瓜蒌、红花和川芎在缓解果蝇肠道氧化应激损伤中的应用的制作方法【技术领域】。[0002]肠道不仅具有消化吸收功能，而且是人体最大的免疫器官。当病原微生物入侵肠道时，肠道固有免疫系统承担着局部防御作用。肠道固有免疫系统主要包括肠黏膜上皮屏障，固有免疫细胞，固有免疫分子等。其中肠黏膜屏障功能是肠道的一个重要特征，当外界环境、应激、感染等因素刺激肠道时会打破肠粘膜屏障中的正常菌群与宿主之间的平衡，造成肠道内稳态失调。[0003]果蝇作为重要的模式生物，其肠道结构、细胞构成及干细胞参与的信号转导途径与哺乳动物有很多相似之处。因此研究果蝇肠道免疫调节机制及肠道干细胞分化机制对揭示人类肠道相关疾病的发病机制具有重要的指导作用。果蝇成虫肠道组织自我平衡依赖于死细胞的清除以及新细胞的产生，而且具有细胞分裂能力的肠道干细胞(ISC)在组织稳态的维持方面起至关重要作用。一个肠道干细胞进行不对称分裂可产生两个细胞，其中一个细胞为保持干细胞特性的ISC，另一个为短暂不分裂的成肠细胞(enteroblast，EB)，成肠细胞可继续分化为吸收型的肠上皮细胞(enteiOcyte，EC)或者分泌型的内分泌细胞(enteroendocrine cell, EE)。通过这些细胞的共同作用来实现肠道组织的维持和更新。然而，当干细胞数目发生改变或 者功能下降时会导致器官一系统衰竭，诱发癌变及机体老化。[0004]瓜萎(Trichosanthes kirilowii Maxim.)具有清热漆痰、宽胸散结、润燥滑肠等功效，用于治疗肺热咳嗽、痰浊黄稠、胸痹心痛等病症。主要含挥发油类、油脂类、留醇类、栝楼酯碱、氨基酸等成分，具有抗菌、抗癌、提高耐缺氧能力、降低血清胆固醇等多种作用。红花(Carthamus tinctorius L.)是传统药材,具有活血通经、散瘀止痛的功效,用于治疗循环障碍疾病。其有效成分主要是红花黄色素和红花红色素。其中，红花黄色素具有清除羟自由基、抑制脂质过氧化，保护神经免受损伤等作用。川弯(Ligusticum chuanxiong Hort.)具有活血化瘀、祛风止痛的功效，用于跌打肿痛、头痛、风湿痹痛等病症。主要含挥发油、生物碱、酚类、多糖及有机酸、苯酞内酯等成分，具有镇痛、抗肿瘤、抗菌以及体外清除自由基等作用。然而，目前尚未有对瓜萎、红花和川芎提取物用于缓解肠道氧化损伤的相关报道。
[0005]本发明的目的是揭示出瓜萎、红花和川芎提取物在缓解肠道氧化损伤中的应用。[0006]本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的:
[0007]首先给果蝇喂食氧化应激物(Paraquat和H2O2)来建立果蝇肠道氧化损伤模型，将瓜萎、红花和川芎提取物进行果蝇生存率和肠道干细胞和成肠细胞数量观察等实验，其次给果蝇分别喂食瓜萎、红花和川芎提取物，观察果蝇寿命以及老化果蝇肠道干细胞和成肠细胞数量变化。结果发现瓜萎、红花和川芎提取物具有很好的抗氧化、清除自由基等活性，可用于制备抗氧化药物，尤其是治疗肠道氧化损伤的药物。



[0008]图1为瓜萎、红花和川芎提取物对Paraquat和H2O2处理后果蝇生存率的影响；
[0009]图2为瓜萎、红花和川芎提取物对Paraquat处理后果蝇的肠细胞免疫染色结果和肠道干细
[0010]胞和成肠细胞数量的影响；
[0011]图3为瓜萎、红花和川芎提取物对果蝇寿命的影响；
[0012]图4为瓜萎、红花和川芎提取物对30day老化果蝇的肠细胞免疫染色结果和肠道干细胞和
[0013]成肠细胞数量的影响；

[0014]下面结合实例对本发明作进一步说明:
[0015]实验动物:野生型W1118品系黑腹果蚬(Drosophila melanogaster)为实验室保存，esgGal4UAS-GFP由北京大学袭荣文教授提供。果蝇培养温度为25°C、相对湿度60%。
[0016]果蝇培养基的配制:对照组培养基配方为玉米粉14.2g、琼脂1.lg、酵母粉3.3g、大豆粉1.9g、白糖17g、丙酸0.94mL、去离子水200mL。实验组中加入与对照组去离子水等体积的瓜萎、红花和)11芎提取液，实验组中瓜萎、红花和)11芎提取物的浓度为10 %。
[0017]本实施例涉及的各实验试剂均为市售分析纯:Paraquat和H2O2等。
[0018]实施例1瓜萎、红花和川芎提取液的制备
[0019]瓜萎、红花和川芎各称取20g，加入400mL去离子水浸泡12h，中火熬制3h，过滤，滤渣再加入200mL去离子水用同样的方法提取I次，合并2次滤液浓缩至IOOmL,即得到质量浓度为0.2g/mL(20% )的中草药水提液，置_40°C保存备用。
[0020]实施例2瓜萎、红花和川芎提取物对Paraquat处理后果蝇肠道干细胞和成肠细胞数量的影响
[0021]以普通培养基中培养的果蝇作为对照组，瓜萎、红花和川芎培养基中培养的果蝇作为实验组。分别随机收集对照组和实验组羽化了 3~5d的果蝇，每组中雌雄果蝇各15只。对各组果蝇饥饿处理2h后转移到放有5层滤纸的果蝇管中，向滤纸中加入6mMparaquat或I % H2O2溶液(含5%鹿糖)，使滤纸充分湿润,每24h更换一次滤纸并记录果蝇死亡数。
[0022]结果显示:paraquat处理果蝇6d后，对照组生存率降到1.1 %，而喂食瓜萎、红花和川芎的实验组生存率分别为75.5% (#*Ρ〈0.001)、95.6% (***Ρ〈0.001)和67.7 %(**Ρ〈0.01)，与对照组相比分别提高了 74.4%、94.5%和66.6% (图1Α)。另外，H2O2处理果蝇6d后，喂食瓜萎、红花和川芎的实验组生存率分别为41.1% (**P〈0.01)、50%(**Ρ〈0.01)和 54.4% (***Ρ〈0.001)，是对照组(16.7% )的 2.4,2.99 和 3.2 倍(图 1Β)。上述结果说明，瓜萎、红花和)11芎提取物可缓解paraquat和H2O2诱导的氧化应激损伤，显著地提高了果蝇的生存率。
[0023]实施例3瓜萎、红花和川芎提取物对Paraquat处理后果蝇的肠细胞免疫染色结果和肠道干细胞细胞和成肠细胞数量的影响
[0024]随机收集对照组和实验组羽化4-5d的雌果蝇喂食含5%鹿糖的paraquat (IOmM)溶液16h，显微镜下提取10-12条果蝇肠道于多聚甲醛中，常温固定30min，DAPI染色lOmin，甘油封片后荧光显微镜下观察并拍照。
[0025]结果显示:喂食瓜萎、红花和川芎的实验组中GFP阳性细胞(前体细胞，包括肠道干细胞和成肠细胞)数量显著低于对照组，与对照组相比分别减少了 47.1%、38.6%、31.3% (***P〈0.001)。结果见图 2。
[0026]实施例4瓜萎、红花和川芎提取物对果蝇寿命的影响
[0027]随机收集对照组和实验组羽化4d的果蝇。雌雄分开，每组30只。每2d更换一次培养基，每天定时统计果蝇死亡数，直至全部死亡。
[0028]结果显示:与对照组相比，瓜萎提取物能够延长雌、雄果蝇寿命；红花或川芎提取物只延长雌果蝇寿命而对雄果蝇寿命影响不显著，结果见图3。
[0029]实施例5瓜萎、红花和川芎提取物对30day老化果蝇的肠细胞免疫染色结果和肠道干细胞和成肠细胞数量的影响[0030]随机收集对照组和实验组羽化4d的雌果蝇培养30d后，显微镜下提取10-12条果蝇肠道于多聚甲醛中，常温固定30min，DAPI染色lOmin，甘油封片后荧光显微镜下观察并拍照。
[0031]结果显示:喂食瓜萎、红花和川芎的实验组中GFP阳性细胞(前体细胞，包括肠道干细胞和成肠细胞)数量显著低于对照组，与对照组相比分别减少了 30.2%、28.6%、41.9% (***Ρ〈0.001)。结果见图 4。
[0032]综上所述，通过对果蝇的生存率、果蝇的寿命、肠道干细胞和成肠细胞数量变化的分析，我们认为瓜萎、红花和川芎提取物可缓解果蝇肠道氧化损伤。