专利名称：银杏内生真菌的分离纯化方法在农业生产过程中控制农作物病虫草害的主要手段是化学农药防治，其对减轻病虫草危害，保证粮食丰产丰收，起到积极的作用。但是由于自然界生物之间相互依存、相互制约，过分依赖化学农药的毒杀作用，产生一些地区发生盲目滥施农药的现象，特别是一些残效期长和毒性大的农药使用，导致一系列食品安全、人类健康和生存环境问题。目前化学 防治的危害逐步被人们所认识，研制安全、高效、环保的新型农药已成为发展的方向和研究的主题。生物农药因对人、畜低危险性，使用安全，对环境友好，不易产生抗性等优点，成为新农药产业发展的热点和重点。植物内生真菌(Endophytic fungi)是指生活在植物组织内或生活史中的某一阶段生活在植物组织内，对植物组织不引起明显变化的真菌，包括那些生活史中某一阶段能营造表生生活的腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌(Latent pathogens)和菌根菌(Mycorhiza fungi)。植物内生真菌具有明显的多样性和普遍性。在目前所有研究过内生真菌的植物中，都有其存在，少则十几种，多则近百种。植物内生真菌与宿主植物长期的共生过程中，构建了内生真菌特殊的生长环境，使得内生真菌能够产生许多与结构新颖、生理活性独特的天然化合物。具有安全、无残留、不在人畜体内积累、防治效果专一等优点，为农药先导化合物和新型生物农药的研究和应用开拓了美好前景。当前利用植物中分离的内生真菌获得生理活性物质已成为研究热点，已有多项研究表明植物内生真菌能产生新型的抑菌活性的物质。如White等从禾本科植物中分离的内生真菌枝顶孢(Acremoniumcoenophilum)对多种体外培养的农作物病原真菌有抑制作用。Findlay从黑云杉(Piceamariana)中分离到内生真菌(Conoplea elegantala)的液体发酵产物中分离出两个新的苯并卩比咯类活性成分，对由丝核菌(Rhizoctonia spp.)和镰刀菌(Fusarium spp.)引起的病害有很好的防效，水稻立枯病、恶苗病等病害有良好的防治作用。顾爱国从苦皮藤内生真菌(Fusarium proliferatum)中分离到恩镰孢菌素(eniatinns)类化合物,其对植物病原真菌菌丝生长和孢子萌发均有显著抑制作用。银杏(Ginkgo biloba L.)素有裸子植物“活化石”和“植物界熊猫”之称，是中国特有的珍贵树种，在漫长的生长期中几乎不感染病虫害，寿命极长。根据内共生理论推断，银杏中很有可能存在着特殊的内生真菌，通过产生特殊的次生代谢产物帮助增强银杏的抗病害能力。
本发明的目的在于提供一种分离自中国安徽省合肥市银杏(Ginkgo biloba L)植物活体中，且其发酵产物具有较强的抑制植物病原真菌活性的微生物，即银杏内生真菌。本发明所描述的银杏内生真菌命名为腐皮镰孢菌(Fusarium solani T_7),现保藏在国家知识产权局指定的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCCNo. 5089 o本发明所描述的银杏内生真菌系从中国安徽省合肥市银杏(Ginkgo biloba L)植物活体中分离得到的。本发明银杏内生真菌的具体分离纯化操作步骤如下(I).银杏组织的准备采集银杏的根、茎、叶；(2).银杏组织的表面消毒与无菌检测将步骤(I)采集的根依次在浓度70%的酒精中浸泡lmin、在浓度0. 2%的次氯酸钠溶液中浸泡2min ;将采集的茎依次在浓度70%的酒精中浸泡50s、在浓度0. 2%的次氯酸钠溶液中浸泡90s ;将采集的叶片依次在浓度70%的酒精中浸泡40s、在浓度0. 2%的次氯酸钠溶液中浸泡60s ;将浸泡过的根、茎、叶用无菌 水冲洗3次，阴干，得到消毒后的根、茎、叶；用消毒手术刀将消毒后的根、茎、叶分别切成0.5cmX0. 5cm大小的根块、茎块、叶块；接着将一部分根块、茎块、叶块直接种植于第一块马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，温度24 28°C恒温培养，培养3 7天；将另一部分根块、茎块、叶块进行无菌检测采用组织印迹法，将根块、茎块、叶块置于第二块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上轻轻滚动或紧贴培养基放置2min，接着移去根块、茎块、叶块，在温度28°C恒温培养，培养7天，无杂菌长出即说明消毒后的根块表面、茎块表面、叶块表面无菌；所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基配方为马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂18克、蒸馏水I升；使用前马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基在温度121°C、压力0. IMPa下灭菌3Omin ；(3).银杏组织内生真菌的分离培养当步骤(2)的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上银杏的根块、茎块、叶块周围长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，接种于第三块马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，温度24 28°C恒温培养，培养3 10天，长出完整菌落，即为银杏内生真菌；银杏内生真菌的菌落质地较薄，菌落表面绒状，中央为淡黄色，四周为白色，无色素产生，背面带黄色至黄褐色；本发明所述的银杏内生真菌菌株ITS基因组由597个碱基(bp)组成，系列如下I TTCGMCCGGC CTTATTGATA TGCTTAAGTT CAGCGGGTAT TCCTACCTGA51 TTCGAGGTCA ACATTCAGAA GTTGGGTGTT TTACGGCGTG GCCGCGCCGC101 TCTCCAGTTG CGAGGTGTTA GCTACTACGC AATGGAAGCT GCGGCGGGAC151 CGCCACTGTA TTTGGGGGAC GGCGTTGTGC CCGCAGGGGG CTTCCGCCGA201 TCCCCAACGC CAGGCCCGGG GGCCTGAGGG TTGTAATGAC GCTCGAACAG251 GCATGCCCGC CAGAATACTG GCGGGCGCAA TGTGCGTTCA AAGATTCGAT301 GATTCACTGA ATTCTGCAAT TCACATTACT TATCGCATTT CGCTGCGTTC351 TTCATCGATG CCAGAGCCAA GAGATCCGTT GTTGAAAGTT TTAATTTATT401 TGCTTGTTTA CTCAGAAGAA ACATTATAGA AACAGAGTTA GGGGGTCCTC451 TGGCGGGGGC GGCCCGTGTT ACGGGGCCGT CTGTTCCCGC CGAGGCAACG501 TTATAGGTAT GTTCACAGGG TTGATGAGTT GTATAACTCG GTAATGATCC551 CTCCGCTGGT TCACCAACGG AGACCTTGTT ACGACTTTTT ACTTCCA本发明所述的银杏内生真菌命名为腐皮镰孢菌(Fusarium solani T_7),现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCC No. 5089。发明所描述的微生物菌种经形 态观察、培养特征和分子生物学ITS基因序列分析，确认其分类学地位属于镰孢菌属，命名为Fusarium solani T-7。以ITS基因序列同源性为基础构建形成包括菌株T-7在内的相关真菌的系统发育树，结果看出，Fusarium solani T-7 与 Fusarium solani FMR 7988 的 ITS 序列同源达到100%。没有碱基的差别。银杏内生真菌菌落培养特征银杏内生真菌在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上温度25°C培养7天，菌落直径达到7. 3cm,质地较薄，菌落表面绒状，中央为淡黄色，四周为白色，无色素产生，背面带黄色至黄褐色。见图I。银杏内生真菌形态特征银杏内生真菌的产孢细胞多产生于气生菌丝，通常有分支，于顶端产生长筒形的单瓶梗；大型分生孢子呈马特型，大多具有1-2个隔，大小10-15 X 3-4 ym，小型分生孢子呈卵形，大小5-8 X 3-4 ii m。见图2。厚垣孢子呈球形,多成串生于菌丝顶端,直径5_8 y m。见图3。银杏内生真菌的分子生物学特征采用分子生物学PCR技术，DNA测序分析，内生真菌的ITS基因由597个碱基组成。银杏内生真菌的DNA序列与Genbank中的相关序列比对了 597个碱基，同源性为100%。以ITS序列为基础构建的系统发育树,腐皮镰孢菌T-7与Fusarium solani FMR7988的进化距离最近。见图4，采用MEGA4. I软件，邻位连接法显示腐皮镰孢菌T-7与相关种的ITS rDNA系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50%数值。银杏内生真菌发酵培养特征液体培养基蛋白胨15克，葡萄糖20克，氯化钙0. 5克，磷酸氢二钾0. I克，硫酸亚铁0. 01克，硝酸钠I克,水1000毫升，pH自然。培养温度28°C±1°C。发酵时间5-7天。发酵培养特征培养第I天，菌体为少量淡粉色的粉末；培养第3天，淡粉色的细粉末减少，出现粉色的小菌丝球；培养第5天，粉红色菌丝球继续增多，并且体积变大，发酵液为橙红色；培养第7天，出现大量红色的菌丝球，体积也变大，发酵液为橙红色。内生真菌的发酵工艺如下菌种一活化一一级种子培养一培养(28°C ±1°C，5_7天)一接种(接种针三环)一二级种子培养一培养(摇床160转/分，28°C ±2°C，2-3天)一接种(接种量5%)—发酵(250毫升三角瓶，28°C ±2°C，5-7天)一银杏内生真菌发酵物。上述发酵工艺中，银杏内生真菌菌种的发酵条件如下(I)发酵方式液体发酵。(2)种子培养一级种子培养为马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基；二级种子培养为液体培养基。马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基的制备取新鲜去皮马铃薯200克，切成小块，加蒸馏水I升煮沸25分钟，过滤弃马铃薯，滤液加蒸馏水补足至I升，加入葡萄糖20克，pH自然，加入琼脂18克煮沸即可。液体培养基的制备取蒸馏水I升，加入蛋白胨15克，煮沸，然后分别加入葡萄糖20克，氯化钙0. 5克，磷酸氢二钾0. I克，硫酸亚铁0. 01克，硝酸钠I克，全部溶解，蒸馏水补足至I升，PH自然即可。以上培养基在使用前均在温度121 °C、压力0. IMPa下灭菌30min。(3)发酵培养发酵培养基为液体培养基， pH自然。(4)培养时间菌种活化培养5-7天，种子摇床培养时间2-3天，发酵培养时间5_7天。(5)培养温度种子培养温度28°C ±2°C，发酵培养温度28°C ±2°C。(6)发酵完毕，发酵液在无菌条件下过滤除去菌丝体，取发酵液过0. 22微米过滤器后，即为银杏内生真菌的抗菌发酵液。本发明所述的银杏内生真菌抗菌发酵液的抗菌试验I.植物病原真菌辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici),番爺枯萎病菌(Fusariumoxysporum),苹果腐烂病菌(Cytospora mandshurica),苹果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides),梨黑星病菌(Venturia pirina),小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)。2.内生真菌的培养将银杏内生真菌接入250毫升三角瓶中(装有50毫升液体培养基)，置于(28±2)°C摇床上(160转/分钟)旋转培养7天，无菌条件下过滤除去菌丝体，发酵液样品备用。3.病原微生物的培养取病原菌的斜面培养物分别接入马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板活化，在(28±2) °C恒温箱中培养5天。4.抑制菌丝生长速率法测定抗菌活性在100毫升的无菌三角瓶中加入6毫升抗菌发酵液样品和54毫升马铃薯葡萄糖琼脂无菌融化的培养基，摇匀，分别各取10毫升置于直径为9厘米无菌培养皿内制成平板，冷却后在每个培养基平面放入I个供试病原菌菌饼(直径为6毫米)，菌饼的菌丝面贴在培养基表面，将平板置于28±1°C培养96小时。采用十字交叉法测定菌落生长直径，用下述公式计算抑制率 I,对照菌落直径一处理菌落直径 M^iKmm(Zo)=对照菌落直径xl0°表I :本发明所述的腐皮镰孢菌T-7对六种植物病原微生物的抗菌结果

本发明涉及银杏内生真菌的分离纯化方法。包括以下操作步骤(1).银杏组织的准备采集银杏的根、茎、叶，温度4℃条件下保藏；(2).银杏组织的表面消毒与无菌检测；(3).银杏组织内生真菌的分离培养。本发明所描述的银杏内生真菌命名为腐皮镰孢菌(FusariumsolaniT-7)，现保藏在国家知识产权局指定的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCCNo.5089。本发明的银杏内生真菌具有广谱抗菌活性的腐皮镰孢菌T-7(FusariumsolaniT-7)菌株的微生物学地位，同时发现该菌对供试六种植物病原真菌具有较为明显的抑制菌丝生长作用。本发明利用植物内生真菌资源，以求获得抗植物病原真菌病害新型农用抗生素类天然成分。