6M亚硒酸钠。
质粒构建体pEpo/neo该质粒编码红细胞生成素(Epo)的编码区和新霉素抗性基因作为两个不同表达盒子，每个表达盒子受SV40早期启动子/终止序列控制。在实施例1中提供了构建细节。
pEpo/dhfr该质粒编码红细胞生成素(Epo)的编码区和dhfr作为两个不同表达盒子，每个表达盒子受SV40早期启动子/终止序列控制。在实施例2中提供了构建细节。
细胞培养中的方法CHO-dhfr-的生长在DMEM培养基中以一周两次1∶10传代率培养二氢叶酸还原酶缺陷的CHO细胞(Urlaub等，1980，PNAS 77(7)4216-4220)(称为CHOdhfr-)。
CHO细胞的转染在进行脂质转染前一天，在25cm3T-烧瓶或96孔板中接种1-5×104细胞/cm2。以适合的比率混合相应的质粒，根据制造商的程序向脂质转染试剂(GIBCO/BRL)中加入该质粒(0.5-1μl/cm2)。然后，用转染混合物在无血清的DMEM中覆盖细胞4到16小时，之后用培养基取代含有DNA的培养基。在含有血清的培养基中培养24到48小时后，将细胞转换到选择培养基中。在通过ELISA针对红细胞生成素(Epo)的产生筛选细胞培养物上清液前，首先在选择培养基中培养转染的细胞池(pool)至铺满，然后在扩增培养基(4.8×10-8M的MTX)中培养。确定最高的生产者，MTX浓度增加了两倍，最好的生产者用于进一步培养。
分析方法在不同基质中以ELISA检测红细胞生成素(Epo)抗体多克隆血清生物素化的兔抗红细胞生成素(Epo)(R&D Systems；Catalog # AB-286-NA)单克隆抗体小鼠抗红细胞生成素(Epo)(Genezyme；Cat.codeAE7A5)。
ELISA缓冲液包被缓冲液8.4g/l NaHCO3，4.2g/l Na2CO3，pH9.6-9.8洗涤缓冲液0.2g/l KCl，1.15g/l Na2HPO4×2H2O，0.2g/l KH2PO4，8g/l NaCl，0.1％ Tween 20稀释缓冲液洗涤缓冲液中2％PVP(Sigma Cat.No.PVP-40T)样品缓冲液稀释缓冲液中0.5％α-单-硫代-甘油染色缓冲液7.3g/l柠檬酸×2H2O，11.86g/l Na2HPO4×2H2O，pH4.8-5.0染色溶液100μl OPD溶液/10ml染色缓冲液，5μl H2O2/10ml染色缓冲液OPD母液PPL0017方法所用的ELISA方法检测在ng/ml浓度范围中的红细胞生成素(Epo)，特别地具有约10ng/ml范围的检测限，其中所述Epo从500ng/ml开始，8次两倍稀释。一种抗红细胞生成素的头26个氨基酸的单克隆抗体作为包被层，结合红细胞生成素(Epo)。在下步中，红细胞生成素(Epo)被捕获抗体特异地结合。通过生物素化的识别红细胞生成素(Epo)的兔抗血清进行检测。在链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶偶联到板上后，用OPD染色进行可见观察。
免疫荧光在6孔板中于盖片上，用5×104细胞/200μl接种表达红细胞生成素(Epo)的CHO细胞，并且温育24-72小时。用PBS洗涤附着的细胞2次，用-20℃甲醇固定5分钟，然后空气干燥，然后再一次浸在PBS中。通过与20％FCS在PBS中温育15分钟饱和非特异性蛋白质，然后，温育抗红细胞生成素(Epo)1小时。用缀合FITC的抗小鼠IgG显色反应。在488nm激发波长，随后在高于515nm发射波长下通过共聚焦显微术检测荧光。
核大小的检测材料Coulter Counter?Model ZM(Coulter Electronics Inc.)Coulter Channelyzes?Model 256温育溶液0.1M柠檬酸，2％Triton X 100，电解质Isoton II(Kat-No.844 8011；Coulter Euro Diagnostic GmbH)Coulter Counter定量电导液中悬浮的颗粒大小和数量。用真空吸引液体通过两侧带有电极的毛细管。电阻的改变引起电压脉冲，CoulterChannelizer可以数字化该电压脉冲。核的大小与细胞DNA含量相关，因此可能区分出二倍体和多倍体染色体组。
方法在PBS中洗约1×106CHO-细胞一次，在2ml温育溶液中重悬浮并且放置4-5小时。下面的步骤是特别针对C0ulter Counter的。
SDS聚丙烯酰胺电泳和Western印迹材料SDS凝胶Novex Tris-甘氨酸4-20％样品缓冲液Tris甘氨酸SDS 2x(Novex LC 2676)电泳缓冲液Tris甘氨酸SDS(Novex LC 2675)印迹缓冲液50mM Na2B4O7×10H2O，0.1％SDS，20％甲醇印迹基质PVDF Immobilon P 0.45μM Millipore；K8JM8238H洗涤缓冲液参见ELISA洗涤缓冲液稀释缓冲液洗涤缓冲液中1％奶粉检测缓冲液0.1M NaCl0.1M Tris-HCl，pH9.5方法在lx样品缓冲液中，用1％α-MTG将含有红细胞生成素(Epo)的样品调整到30ng/20ul，加到SDS凝胶上。在电泳结束后，在PVDFImmobilon膜上印迹蛋白质2小时，然后用检测红细胞生成素(Epo)头26个氨基酸的单克隆抗体特异地染色红细胞生成素(Epo)。用缀合碱性磷酸酶的抗小鼠IgG和NBT/BCIP染色完成显色。
等电聚焦材料系统Multiphor II，Amersham BiosciencesIPG凝胶pH2.5-7重新溶胀缓冲液9g尿素，0.5g CHAPS，0.04g DTE，0.5ml Resolytes(pH3.5-10)，10μl溴酚蓝(0.1％)，用H2O调节到25ml样品缓冲液625μl H2O中25μl IPG样品缓冲液，pH3-10
印迹缓冲液2.93g甘氨酸，5.81g Tris，20ml甲醇，0.375g SDS，用H2O调节到1000ml印迹基质PVDF Immobilon P 0.45μM Millipore；K8JM8238H洗涤缓冲液参见ELISA洗涤缓冲液稀释缓冲液洗涤缓冲液中0.1％奶粉检测缓冲液0.1M NaCl，0.1M Tris-HCl，pH9.5方法将含有红细胞生成素(Epo)的样品调整到500-1000ng/50μl，脱盐，1∶1稀释在样品缓冲液中，加到重新溶胀的IPG凝胶上。电泳条件是最初1分钟300V，然后线性增加到3500V，最后1小时3500V。在整个聚焦过程期间，设定10mA和10W的限定。然后，通过过夜扩散或通过电印迹将蛋白质印迹到PVDF Immobilon膜上，然后用检测红细胞生成素(Epo)头26个氨基酸的单克隆抗体特异地染色红细胞生成素(Epo)。用缀合碱性磷酸酶AP的抗小鼠IgG和NBT/BCIP染色完成显色。
DNA含量的测定通过FACS分析比较重组细胞系和CHO-dhfr-宿主细胞系的DNA含量。
材料洗涤缓冲液0.1M Tris-HCl，pH7.4，2mM MgCl2，0.1％Triton X 100染色缓冲液洗涤缓冲液中0.3μg/ml DAPI(Hoechst)方法在PBS中洗5×105细胞，并且用冰冷的70％乙醇固定。然后，用洗涤缓冲液洗细胞2次，然后在室温下在染色缓冲液中温育30分钟。用FACSVantage(Becton和Dickinson)在359nm激发波长和450nm发射波长下测定DNA含量。
体外特异性检测人红白血病细胞系TF-1(German Collection of Microorganisms andCell Cultures)依赖于IL3或hGM-CSF生长。这些细胞因子显示了对增殖的协同效应，而红细胞生成素(Epo)可以维持生存能力一段时间。细胞常规地在含有GM-CSF和红细胞生成素(Epo)的培养基中生长。
检测补料培养基补加了4mM Gln，10％FCS，20μg/ml运铁蛋白，10μM β-巯基乙醇，12ng/ml rhGM-CSF，3U/ml rh Epo的RPMI 1640检测培养基补加了4mM Gln，100μg/ml运铁蛋白，2mg/ml BSA的RPMI 1640方法在96孔板中以MTT生存力检测进行功能性检测(Hammerling等，1996，J Pharm Biomed Anal 14(11)1455-69)。在检测培养基中从100ng红细胞生成素(Epo)/ml开始以1∶2倍稀释样品8次。将50μl每个样品稀释液、标准稀释液或空白转移到96孔检测板。用冷PBS洗TF-1细胞3次，在检测培养基中调节到2×105细胞/ml。用50μl细胞悬浮液铺在96孔检测板的每个孔中，在CO2培养箱中放置细胞72小时。之后加入10μlMTT溶液(6mg/ml，于PBS中)并37℃温育4小时。在黑暗中，用100μl SDS/HCl(0.1M HCl中10％SDS)溶解染料另外4小时，在550/690nm光度测定红细胞生成素依赖性生存力。
实施例1-质粒Epo/neo的构建1.p2-neo的构建1.1从含有SV40早期启动子的pSV2neo制备载体片段载体构建的基础是包含在pSV2neo中的pBR322质粒骨架。较小的EcoRI-PvuII限制片段包含该pBR322骨架，并且来自SV40的邻近PvuII-HindIII片段具有SV40早期启动子的相关片段。
用限制酶EcoRI和HindIII切割质粒pSV2neo(ATCC 37149)。由此得到的片段大小是3092bp和2637bp。2637bp片段的组成为含有pBR322骨架的EcoRI-PvuII限制片段和含有SV40早期启动子片段的邻近PvuII-HindIII片段。通过凝胶电泳制备和纯化2637bp片段。
1.2新霉素抗性基因的制备从pSV2neo的转座子Tn5提取neo基因。以含有仅基因编码区的片段形式扩增该基因。作为克隆策略的一部分，在两个末端引入限制性内切核酸酶的识别位点。在上游扩增引物中建立HindIII位点，而EcoRI和SpeI位点建立在下游引物中。扩增区对应于pSV2neo序列中核苷酸第2846到1938位(Genbank记录号U02434)。设计寡核苷酸如下寡2004-01长度38mer5′-ggg gga agc ttg ttg gga agc cct gca aag taa act gg -3′ SEQ ID No.15′HindIIIaagctt-g(＝pSV2neo中位置2846)ttgggaagccctg....... SEQ ID No.2寡2004-02长度42mer5′-ggg gaa ttcactagtgag tcc cgc tca gaa gaa ctc gtc aag -3′ SEQ ID No.35′EcoRI/SpeIgaa ttcactagt-g(＝pSV2neo中位置1938)agtcccgctcagaa......... SEQ ID No.4利用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制备引物2004-01和2004-02的扩增产物。该方法的参数是在所提供的缓冲液中20ng pSV2neo，每种引物10pmol，10mmol dNTPs，2.5U Pwo聚合酶，总体积50μl；温度模式95℃，5分钟，35次(95℃，30秒；65℃，20秒；72℃，90秒)，72℃，3分钟，在4℃冷却直到下一步使用。
通过DNA分离柱(Mini，Wizard Promega GmbH)纯化由此得到的935bp DNA片段，用EcoRI和HindIII消化，通过琼脂糖凝胶纯化，用SpinColumns(Supelco)洗脱。
1.3 p1-neo的构建利用Ligation Express(Clontech)将扩增的EcoRI-HindIII neo基因片段与来自pSV2-neo的EcoRI-HindIII载体片段连接，并且转化进入大肠杆菌(E.coli)宿主(E.coli SURE(Stratagene))。通过在补加50mg/l氨苄青霉素的LB培养基上生长筛选转化体。
从克隆分离质粒DNA，利用EcoRI加NcoI，通过限制分析进行检查(分别是2527bp，780bp和251bp三个片段)。通过测序构建体的相关部分进一步检查显示预期片段的质粒DNA。命名含有证实的SV40早期启动子和新霉素抗性基因的质粒DNA为p1-neo。
1.4 SV40终止区SV40LTpolyA/IVS的制备设计PCR引物扩增pSV2neo中存在的SV40终止区域片段(核苷酸751到1598位)。上游引物也含有SpeI限制位点。除了BamHI位点已经包含在pSV2-neo位置751处外，将EcoRI位点引入下游引物中距离BamHI位点6个核苷酸间隔区。两个引物的序列如下寡2004_05长度40mer5′-ggggactagttt gtg aag gaa cct tac ttc tgt ggt gtg a -3′ SEQ ID No.55′ SpeIactag-t(＝pSV2neo中位置1598)ttgtgaagga.............SEQ ID No.6寡2004_06长度46mer5′-ggg ggaattcgg agg gggatccag aca tga taa gat aca ttg atg a-3′ SEQ ID No.75′EcoRI/BamHIgaattc-g(＝pSV2neo中位置751)gatccagacatgataag..... SEQ ID No.8利用上述Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制备引物2004-05和2004-06的扩增产物。利用DNA分离柱纯化由此得到的873bp DNA片段，用EcoRI和SpeI消化，凝胶纯化。
1.5 p2-neo的制备用EcoRI+Spel消化p1-neo质粒DNA。纯化所得线性化片段，与含有SV40LTpolyA/IVS的扩增片段连接，并且转化进入大肠杆菌(E.coli)宿主细胞。通过在补加50mg/l氨苄青霉素的LB培养基上生长筛选转化体。从克隆分离质粒DNA，利用EcoRI(1个4411bp片段)和NcoI(3631bp和780bp大小2个片段)和SphI(3499bp，840bp和72bp大小3个片段)，通过限制分析检查该质粒DNA。通过测序构建体的相关部分进一步检查显示预期片段的质粒DNAs。命名含有证实的SV40LTpolyA/IVS的质粒DNA为p2-neo。
2.质粒p3的构建2.1 SV40早期启动子片段的制备质粒pSV2neo用作SV40早期启动子片段的来源。片段大小几乎与用于构建p2质粒的片段相同。然而，对片段的末端进行了修饰以引入BamHI和NotI识别位点。用于扩增启动子的寡核苷酸引物设计如下寡2004-07长度38mer5′-ggg gggatcctg tgg aat gtg tgt cag tta ggg tgt gg -3′ SEQ ID No.95′BamHIggatcc-t(＝pSV2neo中位置3435)gtggaat.............SEQ ID No.10寡2004-08长度46mer5′-ggg ggcggccgcagc ttt ttg caa aag cct agg cct cca aaa aag c-3′SEQ ID No.115′NotIgcggccgc-a(＝pSV2neo中位置3093)gctttttgcaaaag...............SEQ ID No.12利用上述Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制备引物2004-07和2004-08的扩增产物。利用DNA分离柱纯化由此得到的365bp DNA片段，用BamHI和NotI消化，凝胶纯化。
2.2 pBluescript载体部分的制备分别利用BamHI和NotI相继限制切割pBluescript II SK+DNA。利用碱性磷酸酶将DNA去磷酸化。在连接前通过琼脂糖凝胶电泳从小片段纯化BamHI/NotI片段。
2.3质粒p3的制备和验证利用T4 DNA连接酶(Promega GmbH)将含有SV40早期启动子的扩增BamHI/NotI片段连接到制备的pBluescript II SK+载体中。从补加100mg/l氨苄青霉素的LB培养基上的菌落分离和纯化大肠杆菌SURE(Stratagene)转化体的质粒DNA。
利用EcoRI加NcoI，通过限制分析检查由此得到的DNA(2个3039bp和253bp大小的片段)。
通过测序进一步检查显示预期片段的两个质粒DNA。测序SV40早期启动子的双链以证实每个位置。命名该质粒为p3。
3.人红细胞生成素(Epo)cDNA的分离3.1 TRIZol?试剂分离总RNA
用于从人肾组织(从Laizner Krankenhaus医院获得)分离红细胞生成素(Epo)RNA的TRIZol?试剂是苯酚和异硫氰酸胍的单相溶液。在细胞裂解期间，当细胞破坏时，异硫氰酸胍与RNA形成水溶性复合物。添加氯仿后离心，将溶液分成含有RNA的水相和有机相。水相分离后，用异丙醇沉淀RNA，用乙醇洗，空气中干燥并在无RNAse的水中重悬浮。
将人肾组织块切成小片，施力使其通过100μm细胞滤器，离心(179xg/10分钟)，用PBS洗由此产生的沉淀3次。然后在PBS中重悬浮沉淀，等份置于无菌试管中，冷冻到-196℃，在使用前贮藏在-80℃。
通过添加1ml TRIZol?试剂裂解冷冻组织，匀浆并在15-30℃温育5分钟确保完全解离。加入200μl氯仿后，震荡试管并在15-30℃温育2-3分钟，以12000xg离心试管10分钟。离心后，将上层水相小心地转移到新试管中与500μl异丙醇混合，在15-30℃温育10分钟。离心(12000xg，10分钟)沉淀的RNA，用乙醇洗沉淀，再次离心，空气干燥并在无RNAse的DEPC水中溶解。在260nm光度地测定总RNA含量。
1OD260nm＝40μg RNA/ml通过计算OD260nm和OD280nm(蛋白质最大吸收)的比率，人们可以估计出RNA分离物的纯度。范围应该在1.6和1.8之间。
3.2用Dynabeads寡(dT)25分离mRNADynabeads寡(dT)25mRNA DIRECT试剂盒利用真核生物mRNA的聚腺苷尾RNA和超磁性聚苯乙烯颗粒杂交，该颗粒含有与其表面共价连接的25个核苷酸长的脱氧胸苷酸链。利用Dynal磁性颗粒浓缩器(DynalMPC?)分离与磁珠结合的mRNA。
洗涤缓冲液 Tris-HCl 10mM，pH8.0；LiCl 0.15mM；EDTA 1mM2x结合缓冲液 Tris-HCl 20mM，pH7.5；LiCl 1mM；EDTA 2mM对于10μg总RNA，在Dynal MPC?中分离100μl Dynabeads寡(dT)25，并且用2x洗涤缓冲液洗2次。同时用1x洗涤缓冲液将总RNA调整到200μl的体积，并且通过在65℃温育4分钟变性。然后，将RNA与磁珠混合，在室温温育5分钟，在Dynal MPC?中分离。用1x洗涤缓冲液洗磁珠2次。通过在65℃与洗脱缓冲液(2×10μl)温育4分钟从Dynabeads寡(dT)25洗脱聚腺苷酸化RNA。在Dynal MPC?中分离Dynabeads，立即将上清液转移到新的无RNAse的微量离心管中。洗脱物直接用于反转录。
3.3 反转录通过在80℃温育4分钟变性红细胞生成素(Epo)的特异引物，通过在65℃温育5分钟变性mRNA。在冰上，将下面的成分加到1.5ml无菌微量离心管中试剂 终浓度mRNA 10μlMMLV(200U/μl)0.25μlBoehringer PCR缓冲液(10×)2μldNTPs(10mM) 2μlMgCl2(50mM) 1μlEpo正向引物(100pmol/μl) 1μlDTT(0.1M) 0.25μlRNAse抑制剂(40U/μl) 0.25μlH2O 3.25μl37℃温育60分钟，100℃失活5分钟。
3.4 聚合酶链式反应在4℃，将下列成分加入到无菌1.5ml微量离心管中。PCR条件如下试剂 Epo模板 cDNA Epo 5μl聚合酶Vent 1U(0.5μl)聚合酶缓冲液(10×)Vent缓冲液1×(10μl)dNTPs(10mM) 200μM(2μl)MgCl2(50mM) /正向引物(10pM)30pM(3μl)反向引物(10pM)30pM(3μl)DMSO /H2O 76.5μl
PCR循环1变性 95℃2分钟2变性 94℃45秒3引物退火 58℃30秒4延伸 72℃1分钟5最后延伸 72℃10分钟6循环 30个通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。
3.5 琼脂糖凝胶电泳6×BX缓冲液 溴酚蓝0.25％；二甲苯腈蓝0.25％；甘油30％TAE缓冲液Tris碱242g；冰醋酸57.1ml；EDTA(0.5M，pH8.0)100ml；水调整到1000mlλ标记III10μg野生型λ噬菌体Dann(2.5μl HindIII+2.5μl EcoRI+20μl缓冲液R(Fermentas)，用水补充到200μl；在37℃消化1小时，在65℃失活20分钟；用40μl BX-上样缓冲液补充)在微波炉中溶化1g琼脂糖和99g 1×TAE缓冲液，冷却到约60℃，补加3μl溴乙锭母液(10mg/ml)。根据待分离DNA片段的长度，在1×TAE缓冲液中，在100-300V进行凝胶电泳约30分钟。每泳道含有10μl与2μl 6×BX缓冲液混合的样品。根据与λ/HindIII消化分子量标准比较鉴定DNA片段。
3.6用于连接的载体和PCR产物的制备3.6.1载体DNA和用于粘性末端克隆的插入片段的限制消化根据制造商的说明书，10u限制酶和适合的限制缓冲液与1μg载体DNA和插入片段混合。根据所用的酶、载体和插入片段，在37℃(对于Smal是30℃)温育混合物30至60分钟。然后通过加热到65℃，10分钟失活酶，通过琼脂糖凝胶电泳分析反应混合物。
3.6.2连接pIRESneoSV40载体pIRESneo载体(Clontech Laboratories)含有脑心肌炎病毒(ECMV)的内部核糖体进入位点(IRES)，其允许从一个信使RNA翻译两个开放读框。pIRESneo表达盒子含有人巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子/增强子，其后是多克隆位点(MCS)、ECMV IRES，之后是新霉素磷酸转移酶基因和牛生长激素的聚腺苷酸化信号。在该载体中，用SV40早期启动子置换CMV启动子。
用T4 DNA连接酶连接载体和PCR产物。对于最佳的连接，以约1∶10的摩尔比率利用约20ng载体和200ng插入片段(根据长度)，在总体积10μl的水中与下面试剂混合。15℃过夜并在室温进行温育3小时。然后通过在65℃温育10分钟热失活连接酶。
3.6.3细菌和培养基JM109(Promega，USA)LB培养基 酪蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g，用水调整到1000ml，用5M NaOH将pH调到7.0。
LB琼脂1000ml LB培养基中15g琼脂LB-Amp1000ml LB培养基中100μl氨苄青霉素(100mg/ml)SOC培养基 细菌培养用胰蛋白胨20g；酵母提取物5g；NaCl 10mM；KCl 3mM；MgCl210mM；葡萄糖20mM，MgSO410mM3.6.4利用CaCl2转化感受态细菌(JM109)的制备用大肠杆菌(JM109)接种10ml LB培养基，在37℃过夜生长。在LB培养基中以1∶100稀释4ml细菌培养物，生长到OD260nm达到0.8。在4℃，4500rpm离心细菌10分钟，以10ml 0.1M CaCl2(4℃)/50ml所用细菌悬浮液重悬浮细胞沉淀。离心细胞，在2ml 0.1M CaCl2中重悬浮沉淀，等份为100μl的总体积，液氮中冷冻，在-80℃贮藏。
转化在预冷却的17×100mm聚丙烯培养管中将5-10ng质粒DNA加入到JM109感受态细菌中，轻轻混合，在冰上放置30分钟。然后在精确地42℃，不要振荡，水浴热激细胞45秒，之后立即置冰上2分钟。向试管中加入900μl SOC培养基，并且在37℃温育30分钟，之后在LB-Amp平板上涂100μl细菌悬浮液。
3.6.5筛选和确立甘油培养物通过PCR技术筛选具有插入DNA片段的氨苄青霉素抗性菌落。将氨苄青霉素抗性菌落的一部分和PCR反应混合物及特异于克隆的DNA片段的引物(参见下文)混合。在琼脂糖凝胶电泳中阳性菌落显示PCR扩增的DNA带。然后，在LB-Amp培养基中增殖这些菌落用于进一步分析和质粒纯化。为了进一步使用和贮藏，1ml期望的细菌培养物与500μl甘油(87％)混合，并在-80℃贮藏。
3.6.6 Wizard?Plus SV小量制备DNA纯化系统细胞重悬浮溶液 Tris-HCl 50mM，pH7.5；EDTA 10mM，RNase A 100μg/ml细胞裂解溶液NaOH 0.2M，SDS 1％中和溶液盐酸胍4.09M，醋酸钾0.759M，冰醋酸2.12M，pH4.2柱洗涤溶液 醋酸钾60mM，Tris-HCl 10mM，pH7.5；乙醇60％用单菌落接种2-3ml LB-Amp培养基，在37℃过夜温育。离心(12000xg，5分钟)溶液，以250μl重悬浮溶液及随后以250μl细胞裂解液完全重悬浮由此得到的沉淀，通过颠倒试管4次混合，在室温温育1-5分钟。此后加入10μl碱性蛋白酶溶液(在室温温育5分钟)和350μl中性溶液。通过颠倒试管4次立即混合试管，室温，12000xg离心细菌裂解液10分钟。将澄清的裂解液转移到Spin Columns，离心(12000xg，5分钟)，用洗涤溶液(750μl/250μl)洗柱2次。用100μl无核酸酶的水洗脱DNA。
3.6.7质粒的测序通过IBL(Gerasdorf，Austria)和通过GenXpress(Maria W?rth，Austria)，用特异性引物测序插入的序列。下面列出了用于红细胞生成素(Epo)和SV40早期启动子扩增和序列分析的寡核苷酸引物。
寡核苷酸引物序列SV40早期启动子SV40早期ClaI正向 5’-aga tcg atc aag ctt ttt gca aaa gcc tag-3 SEQ ID No.13SV40早期NruI反向 5′-agt cgc gag cgc agc acc atg gcc tg-3′ SEQ ID No.14SV40早期281反向 5′-gcc cag ttc cgc cca ttc-3′ SEQ ID No.15EpoEpo BamHI正向 5′-tag gat cct cat ctg tcc cct gtc ctg c-3′ SEQ ID No.16Epo EcoRI反向 5′-tag aat tcc gcc atg ggg gtg cac gaa tgt cc-3′ SEQ ID No.17Epo221正向5′-taa ctt tgg tgt ctg gga-3′ SEQ ID No.18Epo204反向5′-tcc cag aca cca aag tt-3′ SEQ ID No.19PIRESneopIRESneo 181反向 5′-tta ggg tta ggc gtt ttg cg-3′ SEQ ID No.20pIRESneo 1016正向 5′-act cac ccc aac agc cg-3′ SEQ ID No.21pIRESneo 2786正向 5′-ggcc aaa caa cag atg gct-3′SEQ ID No.22pIRES-20000反向 5′-tgg aaa gag tca aat ggc-3′ SEQ ID No.234.质粒p5的构建4.1 Epo基因片段的制备利用pSVGPIRNEO作为模板DNA，通过PCR扩增Epo(人红细胞生成素)的结构基因。在GenBank记录号M11319.1中给出了Epo序列。分别将限制位点NotI和KspI引入上游和下游引物中。设计引物如下寡2004-09长度45mer
5′-ggg ggcggccgcatg ggg gtg cac gaa tgt cct gcc tgg ctg tgg -3′ SEQ ID No.245′NotIgcggccgca(＝PSVGPIRNEO中位置665)tgggggtg.............. SEQ ID No.25寡2004-10长度44mer5′ggg gccgcggtc atc tgt ccc ctg tcc tgc agg cct ccc ctg tg-3′ SEQ ID No.265′KspIccgcgg-t(＝PSVGPIRNEO中的位置1246)catctgtcccct............... SEQ ID No.27利用上述Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制备引物2004-09和2004-10的扩增产物。利用DNA分离柱纯化由此得到的604bp DNA片段，用KspI和NotI消化，凝胶纯化。由此得到的592bp KspI/NotI片段用在下述的三重连接中。
4.2终止区SV40LTpolyA/IVS的制备除了将引物设计为具有不同限制核酸内切酶识别位点外，用与上述1.4部分中p2-neo构建方法相似的方法，通过PCR，从pSV2neo再次克隆终止区SV40LTpolyA/IVS上游引物包含KspI(＝SacII)位点，下游引物包含SacI和EcoRI位点。
寡2004-11长度42mer5′ggg gccgcggtt tgt gaa gga acc tta ctt ctg tgg tgt gac-3′SEQ ID No.285′KspIccgcgg-t(＝pSV2neo中位置1598)ttgtgaaggaa.............SEQ ID No.29寡2004-12长度46mer5′-ggg ggagctcgaattcga tcc aga cat gat aag ata cat tga g-3′ SEQ ID No.305′SacI/EcoRIgagctcgaattc-g(＝pSV2neo中位置752)atccagacatg.....SEQ ID No.31利用上述Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制备引物2004-11和2004-12的扩增产物。利用DNA分离柱纯化由此得到的873bp DNA片段，用KspI和SacI消化。凝胶纯化由此得到的858bp DNA片段。
4.3 p3载体部分的制备分别利用NotI和SacI相继消化p3质粒DNA。用碱性磷酸酶处理DNA，凝胶纯化载体片段。
4.4质粒p5的三重连接和分离在一个连接反应中连接质粒p3的NotI/SacI载体部分、KspI/NotI Epo基因和KspI/SacI终止区SV40LTpolyA/IVS(Ligation Express，Clontech)。在补加100mg/l氨苄青霉素的LB培养基上筛选转化体。
利用两个扩增片段2004-09/2004-10和2004-11/2004-12作为标记探针，通过菌落杂交筛选含有两个片段的阳性转化体。选择使用两个探针均给出阳性杂交信号的10个克隆用于“中等”规模的质粒制备(Qiagen)。
利用酶BamHI(1个4723bp片段)，EcoRI(2913，1810bp的2个片段)和PvuII(2513，1204，903，103bp的4个片段)进行限制分析。选择显示正确限制片段的两个克隆，通过测序进行检查。测序克隆进入pBluescript IISK+中的整个盒子，并且与预期的核苷酸序列比较。可以成功地证实每个单独的核苷酸。命名质粒为p5。
5.pEpo/neo的构建5.1 pEpo/neo 12-1的构建用BamHI和EcoRI消化p5质粒DNA，凝胶纯化由此产生的代表SV40启动子-Epo基因-SV40终止子的1792bp片段。
也用BamHI和EcoRI消化质粒p2-neo，凝胶纯化线性化载体。此外，用碱性磷酸酶去磷酸化DNA，用Amicon Micropure酶去除器纯化。
连接4411bp p2-neo载体和来源于p5的1792bp盒子此两个片段(Ligation Express，Clontech)，转化进入大肠杆菌SURE。从生长在补加70mg/l氨苄青霉素的LB培养基上的各种转化体分离质粒DNA，通过利用限制内切核酸酶PvuII，EcoRI和NcoI消化分析该质粒DNA。
选择显示期望片段(EcoRI6191bp，NcoI4085，1326和780bp，PvuII3273，2130，685和103bp)的克隆，命名为pEpo/neo-12。
为了进一步纯化，将DNA重新转化进入大肠杆菌SURE(参见上文)并利用“Midi-prep”方法(Qiagen)从单菌落接种的培养物制备质粒DNA(pEpo/neo 12-1)，利用酶BamHI，HindIII，EcoRI，NcoI，NotI，PstI，SpeI，SphI，PvuII，NarI进行限制分析。可以发现预期的片段和大小，证实克隆为正确的pEpo/neo克隆。
5.2 pEpo/neo的最后构建在从起始ATG起的-3位置改变pEpo/neo-12-1中Epo基因的上游区。将另外核苷酸A引入以在从起始ATG起的-3位置产生嘌呤碱基G。在该位置的嘌呤可以改进基因的表达水平。为了该目的，利用修改的上游引物2004-09-a再次扩增Epo基因。
寡2004-09-a长度46mer5′-gggggcggccgcaatgggggtgcacgaatgtcctgcctggctgtgg-3′SEQ ID No.32如上所述，利用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制备引物2004-09-a和2004-10的扩增产物。利用DNA分离柱纯化由此得到的605bp DNA片段，用KspI和NotI消化。然后凝胶纯化由此得到的593bp DNA片段。
分别用KspI和NotI消化pEpo/neo-12-1质粒DNA以除去Epo基因。然后凝胶纯化5599bp片段。连接两个制备的DNA(Ligation Express，Clontech)。从补加70mg/l氨苄青霉素的LB培养基上的菌落分离和纯化转化体的质粒DNA。在第一次筛选中，利用NcoI限制分析DNA。
选择阳性克隆利用“Midi-prep”方法(Qiagen)分离DNA。利用BamHI，HindIII，EcoRI，NcoI，NotI，PstI，SpeI，SphI，PvuII，NarI进行深入的限制分析。可以发现预期的片段和大小，证实正确的pEpo/neo克隆。也通过测序证实插入在pBR322载体部分中的整个盒子的每一个核苷酸(SV40早期启动子-neo基因-SV40LTpolyA/IVS-SV40早期启动子-Epo基因-SV40LTpolyA/IVS)。
实施例2-质粒Epo/dhfr的构建1.p2-dhfr-CDS的构建1.1 dhfr基因的制备从存在于质粒pLTRdhfr26(ATCC 37295)中的小鼠cDNA获取用于载体构建的dhfr基因。可以以GenBank记录号L26316.得到小鼠dhfrcDNA核苷酸序列(MUSDHFR)。
利用设计的引物从pLTRdhfr26扩增dhfr，该设计的引物产生含有从位置56起始ATG到位置619终止密码子TAA的编码区的片段。考虑到上述新霉素抗性基因的扩增，在上游和下游扩增引物中分别引入HindIII和SpeI位点。在反向引物中除了SpeI位点外也引入了EcoRI位点。寡核苷酸的序列如下寡2004-13长度39mer5′-ggg gaagcttat ggt tcg acc att gaa ctg cat cgt cgc-3′ SEQ ID No.335′HindIIIaagctt-A(＝MUSDHFR中位置56)TGgttcgaccattg.............SEQ ID No.34寡2004-14长度42mer5′ggggaa ttcactagttag tct ttc ttc tcg tag act tca aac-3′SEQ ID No.355′EcoRI/SpeIgaattcactag-t(＝MUSDHFR中位置619)tagtctttcttctcgtagacttcaaact..... SEQ ID No.36如上所述，利用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制备引物2004-13+2004-14的扩增产物。利用DNA分离柱纯化由此得到的588bp DNA片段，用HindIII和EcoRI消化，凝胶纯化。
1.2 p1-dhfr-CDS的制备利用Ligation Express(Clotech)，连接扩增的EcoRI-HindIII dhfr基因片段和来源于pSV2-neo的EcoRI-HindIII载体片段，转化进入大肠杆菌宿主。通过在补加50mg/l氨苄青霉素的LB培养基上生长筛选转化体。从补加50mg/l氨苄青霉素的LB培养基上的菌落分离和纯化转化体的质粒DNA。
从克隆分离质粒DNA，并且利用EcoRI加ScaI，通过限制分析检查质粒DNA(2225bp，514bp和473bp大小的3个片段)。
通过测序构建体的相关部分进一步检查显示预期片段的质粒DNA。命名含有证实的SV40早期启动子和二氢叶酸还原酶基因的质粒DNA为p1-dhfr-CDS。序列的分析揭示了dhfr基因内不同于MUSDHFR公开序列的一个差异，具体是在MUSDHFR序列位置451从T到C的改变。随后的测序表明该变化也存在于源质粒中。因为CTT和CTG都编码亮氨酸，所以由此得到的改变没有引起核苷酸序列编码的氨基酸序列的改变。
1.3 p2-dhfr-CDS的制备用EcoRI+SpeI消化p1-dhfr-CDS质粒DNA。纯化由此得到的线性片段，并且与含有SV40LTpolyA/IVS的扩增片段连接(见上述)。接着转化和筛选，利用AccI，通过限制分析(2994，855和216bp的3个片段)由此得到的质粒。选择几个质粒，利用HincII(分别是3466bp和599bp的2个片段)，A f IIII(分别是2872bp和1193bp的2个片段)和BgII(分别是2371bp和1694bp 2个片段)进一步分析。
通过测序进一步检查显示所有预期正确大小片段的质粒DNA。命名证实的质粒为p2-dhfr-CDS。
2.pEpo/dhfr的构建2.1 pEpo/dhfr 21的制备用BamHI和EcoRI消化p5质粒DNA，凝胶纯化由此得到的1792bp片段，其为SV40启动子-Epo基因-SV40终止子盒子。
也用BamHI和EcoRI消化质粒p2-dhfr-CDS，凝胶纯化线性化载体，用Supelco spin柱洗脱。此外，用碱性磷酸酶去磷酸化DNA，用AmiconMicropure酶去除器纯化。
连接4053bp p2-dhfr-CDS载体和来源于p5的1792bp盒子此两个片段(Ligation Express，Clontech)，转化进入大肠杆菌SURE。利用Epo基因(PCR产物)作为探针，杂交生长在补加70mg/l氨苄青霉素的LB培养基上的转化体菌落，从各种阳性克隆分离质粒DNA，通过利用限制内切核酸酶NcoI消化分析该质粒DNA。
选择显示预期片段(NcoI4085bp和1760bp)的克隆，命名为pEpo/dhfr-21。
为了进一步纯化，将DNA重新转化进入大肠杆菌SURE(参见上文)，利用“Midi-prep”方法(Qiagen)从单菌落接种的培养物制备质粒DNA(pEpo/dhfr-21-1)。
利用酶BamHI，HindIII，EcoRI，NcoI，NotI，PstI，SpeI，SphI，PvuII，NarI进行限制分析。可以发现所有预期的片段和大小，证实克隆为正确pEpo/dhfr-21。
2.2 pEpo/dhfr的最后构建用与pEpo/neo相同的方法，在相对于起始ATG的-3位置改变Epo/dhfr-21中Epo基因上游区。将另一个核苷酸A引入以在从起始ATG起-3位置产生嘌呤碱基G。如实施例1之4.2部分所述再次扩增Epo基因。
用KspI和NotI消化Epo/dhfr-21质粒DNA以除去Epo基因。然后凝胶纯化5259bp片段。
连接两个制备的DNA(Ligation Express，Clontech)。从补加70mg/l氨苄青霉素的LB培养基上的菌落分离和纯化转化体的质粒DNA。利用NcoI在第一筛选中限制分析DNA。
选择阳性克隆，利用“Midi-prep”方法(Qiagen)分离DNA。利用BamHI，HindIII，EcoRI，NcoI，NotI，PstI，SpeI，SphI，PvuII，NarI进行深入的限制分析。可以发现预期的片段和大小，证实克隆为正确的pEpo/dhfr。
也通过测序证实插入在pBR322载体部分中的整个盒子的每一个核苷酸(SV40早期启动子-dhfr基因-SV40LTpolyA/IVS-SV40早期启动子-Epo基因-SV40LTpolyA/IVS)。
实施例3-从pEpo/neo和pEpo/dhfr产生重组CHO细胞在进行脂质转染前一天，在25cm3T-烧瓶或96孔板中接种1-5×104细胞/cm2。以50∶1＝Epo/neo∶Epo/dhfr的比率混合两种质粒，根据制造商的程序，使该质粒吸附到脂质转染试剂(GIBCO/BRL)上。
简而言之，我们利用0.25μg DNA/cm2和1.5μl脂质转染试剂/cm2，并且调整该DNA/脂质混合物到200μl/cm2细胞层。在无血清的DMEM中用转染混合物铺在细胞上4小时，然后用培养基置换含有DNA的培养基。在含有血清的培养基中培养24小时后，将细胞转到选择培养基。开始在选择培养基中培养转染的细胞池至铺满，然后在扩增培养基中(4.8×10-8MMTX)培养，之后通过针对Epo产生的ELISA筛选细胞培养上清液。确定最高的生产细胞株，MTX浓度增加2倍，最好的生产细胞株用于进一步培养。选择7个重组细胞池，并且比较生长特性、Epo生产力、蛋白质带型(通过Western印迹分析)，Epo功能性和染色体稳定性。
在T25烧瓶中，用每个T25烧瓶中2.5μg pEpo/neo、0.05μg pEpo/dhfr和15μl脂质转染试剂(09/T25/1和09/T25/2)及每个T25烧瓶中2μgpEpo/neo、0.4μg pEpo/dhfr和15μl脂质转染试剂(09/T25/3和09/T25/4)进行转染。
此外，用每平板10μg pEpo/neo、0.2μg pEpo/dhfr和60μl脂质转染试剂转染5个平板(09/96/1-09/96/5)，用每平板8μg pEpo/neo、1.6μgpEpo/dhfr和60μl脂质转染试剂转染5个平板(09/96/6-09/96/10)。用6.25μg pEpo/neo、0.08μg pEpo/dhfr和35.5μl脂质转染试剂转染平板11和12。
简而言之，利用了0.25μg DNA/cm2和1.5μl脂质转染试剂/cm2，并且将该DNA/脂质混合物调整到200μl/cm2细胞层。
因为以前的试验表明一个培养单元中克隆数最大是3到5，所以主要是在微量滴定板上进行一系列转染。这意味着单克隆转染体的分离比从T烧瓶中数百个克隆的分离更容易。表1描述了每个96孔板的克隆数及有扩增压力和无扩增压力下的ELISA效价。开始在选择培养基中培养转染的细胞池至铺满，然后在扩增培养基中(4.8×10-8M MTX)培养转染的细胞集合，之后通过针对Epo产生的ELISA筛选细胞培养上清液。筛选了大约1000个生长孔，用增加的MTX浓度检测50个这种培养物的Epo比生产力。确定最高的生产细胞株，MTX浓度增加2倍，最好的生产细胞株用于进一步培养。
在96孔板中进行筛选和最初的扩增步骤，筛选所有克隆后，在4.8×10-8M MTX中生长，选择7个克隆，命名为09/96/1F5，09/96/3D5，09/96/3H5，09/96/5D4，09/96/5H1，09/96/6C5和09/96/7E6，比较它们的生长特性、Epo生产力、Western印迹分析中的蛋白质带型，Epo功能性检测和染色体稳定性。
细胞倍增的时间看来对所有克隆是相同的，它们可以一周两次以1∶2到1∶5比率传代。从9.6×10-8M到1.9×10-7M增加MTX浓度也改进生产力，但是进一步倍增MTX浓度不影响ELISA值。因此在3.8×10-7MMTX下进行亚克隆。在1.9×10-7M MTX时分析免疫荧光，各单个培养物没有显著性不同。
通过光学显微术和Coulter Counter核DNA分析比较细胞形态学。克隆09/96/7E9，09/96/6C5，09/96/5H1，09/96/5D4和09/96/3D5特征是与宿主细胞系CHO-DHFR-有相同的核大小分布。与此相比，细胞系09/96/1F5和09/96/3H5有较大的核。从以前的试验得知，这是增加染色体数量的结果。因此，为了进一步稳定化，决定利用克隆09/96/3D5。
与重组药物产品比较，所有7个培养上清液在Epo对TF-1细胞的功能性检测中产生了相同的斜率。
在每个MTX浓度通过SDS PAGE和western印迹检测重组蛋白质，并且在所有重组培养上清液中发现仅仅微小的改变。这些克隆产生Epo。
总结和讨论在此描述了表达Epo的重组CHO细胞系的选择，从真核生物表达载体构建到哺乳动物细胞转染和多克隆Epo表达细胞池的分离。主要用ELISA、免疫荧光、Western印迹和体外功能性检测设定分析的基础。所有这些方法均建立在能够筛选仅仅ng/ml量的低生产细胞池培养上清液和更稳定的重组细胞的浓度范围内。
产生重组CHO池，其中用高达3.8×10-7M的MTX逐步地扩增基因拷贝数。这些细胞一周两次以1∶3到1∶4的比率传代，并且每次在ELISA中检测升高的Epo水平。
实施例4-重组细胞系的进一步筛选重组细胞池09/96/3D5用于进一步稳定化。MTX浓度逐步增加到0.38μM MTX。在该扩增水平，用每孔10和20个细胞亚克隆重组3D5细胞。通过ELISA进行具有单克隆的孔的培养上清液筛选。表2显示在0.38μMMTX存在的情况下，重组细胞池3D5的亚克隆条件和效率。检测300个单克隆的上清液。用0.77μM MTX，在24孔板中选择传代后4天有升高Epo效价的克隆。
在液氮中保藏这些克隆中的7个克隆，通过增加MTX浓度到1.54μM，通过基因拷贝数的进一步扩增进行克隆选择。
表3汇编了第二轮稳定化的铺板条件和效率，这里，最后一次用1.54μM MTX亚克隆克隆09/96/3D5/1H9和09/96/3D5/18E5。每孔细胞数降低到4个细胞。筛选260个单克隆，将其中每个亚培养的20个以上克隆转移到T烧瓶，并且筛选比生产力。通过标准如比表达速率、生长条件和核大小分布，确定最终生产克隆。弃掉显示4倍性的克隆，因为经验中这种细胞在生物反应器中倾向于显示复杂的生长模式。筛选后，选定下面的6个亚克隆(4个1H9和2个18E5亚克隆)，在液氮中将其冷冻。
09/96/3D5/1H9/4C2 09/96/3D5/1H9/6C2 09/96/3D5/1H9/6D409/96/3D5/1H9/15B4 09/96/3D5/18E5/7A6 09/96/3D5/18E5/15C3实施例5-适应无血清的培养基在最后的亚克隆步骤后，选定实施例4的最后6个重组细胞系用于适应无血清的培养条件。用约5×104细胞/cm2将亚克隆后第7-12代中的细胞接种到T25烧瓶中，培养3-4天至铺满。在该时间点，用无血清的适应培养基完全取代培养基，以后每天更新80％的培养基。将所有悬浮细胞返回到培养物中。适应时间后，当几乎所有的细胞都在悬浮液中生长时，一周传代克隆2次，并且作为悬浮培养物培养。
在深低温保藏前，在无血清的适应培养基中培养克隆11-13代。用无血清冷冻培养基在液氮中冷冻每个细胞系，共6个安瓿，每个安瓿5×106个细胞。融化后，在无血清的生产培养基中培养克隆。在融化后于第二或第三代中用上清液进行分析性表征以筛选生产克隆。
分析检测包括比生长速率[μ]-(μ＝ln(×2/×1)/天数)比生产力[qp]-(Qp＝产生的产物×106/(细胞数×天数))Western印迹等电聚焦
DNA含量和稳定性克隆稳定性所有6个细胞系均可以在无血清生长培养基中生长，一周2次传代。在没有血清时也进行深低温保藏，融化后，将培养基转换为无血清的生产培养基。此制剂富含葡萄糖和氨基酸。
5代后测定不同的蛋白质和细胞参数，选定一个生产克隆(09/96/3D5/1H9/6C2；缩写6C2)和一个备用克隆(09/96/3D5/1H9/4C2；缩写4C2)。
实施例6-重组细胞系的比较经几周，通过测定培养物中的细胞数和传代期间的传代比率(splittingratio)，计算来自实施例4和5的6个细胞系的生长特性。通过ELISA检测Epo生产力。从该数据计算上述比生产力和比生长速率。
表4概括了在1∶3传代比率下标准培养条件下3天培养后得到的数据。
示出了传代后和再3天后细胞数(通过Coulter Counter测定)。
还原条件下的SDS-PAGE通过SDS-PAGE分离6个细胞系的上清液，比较分子量的差异。6个上清液显示了相同SDS带型，具有在这种高度糖基化蛋白质中通常可观察到的成片条带(未示出数据)。
类似的商购产品迁移为较为清楚的条带，这可能是在下游处理期间不同条带分离的结果。
IEF-Western印迹IEF-Western印迹分析应该反映糖蛋白潜在的微不均一性。根据加载在凝胶上的蛋白质的量，可以观察到14条带。在Western印迹上，大约于凝胶中部有一条可以观察到的特征性双带；将该双带下面的下一条带定为条带1，在该凝胶的酸性部分可以观察到9至10条带。类似商购产品产生了相应于此异质产物中的条带6到9的4条主要条带。
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