专利名称：一种胰岛素的脂质复合物及其制备方法和制剂的制作方法1、脂质复合物研究进展及背景介绍1. 1复合物的构造特点及形成机制磷脂复合物是由意大利学者Bombardelli在研究脂质体时发现的，早期磷脂复合物研究涉及的药物大多是含有酚羟基的黄酮或多酚类成分，后期更多的研究证实，除酚羟基外，一些醇羟基、酰胺基或羰基等极性基团均有可能与磷脂或其他脂质材料(如胆固醇、 胆酸钠等)的亲水端通过分子间氢键或范德华力等相互作用形成复合物球状体。不论是亲水性药物还是亲脂性药物，只要含有能复合的极性基团，都可形成脂质复合物。脂质复合物的形成，可显著提高药物亲脂性和油溶性。磷脂复合物的组成、结构与同样由磷脂构成的囊泡(又称脂质体)在构造上明显不同。脂质体是磷脂分子的亲水端向外、疏水端向内形成的双分子膜围成的囊泡结构。而磷脂复合物则是活性成分的极性基团与磷脂的亲水端部位通过分子间相互作用而被固定，将磷脂的亲水部位包裹，而疏水端不参与复合反应，可自由移动，形成一个亲脂性的球状体。一个脂质体囊泡可能有成百甚至上千个磷脂分子包围而成，双分子膜的外层和内层均为磷脂的亲水端，而中间夹层则为疏水端。对于亲脂性药物，可被包封于双分子膜的夹层中(图中蓝色方块)，包封率通常较高且稳定，不易泄漏；而亲水性药物只能分散在双分子膜围成的囊泡内核或外围，由于药物进入内核比较困难，实际上亲水性药物大多数分布在外围，稳定性较差且易发生泄漏。在粘膜透过性方面，亲脂性药物的脂质体往往明显优于亲水性药物的脂质体。因此，对于亲水性药物，如先制备脂质复合物提高亲脂性，再制备囊泡，可提高包封率和稳定性，改善粘膜转运特性。2、胰岛素脂质复合物研究背景及现有技术的缺陷2. 1胰岛素脂质复合物研究背景
胰岛素易受胃酸及消化道各种蛋白水解酶的破坏，且因分子量大难以穿透胃肠粘膜屏障，常规口服制剂无效，皮下注射仍是目前最主要的给药途径，长期频繁的注射患者顺应性差。在过去的几十年中，国内外医药工作者为克服频繁注射的顺应性问题，开展了大量研究，一方面是通过结构修饰，制备中效和长效胰岛素，延长了药效维持时间，减少注射次数，另一方面是通过药剂学技术方法，制备脂质体、纳米粒、微球、微乳或油溶液，提高药物对抗酸碱及生物酶的稳定性、促进药物经上皮粘膜的转运与吸收，为口服、经皮、粘膜、肺部吸入等非注射给药制剂的发展提供释药载体。
由于胰岛素亲脂性差，限制了微粒载体的制备与发展。胰岛素脂质体是国内外报道最多的微粒载体，但由于胰岛素分子量大，亲水性强，药物大多存在于磷脂双分子膜的外围，包封率低，易发生泄漏，对胃肠稳定性及粘膜透过性的改善程度有限；而纳米粒、微球的制备大多是在有机溶剂系统中进行的，而胰岛素难溶于有机溶剂，包封率极低，且仅吸附于微粒表面，给药后药物易发生突释，稳定化效果同样较差；现有文献报道的微乳或自微乳，均将胰岛素溶于水相，无法避免药物与胃酸及生物酶的接触，不利于提高胃肠环境中的稳定性。
胰岛素分子中含有大量的酰氨基、酚羟基、羟基、羰基等极性基团，均有可能与脂质材料的亲水端发生分子间相互作用形成脂质复合物，从而改善其亲脂性，突破微粒载体制备的限制。近年来，关于胰岛素脂质复合物的研究成为国内外关注的热点。但胰岛素的亲脂性较差，同样限制了脂质复合物的制备，国内外文献报道和专利普遍存在复合率低、质量不稳定的缺陷。
2. 2现有技术的不足与缺陷
胰岛素由A、B两个肽链组成，分子量接近6千，介于多肽和蛋白质之间。人胰岛素 (Insulin Human) A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共沈种51个氨基酸组成。胰岛素不溶于水及有机溶剂，但可溶于酸性稀醇、PH7. 4的磷酸盐缓冲液、稀酸和稀碱中。
胰岛素中含有大量的可能与脂质材料亲水端发生分子间相互作用的极性基团，具备形成脂质复合物的条件。但胰岛素的蛋白质类结构特征及理化性质特点，使得脂质复合物的制备极其困难，最大的障碍就是复合溶剂的选择。
有机溶剂尤其是非质子传递溶剂有利于复合反应，但胰岛素在有机溶剂中不溶， 且有机溶剂有可能导致胰岛素降解或构象变化，因此，单纯的有机溶剂无法制备胰岛素复合物，至今未见文献报道。如果选用PH7. 4的磷酸盐缓冲液，虽然胰岛素具有一定的溶解度且质量稳定，但脂质材料不能够溶解成澄清透明的溶液，再加上水的极性太大，制得的复合物包封率极低，且分子间作用力极弱，质量不稳定。沃维汉[沃维汉，重组人胰岛素复合物、 其制备方法及包含该复合物的药物组合物，中国专利01140047，2004-10-06]采用磷酸盐缓冲液为溶剂，将胰岛素和磷脂分别溶于或混悬于水溶液中，混合均勻，冷冻干燥去除水分制备磷脂复合物，结果发现，当磷脂与药物的质量比为25 1(摩尔比约为185 1)时， 复合率仅21. 35%，150 1(摩尔比约为1110 1)时复合率为72.0%。
理论上分析，胰岛素含53个酰氨基，4个酚羟基，12个醇羟基，这些基团都有可能与磷脂复合，则1摩尔的药物理论上需要约70摩尔的磷脂(重量比约为1 10)。通常，为确保药物复合完全，脂质材料的投料量应略高于理论值，按理论量的1. 5倍计算，脂质材料最大用量应不超过药物质量的15倍，即磷脂用量应控制在胰岛素质量的15倍以下比较经济合理。但01140047专利技术中，磷脂的质量高达胰岛素的150倍时，仍未能完全复合，提示以水为溶剂复合效率太低。
另一公开文件[R · R · C · New,包含中链单酸甘油酯的疏水性制剂，中国专利 97196069，1999-07-28]被称为Macrosol技术，提供了一种含脂质复合物的胰岛素油溶液， 其脂质复合物的制备方法也是将药物与双亲性的脂质材料共同溶于缓冲盐的水相溶剂中， 经旋转蒸发或冻干技术除去溶剂，再溶于油相中制得油溶液(或将复合溶液直接与油混合，再进行冷冻干燥)。其确定的胰岛素与磷脂的重量比为1 1至1 20，优选1 2至 1 8，但未提供复合率评价结果。鉴于01140047专利以水为溶剂难以获得高复合率的复合物，不难推测，97196069专利条件制备的复合物，大部分药物可能并未与磷脂复合。
本专利发明人对97196069专利方法进行了验证。首先根据胰岛素复合物在环己烷中易溶、而游离胰岛素不溶的特点，建立了复合率测定方法(HPLC方法定量)。根据 97196069专利方法制备胰岛素磷脂复合物，当胰岛素/磷脂质量比为1 2时，复合率低于8%;质量比为1 8时，复合率未超过21% ；质量比为1 12时，复合率未超过25%。 进一步将胰岛素/磷脂质量比为1 8和1 12的复合物溶于中链油中，搅拌制备药物浓度为1. 5mg/g的中链油溶液，室温下放置1个月和冰箱)条件下放置3个月，均出现混浊现象。
虽然97196069专利确定的胰岛素/磷脂质量比例与理论值接近，但由于其制备方法中以水为复合溶剂，因此复合率极低，这与01140047专利技术结果相吻合。
综合以上两项专利，以水为溶剂制备胰岛素脂质复合物，复合率低，存在明显缺陷。
后续一些专利或报道，均在97196069基础上对溶剂系统进行了改进，选用含有冰醋酸的乙醇、含有冰醋酸的DMS0、或含有稀盐酸溶液的乙醚等为复合反应的溶剂。与水溶液相比，有机溶剂的极性相对较小，而酸的加入是为了增加胰岛素的溶解度，提高复合效率。 本专利发明人也进行了验证试验，结果表明，由于冰醋酸和盐酸的酸性较强，且不易挥除干净，制备过程中胰岛素含量下降约5-10%，贮存过程中含量继续下降至20%或更多。
综上所述，关于胰岛素脂质复合物的制备，现有的专利或文献方法因溶剂系统选择的缺陷导致复合效率低、药物在制备过程中易发生降解、酸性成分或水分的残留影响贮存过程中的质量稳定性。此外，对药物/脂质材料用量比例未经科学优化，最终获得的复合物因复合率低而导致油中溶解度的改善程度有限，制成的油溶液载药量低且贮存过程中易出现混浊等不稳定现象。


本发明提供了一种胰岛素脂质复合物，由胰岛素和脂质材料在含低沸点酸的有机溶剂系统中复合而成，复合物中，胰岛素与脂质材料的质量比为1 3 1 15;优选地为1 4 1 12 ；更优选地为1 5 1 10。。
本发明的胰岛素脂质复合物，胰岛素可选自天然胰岛素、猪胰岛素、牛胰岛素、重组人胰岛素及各类中、长效胰岛素，优选地为重组人胰岛素；脂质材料选自天然磷脂、合成磷脂、胆留醇、胆酸及其盐类的一种或它们的混合物，优选的脂质材料选自天然磷脂，优选的天然磷脂选自蛋黄磷脂或大豆磷脂。
本发明的胰岛素脂质复合物，还可包含一种或多种选自抗氧化剂、金属螯合剂和蛋白酶抑制剂的其它成分。
本发明的胰岛素脂质复合物，所使用的复合溶剂为含低沸点酸的有机溶剂，其中， 低沸点酸选自三氟乙酸和氯化氢气体中的一种或它们的混合物，有机溶剂为甲醇、四氢呋喃、DMS0、三氯甲烷、二氯甲烷和乙醚中的一种或其混合物。
本发明的胰岛素脂质复合物，可采用如下方法制备
方法1)取有机溶剂，先加入适量三氟醋酸或通入适量氯化氢气体，再加入胰岛素和脂质材料，搅拌使两者充分复合至形成澄清透明的溶液，旋转蒸法或喷雾干燥除去有机溶剂，残余物干燥即得。
方法幻取有机溶剂，将脂质材料先溶于其中，再加入胰岛素，搅拌条件下缓慢通入适量氯化氢气体或加入适量三氟醋酸，至胰岛素完全溶解形成澄清透明的溶液，常温条件下搅拌或超声处理一定时间，使胰岛素与脂质材料充分复合，旋转蒸法或喷雾干燥除去有机溶剂，残余物经干燥即得。
方法3)将胰岛素溶于含适量三氟乙酸或氯化氢气体的溶剂A中，制成澄清的胰岛素溶液，脂质材料溶于适量的溶剂B中制成澄清的脂质溶液，将胰岛素溶液与脂质溶液混合均勻后，水浴减压旋蒸，再经水泵抽干处理，干燥即得。
方法4)将胰岛素溶于含适量三氟乙酸或氯化氢气体的的溶剂A中，制成澄清的胰岛素溶液，脂质材料溶于适量的溶剂B中制成澄清的脂质溶液，将胰岛素溶液与脂质溶液混合均勻后，在一定温度下水浴减压旋蒸，在溶剂蒸除过程中，分次加入适量的溶剂B，继续旋蒸，水泵抽除溶剂，干燥即得。
上述的方法1)及方法2)中，所述的“有机溶剂”选自甲醇、四氢呋喃和DMSO中的一种或其混合物，优选地为甲醇。三氟乙酸的加入量或氯化氢气体的通入量，以能使加入的胰岛素完全溶解为准，优选地，酸在有机溶剂中的浓度为0. 01-0. 5%，优选0. 05-0. 1 %。 (重量/体积，g/ml)
在上述方法幻及方法4)中，所述的“溶剂A”可选自甲醇、四氢呋喃或DMSO中的任一种溶剂或它们的混合物，优选甲醇；所述的“溶剂B”可选自三氯甲烷、二氯甲烷或乙醚中的一种或其混合物，优选二氯甲烷。三氯醋酸或氯化氢气体在溶剂A中的浓度约为 0.01-0.5%,优选0. 05-0. 1 %。溶剂B的用量约为溶剂A的3-8倍，优选4-6倍。
胰岛素与脂质材料的复合溶液中，胰岛素的浓度应控制在0. 5 30mg/ml，优选 1.0 10.0mg/ml。“常温条件下搅拌或超声处理一定时间”中的“常温条件”系指控制在 15°C 30°C，例如15°C、20°C、25°C或30°C ；“一定时间，，是指控制在30分钟以内，例如30 分钟、20分钟、10分钟或5分钟。“
在本发明的制备方法中，去除有机溶的方法可以是旋转蒸发法，也可以是冷冻干燥法，还可采用其它挥除溶剂的方法，只要能够将溶剂挥除干净，并且不影响药物的稳定性即可。旋转蒸发法去除溶剂时，应在不超过40°C的条件下进行，具体地说，可以是35°C、 30°C或 25°C。
本发明还提供一种胰岛素油溶液的制剂，其包含本发明所述的胰岛素脂质复合物和油。其中，油选自长链甘油三酸酯(长链油)、中链甘油酸三酯(中链油)、甘油单油酸酯、 甘油单甘酯、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯中的一种或它们的混合物。
本发明的包含胰岛素脂质复合物的油溶液，其特征在于，油中还可任选地加入选地加入一种或多种选自吐温80、司盘20、汴泽、聚氧乙烯氢化蓖麻油(Cremphor RH40)、聚氧乙烯蓖麻油(Cremphor EL35)和Labrosal的乳化剂。
本发明的包含胰岛素脂质复合物的油溶液，其特征在于，油中还可任选地加入一种或多种选自丙二醇、PEG400、Transcutol P中的助乳化剂。
本发明的包含胰岛素脂质复合物的油溶液，药物含量可以是iang/g，10mg/g,8mg/g, 6mg/g, 5mg/g, 4mg/g, 2mg/g 或更低。
本发明制备的胰岛素脂质复合物，在制备胰岛素缓释注射剂中的应用。
本发明的包含胰岛素脂质复合物的油溶液，在制备胰岛素口服、经皮、粘膜和肺部吸入等非注射给药制剂中的应用。
本发明还提供了一种胰岛素新型囊泡，其包含本发明的胰岛素脂质复合物和磷脂，还可加入适量的Tween20，Span60等一种或几种混合表面活性剂，平均粒径约为 20nm-200nmo
本发明包含胰岛素脂质复合物的新型囊泡，可以是水分散液，还可以经冷冻干燥或喷雾干燥后制成固体粉末。
本发明的包含胰岛素复合物的新型囊泡，在制备胰岛素口服、经皮、粘膜和肺部吸入等非注射给药制剂中的应用。
与现有技术方法相比，本发明的复合物具有以下优点
1)含低沸点酸的有机溶剂系统作为复合溶剂复合溶剂中不含水，低沸点的三氟醋酸和氯化氢气体易于蒸除，既为胰岛素的溶解提供了酸性环境，又缩短了有机溶剂挥除时间；选择的有机溶剂可保证胰岛素与脂质材料的复合溶液澄清，其极性可确保胰岛素与脂质材料的复合稳定性，且不影响胰岛素的质量稳定，制得的复合物中无酸性物质或水分残留，复合率在90 %以上，制备及贮存过程中药物含量无明显变化。
2)药物/脂质材料用量合理基于复合溶剂的突破，胰岛素与脂质材料的质量比为1 3 1 15，即可获得复合完全的复合物。脂质材料用量与理论推测值相吻合。
3)制备稳定的油溶液复合物显著改善了胰岛素的油溶性，制得的油溶液不仅载药量高，且稳定性好，长期放置不发生混浊，物理性质和化学性质均较稳定。
4)制备稳定的新型囊泡复合物显著改善了胰岛素的亲脂性，使药物分布在囊泡的双分子膜夹层中，药物在胃肠液中的稳定性及粘膜转运速率均明显改善。
在本发明中，如果没有特别地指出，本文所用的科学和技术术语以及名称都具有与本发明所属领域普通技术人员常规理解相同的意思；并且，如果没有特别地指出，其中所采用的物质及其含量或比例、装置、仪器、制备条件等都是本领域技术人员所熟知的或者其根据本发明的描述可得知的。
制备实施例
1.前期探索性研究结果
1. 1有机溶剂对药物化学性质及空间结构的影响考察
本发明人在前期研究工作中，对不同的有机溶剂进行了系统考察，具体方法如下 取胰岛素溶液(PH7. 4PBS)适量，加入适量的甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醚、 氯仿，充分混勻放置1小时，氮吹吹干，加入PH7. 4的PBS溶液复溶，过滤后进行HPLC测定， 以相同浓度的胰岛素对照品PBS溶液为对照，依法测定，计算胰岛素含量的变化，结果显示，甲醇中药物含量无明显变化，最为稳定，其次为四氢呋喃，而乙醇和丙酮则使药物含量下降约5-10%，乙醚下降约15%，乙酸乙酯、氯仿和四氢呋喃中下降更为明显，约30-40%， 提示在甲醇和四氢呋喃中胰岛素化学性质比较稳定。此外还考察了 DMSO和DMF，由于DMSO 和DMF沸点太高，氮吹法难以吹干，因此采用冷冻干燥法去除溶剂，再加入pH7. 4的PBS溶液复溶，过滤后同上法进行HPLC测定并计算胰岛素含量，结果显示，DMF使胰岛素含量明显下降，可能与其碱性条件有关，而DMSO质量相对比较稳定。
进一步按上述甲醇、四氢呋喃和DMSO处理方法操作，去除溶剂后用5mM PBS(pH7. 4)溶解成含胰岛素0. lmg/ml的供试溶液，照圆二色谱测定法，将供试溶液置于光径0. Icm的石英样品池中，于远紫外区(190nm 250nm)测定，记录二级结构图谱的特征峰峰位及最低椭圆率；另将供试溶液置于Icm的样品池，于近紫外区O50nm 350nm)测定， 记录三级结构图谱的特征负峰峰位及最低椭圆率。结果表明，三种溶剂处理后的胰岛素，二级图谱均显示两个负峰，分别在210nm和223nm左右，最低椭圆率分别为-10. 63和-8. 45 左右；三级图谱中均有一个负峰，峰位在274. 5nm左右，最低椭圆率约为-2. 26。与未经有机溶剂处理的胰岛素PBS结果相比，无明显变化，提示甲醇、四氢呋喃和DMSO不会导致空间结构的改变。
1. 2冰醋酸和盐酸的加入对复合物质量的影响
现有文献中，为了使胰岛素形成澄清透明的溶液，大多在有机溶剂中加入冰醋酸或盐酸。
冰醋酸沸点高，旋转蒸发耗时长，随着有机溶剂的挥除，冰醋酸浓度越来越浓，导致胰岛素降解或变性。尤其是最终的复合物中残留的冰醋酸无法去除，会使复合物贮存稳定性变差。这种冰醋酸残留量较高的复合物，即使溶于油溶液中，药物含量仍会明显下降， 在最初的M小时含量通常下降。
本发明人曾选用对胰岛素含量没有影响的甲醇为复合溶剂，加入1-5%的冰醋酸， 以药物/磷脂质量比为1 10制备复合物，35°C旋转蒸发法去除溶剂，真空条件下干燥48 小时，对制得的复合物进行测定，复合率达98%以上，但气相色谱法测定冰醋酸残留量超出0.5%。制得的复合物在2-8°C条件下贮存4周后，与初始含量相比，胰岛素含量下降约 20%。将复合物溶于中链油中，室温放置对小时，与初始含量相比，含量下降约15%。由此提示，冰醋酸的残留对产品稳定性有极为显著的影响。
本发明人进一步用含有稀盐酸的甲醇溶液作为反应溶剂进行试验，35°C旋转蒸发法(温度达到50°C即对胰岛素质量产生明显影响，通常需控制在40°C以下、且时间不宜过长)，结果发现，因引入了一定的水分，去除溶剂更加困难，复合物成形不好。气相色谱法测定盐酸残留量约0. 2%，在2-8°C条件下贮存4周后，与初始含量相比，复合物中的胰岛素含量下降约10%。将复合物溶于中链油中，室温放置对小时，与初始含量相比，含量下降约 5%。
1.3以甲醇(含0.1%三氟乙酸)_ 二氯甲烷为复合溶剂的考察
以甲醇(含0. 三氟乙酸)_ 二氯甲烷为溶剂，设定药物质量浓度为1.5mg/ ml，胰岛素与大豆磷脂的投料比分别为1 1，1 3，1 5，1 7. 5，1 10，1 15和 1 20 (w/w)。将胰岛素溶于甲醇中，磷脂加入二氯甲烷中，然后将两者混合，旋转蒸发除去溶剂，水浴温度为37°C，氮吹。
照如下方法测定复合率及油中溶解度
复合率(包封率)利用胰岛素复合物在环己环中易溶，而游离胰岛素不溶于环己环的特征，进行复合率测定。
复合物药物总含量测定精密称取胰岛素磷脂复合物适量，用含冰醋酸的甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，作为供试液；另精密称取胰岛素对照品适量，用PBS(pH7. 4)溶液溶解制成浓度为lmg/ml的溶液，再用含冰醋酸的甲醇稀释成浓度为0. 2mg/mL的溶液作为对照液。分别精密量取供试液和对照液各10 μ L，照HPLC方法，以0.2% TFA 乙腈=70 30为流动相，柱温30°C，流速lmL/min，波长214nm，色谱柱为Agilent ZORBAX 300SB-C8，依法测定，根据峰面积按外标法计算复合中的药物总含量，记为W总。
复合物中与磷脂结合的药物含量测定精密称取胰岛素磷脂复合物适量(含胰岛素约IOmg)，置IOmL容量瓶中，加环己烷溶解并定容，摇勻，经0. 45 μ m有机膜滤除未被复合的游离胰岛素，精密量取续滤液2mL于IOmL容量瓶中，氮吹除去溶剂，加入含冰醋酸的甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，照上述HPLC方法依法测定，按外标法计算溶液中的药物含fi，id^ W复合。
复合率按下式计算复合率％= (fffi^/ff,6)X100%
油中溶解度分别取适量的胰岛素及磷脂复合物，加入大豆油或中链油，置30°C 磁力搅拌器中，搅拌他使充分混合、溶解，30°C放置Mh，观察药物是否析出，如无药物析出，再加适量胰岛素磷脂复合物，同法操作，直至药物析出。取样5mL，用0. 45 μ m滤膜过滤， 取续滤液用醋酸甲醇稀释适宜倍数，照HPLC依法测定，计算大豆油及中链油中的表观溶解度。
7组复合物测定结果如下表所示
药物与磷脂比例对复合物的影响


本发明公开了一种胰岛素脂质复合物及其制备方法和制剂。本发明的胰岛素脂质复合物是由胰岛素与脂质材料在含低沸点酸的有机溶剂系统中复合、干燥而成，胰岛素与脂质材料的质量比为1∶3～1∶20，复合率高，稳定性好。本发明还提供了一种胰岛素的油溶液和一种胰岛素的新型囊泡。