专利名称：一种提高植物抗菌和抗病毒的方法 乳铁蛋白(Lactoferrin，简写为LF)是一种糖蛋白，为转铁蛋白家族的成员，在人和哺乳动物的许多器官与组织中广泛分布。由Sorensen M和Sorensen SPL于1938年首次从牛乳中分离出来。乳铁蛋白具有多种生物学功能，如调节铁离子的吸收、促进淋巴细胞的生长、参与巨噬细胞、粒细胞和中性细胞的产物调节，促进双歧菌的生长和抗菌作用等。其中抗菌功能被认为与乳铁蛋白的水解肽段有重要关系。Horoaki(Hiroaki A，Hitoshi S，Hiroshi M.Heat stability of bovinelactoferrin at acidic pH[J].J Dairy Sci，1991，744137)等人为了开发适用于LF的实用性巴氏杀菌方法，研究了酸性pH条件下LF的热稳定性。他发现，在pH2.0或3.0条件下经历120℃杀菌5min后，LF发生了明显的酸降解，但抑菌活性却比未经热处理的LF强。由此推断，LF在酸性条件下经热处理产生了一些耐热的抑菌活性强于LF的多肽。Bellamy(Bellamy W，Takase M，Yamauchi K.Identification of the bactericidaldomain of lactoferrin[J].Biochem et Biophy Acta，1992，1121130)从LF分子的N端进行分离，分别得到人和牛乳铁蛋白的活性多肽，分别被命名为Lfcin H和Lficin B。LfcinB的分子量为3100左右，由25个氨基酸残基组成；Lfcin H由47个氨基酸组成，其中包含了与Lfcin B一致的区域，这一区域是具有抑菌特性的LF的特征结构。核磁共振图谱说明，LfcinB是一个弯曲的反平行β-折叠，该多肽片段的1-13个氨基酸残基在完整的bLFχ-射线衍射图中是α-螺旋结构。Lfcin B区域由α-螺旋变形成β-折叠的情况类似于已知的amyloidogenic prion蛋白和阿尔茨海默氏β-折叠肽(Alzheimer’s β-peptides)。Lfcin B的疏水表面由Phe1、Cyc3、Trp6、Trp8、Pro16、Ilel8和Cys20组成，许多亲水氨基酸和带正电的氨基酸包围着疏水表面。Lfcin B与其它一些阳离子肽(Cationic Peptides)一样通过细胞膜降解或渗透来产生抑菌的效果。通过对大量流行病学的研究发现，采用母乳喂养能够有效降低婴儿出生后6个月内疾病的发生率与死亡率。用人的初乳能够成功治疗小儿大肠杆菌性肠炎、耐药细菌性痢疾、婴幼儿喘息性肺炎等疾病(Ahmed F，Clemens JD，Rao MR，Sack DA，Khan MR，Haque E.1992.Communitybased evaluation of the effect of breast feeding on the risk of micro-biologically confirmed or clinically presumptive shigellosis in Bangladeshichildren.Pediatr 90406-411；Arnold RR，Brewer M，Gauthier JJ.1980.Bactericidal activity of human lactoferrinsensitivity of a variety ofmicroorganisms.Infect Immun 28893-898)。科学研究表明，母乳中产生上述功能的有效成分就是乳铁蛋白。长期以来，困扰畜牧和养殖业的一大难题就是幼畜因感染肠道疾病而死亡的比例较大。尤其当进行工业化、自动化养殖时，饲料成份的单一、环境卫生控制不当等因素更容易引起大规模流行病的爆发，造成直接经济损失。乳铁蛋白在被用做治疗和预防此类疾病的过程中发挥了很大作用。饲料中含有乳铁蛋白能有效预防志贺菌属引发的兔肠道炎症(Tigyi Z.Kishore AR.Maeland JA.Forsgren A.Naidu AS.1992.Lactoferrin-binding proteins in Shigellaflexneri.Infect Immun 602619-26)、预防小猪的内毒素休克(Lee WJ，Farmer JL，Hilty M，Kim YB.1 998.The protective effects of lactoferrinfeeding against endotoxin lethal shock in germfree piglets.Infect Immun661421-6)等疾病。由于不同动物的乳铁蛋白功能强弱不等，而且直接母乳喂养不适于在大规模生产中应用。因此，采用植物基因工程手段生产出含乳铁蛋白的、可供牲畜直接食用的牧草或粗加工后的谷类作物，不仅可避免因直接应用抗生素而造成的危害，而且可极大地降低饲料成本，减少缺铁性贫血的发生率，提高幼龄动物的免疫机能和改善动物肠道微生态环境。由于乳铁蛋白和抗菌肽均为动物初乳中的天然蛋白质，因此对实现完全的绿色畜牧业有深远的影响。以植物为受体表达人乳铁蛋白已有报道。1994年Mitra A(Mitra A，and Zhang ZY，Expression of a human lactoferrin cDNA in tobacco cellsproduces antibacterial proteins.Plant Physiology 106(3)977-981，1994)等把人乳铁蛋白基因的cDNA置于35S启动子之下，经根癌农杆菌导入烟草悬浮细胞，检测到48kD不完整的蛋白。Northern Blot分析表明，转化的悬浮细胞能够合成完整mRNA，推测48kD的目标蛋白可能是翻译后修饰所致。外源蛋白在转化细胞中的含量占全部细胞蛋白的0.6-2.5％，平均为1.8％。体外抑菌试验证明，转基因烟草悬浮细胞表达的乳铁蛋白不仅对所供试的四种病原菌有抑菌活性，而且其活性比全长乳铁蛋白强。转基因植株对细菌性病原菌Ralstonia solanacearum引起的萎蔫病具有明显的延缓作用。为检测转乳铁蛋白基因植物的饲用效果，Humphrey BD等(Humphrey BD，Ning Huang and Kirk C，Klasing，Rice expressinglactoferrin and lysozyme has antivbiotic-like properties when fed to chicks，JNutr 2002，132(6)1214)做试验将转人乳铁蛋白基因的稻米与转溶菌酶基因的稻米按比例饲喂小鸡，发现十二指肠绒毛层显著高于对照，且回肠系膜和十二指肠系膜变薄，各项指标均说明转乳铁蛋白基因水稻具有替代鸡饲料中抗生素的潜力。Salmon V(Salmon V，Legrand D，SlomiannyMC等，Production ofhuman lactoferrin in transgenic tobacco plants.Protein Expr Purif 1998，13(1)127)构建了两个人乳铁蛋白基因表达载体，一个连接有来自基因本身的信号肽序列，另一个连接有来自红薯的信号肽。两个表达载体均能在烟草中表达，重组蛋白N末端与来自人乳的乳铁蛋白相同，但糖链组成不一样，在重组蛋白中含有植物特有的木糖，但没有唾液酸。Anzai H(Anzai H，Takaiwa F and Katsumata K Production of human lactoferrin intransgenic plants.Abstract book of international molecular farming conference，1999，Canada)把人乳铁蛋白基因转入水稻和番茄，在水稻谷蛋白启动子控制下，成功地获得了在水稻种子中特异表达的乳铁蛋白。在转基因番茄果实中，也检测到乳铁蛋白表达。将人乳铁蛋白基因直接转入植物体内具有以下优点一是表达的产物尽管在糖基化修饰方面与天然蛋白存在差异，但由于其结构较完整，可以在体内稳定存在；二是表达的蛋白供牲畜食用时，在胃肠道内可降解成多肽，具有一定的抗菌能力。但是通过对乳铁蛋白多年的研究表明，乳铁蛋白发挥抗菌作用的形式主要是由于其水解后形成的多肽产物。人乳铁蛋白抗菌肽具有高出人乳铁蛋白本身三十倍的抑菌效果，牛乳铁蛋白抗菌肽(Bovine lactoferrincin，简写为Lfcin B)具有高出牛乳铁蛋白本身三百倍的抑菌效果，而牛乳铁蛋白的抑菌效果是人乳铁蛋白的1.5倍(Elass-Rochard E，Roseana A，Legrand D，Trif M，Salmon V，Motas C，Montreuil J，Spik G.1995.Lactoferrin lipopolysaccharide interactionsinvolvement of the 28-34 loop region of human lactoferrin in the high affinitybinding to E.coli O55B5 lipopolysaccharide. Biochem J 3 12839-45；Yamauchi K，Tomita M，Giehl TJ，Ellison RT 3d.1 993.Antibacterial activityof lactoferrin and a pepsin-derived lactoferrin peptide fragment.InfectImmun 61719-728)。因此，将牛乳铁蛋白抗菌肽基因直接转化入植物体内有可能提高植物的抗菌、抗病毒能力。国际上还未见此类研究的报道。

本发明的目的是通过基因工程手段提供一种抗植物病毒和抗细菌病害的方法。该方法包括以下步骤1.将牛乳铁蛋白抗菌肽基因(Lfcin B)进行一系列遗传密码子改造，与来源于马铃薯蛋白酶抑制因子II的信号肽序列连在一起克隆到中间载体上；2.将目的基因克隆到转化载体上，通过农杆菌转化法导入烟草；3.在选择培养基上筛选出抗性愈伤，诱导后形成胚状体或不定芽，发育成苗后进行分子生物学检测；4.将分子生物学检测呈阳性的植株进行抗细菌和抗植物病毒的实验研究，发现转基因植株抗菌能力和抗植物病毒的能力得到了明显提高。
技术特征1.将牛乳铁蛋白抗菌肽基因(Lfcin B)进行一系列遗传密码子改造，选择植物通用遗传密码子，添加起始密码子ATG和终止密码子TGA，添加Kozak序列AACA，为保证ATG后的碱基是G从而有利于翻译起始，在多肽前增加了两个氨基酸-谷氨酸和色氨酸，在基因的5’上游添加SacI和BglII两个限制性核酸内切酶切点，在基因的3’上游添加XbaI和Bst EII两个限制性核酸内切酶切点。将合成的两条单链DNA通过末端34个互补碱基退火、补平、及PCR技术形成末端凸出一个碱基A的典型PCR产物，克隆到T-Easy载体上(购自Promega公司)。利用PCR技术将来源于马铃薯蛋白酶抑制因子II的信号肽序列扩增出来，使其刚好插入到Lfcin B的上游，使二者处于同一阅读框中，构建好的中间载体命名为T-Easy-slfc。
2.用引物将含有信号肽的目的基因(slfc)扩增出来，5’端添加NcoI酶切位点。用NcoI和BstEH双酶切slfc和植物转化载体p3301(来自澳大利亚CAMBIA)，其产物用T4 DNA连接酶过夜连接(16℃)。用连接产物转化大肠杆菌，在含有卡那霉素的培养基上筛选出阳性克隆。提取阳性克隆的质粒DNA，进行PCR鉴定。结果在以阳性克隆为模板的扩增反应中均出现了负对照没有的390bp大小的目的基因片段(slfc)。提取质粒DNA转化入农杆菌LBA4404感受态细胞，进行PCR鉴定。利用叶盘法将目的基因转入烟草中。将含有表达载体的农杆菌接种于YEB培养基(含卡那霉素Km 100ug/ul，链霉素Sm 125ug/ul)，28℃振荡培养至OD600为0.6-0.8，室温离心10分钟(4000rpm)。沉淀用MS盐溶液(pH7.0)悬浮，并稀释至原体积的30-40倍。取烟草无菌苗叶片，切去叶片边缘和主脉，将叶片切成0.4×0.6cm2大小，在制备好的菌液中浸泡5-10min，用无菌滤纸吸干表面菌液，转入表面铺有一层滤纸的培养基(1升MS基本培养基中加30g蔗糖，8g琼脂，3mg 6-BA，0.2mg NAA，pH5.8)中28℃暗培养。三天后，转到添加有除草剂ppt(10ug/ml)和Cef(250ug/ml)的培养基(1升MS基本培养基中加30g蔗糖，8g琼脂，3mg 6-BA，0.2mgNAA，pH5.8)中培养，每日光照12-16小时，28℃培养。
3.每2-3周继代一次，每次将变黄的叶片和愈伤丢掉，大的愈伤切割成小块，经二到三代继代培养的愈伤组织陆续分化出幼苗。将幼苗转移入装有培养基(1升MS基本培养基中加30g蔗糖，8g琼脂，pH 5.8)的罐头瓶中28℃培养，待其根系发育完全后，移栽到温室中。首先进行总DNA的PCR检测，采用CTAB提取法提取微量DNA，反应体系为10×buffer，5ul；模板DNA，2ul；Sp5-NcoI，1ul；P2，1ul；dNTPmixture(25uM)，1ul；Taq DNA polymerase(5U/ul)，0.2ul；ddH2O补至50ul。反应条件94℃ 5min/94℃ 30s，65℃ 1min，72℃1min(35cycles)/72℃7min/4℃存放。取PCR产物10ul进行电泳检测。用SDS法大量提取植物总DNA，HindIII酶解过夜，经电泳及转膜后进行探针标记和杂交，-70℃放射自显影，Southern分析证明目的基因slfc已经整合到烟草基因组中。进一步提取植物总RNA，反转录后在一定条件下进行RT-PCR反应。
4.对分子检测呈阳性的植株进行抗烟草花叶病毒的实验和粗蛋白抗细菌实验研究。首先采用半叶接种法，取10ul(20ug/ml)烟草花叶病毒TMV滴于叶片上，用金刚砂轻轻磨擦叶表，三天后计数黄色枯斑，转基因烟草的枯斑数明显少于非转基因烟草，且病斑直径较小。在无菌条件下提取烟草叶片蛋白，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。待测定的粗蛋白经稀释后，以相同的反应体系测出OD值，由标准曲线图上测算的曲线方程计算出蛋白浓度，然后计算出2.5ml培养液中应加的体积数，以确保终浓度分别为1mg/ml和1.5mg/ml。通过与细菌共培养进行抑菌实验1)挑取单克隆试验菌株于液体培养基中培养过夜；2)测定菌液OD600值，用液体培养基调节菌液浓度至OD600为0.4左右；3)取1ml菌液于试管中，添加适当的粗蛋白提取液和液体培养基，使终容积为2.5ml，粗蛋白含量为1mg/ml和1.5mg/ml；4)在37℃摇床上振荡培养过夜。
5)取100ul菌液进行系列指数稀释，分别取四个稀释级别涂于不同的平板上，37℃倒置培养过夜；计数菌落以测定菌液浓度。结果显示的叶片粗蛋白对DH5α和金黄色葡萄球菌都有明显的抑制，当未转基因的粗蛋白在终浓度为1mg/ml时，DH5α菌液浓度高出转基因植株2-4个数量级；当未转基因的粗蛋白在终浓度为1.5mg/ml时，DH5α菌液浓度高出转基因植株1-2个数量级。


图1牛乳铁蛋白抗菌肽序列改造图，序列第一行为说明及对应的氨基酸序列，第二行为改造后的序列，下方对应的是牛乳铁蛋白抗菌肽的基因序列；方框内为起始密码子和终止密码子，两侧分别增加两个酶切位点，四个保护碱基；改造的密码子用下划线标出。
图2p3301转化载体图谱。
图3再生植株的slfc基因PCR扩增片段电泳图，其中0+正对照，质粒p3301-SLFC；M1kb Ladder；0-负对照，未转基因的烟草；1-10分别编号SLFC1-SLFC10的转基因烟草。
图4再生植株的slfc基因Southem blotting分析结果图，其中，+正对照，质粒p3301-SLFC经EcoRI酶切；-负对照，未转基因烟草；S1-S10PCR检测阳性的烟草SLFC1-SLFC10。
图5再生植株的slfc基因RT-PCR分析电泳图，其中S1-S3分别为转基因烟草SLFC1-SLFC3；M1kb Ladder；+质粒p3301-SLFC；-未转基因的烟草苗。
图6转基因烟草对TMV的抗性图，其中左侧为未转基因烟草(Con3)，右侧为转基因烟草SLFC2。
图7转基因烟草粗蛋白对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑制，上方两个平板未转基因烟草(Con1)在粗蛋白浓度为1mg/ml时，100ul培养液按106到109倍稀释后，各取50ul铺半个平板，依次用字母A、B、C、D表示；下方两个平板转基因烟草(SLFC1)在粗蛋白浓度为1mg/ml时，100ul培养液按106到109倍稀释后，各取50ul铺半个平板，依次用字母E、F、G、H表示。

材料和方法1 菌株、植物病毒与质粒大肠杆菌(E.coli)、农杆菌LBA4404、金黄色葡萄球菌和烟草花叶病毒(TMV)购自博大公司。p3301转化载体图谱见图2，购自澳大利亚CAMBIA。
2 工具酶及生化试剂各种限制性内切酶、T-Easy载体试剂盒、随机引物试剂盒、购自Promega公司；dNTP混合物购自Takara公司；T4 DNA连接酶购自BioLabs；T4 DNA聚合酶购自Takara公司；6-BA、萘乙酸、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Km)、链霉素(Sm)和噻孢霉素(Cef)购自欣经科公司；除草剂购自日本明治公司；同位素α-32P dCTP购自北京亚辉生物公司；尼龙膜购自Amersham公司。
3 仪器PCR扩增仪(GeneAmp PCR System 9700)；4 培养基YEB液体培养基(1升)1g酵母提取物，5g牛肉膏，5g蛋白胨，5g蔗糖，0.5g MgSO4.7H2O，pH7.5YEB固体培养基(1升)YEB液体培养基1升加15g琼脂MS基本培养基MS大量元素，MS微量元素，MS有机物，各组份的基本成分参照组织培养方法。
MS盐溶液只含有MS大量元素和微量元素培养基I(MS固体培养基)1升基本培养基中加30g蔗糖，8g琼脂，pH5.8培养基II(烟草分化固体培养基)1升基本培养基中加30g蔗糖，8g琼脂，3mg 6-BA，0.2mg NAA，pH 5.85 PCR引物引物P15′ACG GGA GCT CAG ATC TTC AAC A 3’(SEQ ID No1)引物P25′AGC TGG TCA CCT CTA GAT CAG AAG 3’(SEQ ID No2)Sp5-MluI5’ACA CGC GTA CAG ACA CTC TTC ACC CC 3’(SEQID No3)
Sp3-BglII5’AGA GAT CTA GCC TTC GCA TCA ACA TG 3’(SEQID No4)Sp5-NcoI5’TTC CAT GGA CAG ACA CTC TTC ACC CC 3’(SEQID No5)Sig-P15’ACA GAC ACT CTT CAC CCC AA 3’(SEQ ID No6)Sig-P25’AGC CTT CGC ATC AAC ATG CT 3’(SEQ ID No7)由上海生工合成。
下述实施例是为了更详细地解释本发明，但不应理解为本发明局限于此。
实施例1 牛乳铁蛋白抗菌肽基因的改造和克隆1、密码子的改造改造的原则1)选择玉米常用遗传密码子，改造后的序列见图1；2)添加起始密码子ATG和终止密码子TGA；3)添加Kozak序列AACA；4)为保证ATG后的碱基是G，增加了两个氨基酸，从而增加了肽段的长度，增加的两个氨基酸与乳铁蛋白相应位置的氨基酸一致；5)在肽段的两侧各添加两个限制性核酸内切酶切点。改造后的序列如SEQ ID No82、牛乳铁蛋白抗菌肽基因的克隆由上海申友合成两条长单链DNA，第一链5’-ACGGGAGCTCAGATCTTCAACAATGGAGTGGTTCAAGTGCCGCCGCTGGCAGTGGCGCATGAAGAAGCTGGGCGCCCCCA3’(SEQ ID No9)第二链5’-AGCTGGTCACCTCTAGATCAGAAGGCGCGGCGCACGCAGGTGATGCTGGGGGCGCCCAGCTTCTTCATGCGCCACTGCCA3’
(SEQ IDNo10)两条链退火补平，成为双链的牛乳铁蛋白抗菌肽编码序列。
退火补平条件第一链50uM 1ul第二链50um 1ulTaq DNA聚合酶 0.5ulMgCl2(25uM)3ul10×Buffer 5uldNTP混合物 2ul补水至终体积50ul将混合好的Eppendorf管置于94℃热水浴的烧杯中，热水温度逐渐下降至65℃，取出Eppendorf管置冰上5min。以此产物做模板，进行PCR扩增(片段大小为126bp)引物P1(10um) 1ul引物P2(10um) 1ulTaq DNA聚合酶 0.5ulMgCl2(25uM) 3ul10×Buffer 5uldNTP混合物 1ul补水至终体积 50ul反应条件94℃，5min/94℃，30s；59.2℃，50s；72℃，1min(35个循环)/72℃，7min/4℃，保存。
参照载体说明书将PCR产物克隆到T-Easy载体上。
实施例2、转化载体的购建首先从马铃薯基因组中扩增出蛋白酶抑制因子II的信号肽基因。由GeneBank已知马铃薯蛋白酶抑制因子II的基因序列参见X04118，其信号肽序列从第891个碱基至第1150碱基处，中间有一内含子，其位置是第993碱基至第1109碱基。使用引物sig-P1和引物sig-P2扩增出276bp的包括信号肽基因的片段，直接克隆到T-Easy载体上，形成的质粒命名为T-Easy-sig。
用引物Sp5-MluI和Sp3-BglII从载体T-Easy-sig上扩增出目的信号肽基因，由于两端添加了限制性内切酶位点，因此大小变为292bp，与载体T-Easy-lfc一起进行MluI和BglII双酶切；酶切产物电泳回收相应约3kb大小的片段，连接后转化入大肠杆菌DH5α，新形成的质粒为T-Easy-slfc，含有完整的信号肽和乳铁蛋白抗菌肽，且信号肽基因刚好插入到目的基因的上游，并且置于同一阅读框中。再用引物Sp5-NcoI和P2将slfc基因扩增出来，大小约390bp，将该片段和P3301载体分别用NcoI和BstEII双酶切后电泳回收相应约390bp和9.6kb的片段，回收产物用T4 DNA连接酶过夜连接(16℃)。连接产物转化大肠杆菌，在含有卡那霉素的培养基上筛选出阳性克隆。提取阳性克隆的质粒DNA，进行PCR鉴定。结果在以阳性克隆为模板的扩增反应中均出现了负对照没有的390bp大小的目的基因片段(slfc)。由此证明，slfc基因已被成功构建到植物转化载体p3301上。
从马铃薯基因组中PCR扩增信号肽基因植物总DNA 3.0ulSig-P11.0ulSig-P21.0uldNTP混合物(25uM)1.0ulTaq DNA聚合酶(5U/ul) 0.5ul10×buffer 5ul总体积 ddH2O补至50ul反应条件94℃ 5min/94℃ 30s，62℃ 40s，72℃ 40s(35个循环)/72℃7min/4℃保存。
从T-Easy-sig中PCR扩增信号肽基因T-Easy-Sig DNA1.0ulSp5-MluI1.0ulSp3-BglII 1.0uldNTP混合物(25uM) 1.0ulTaq DNA聚合酶(5U/ul) 0.5ul10×buffer5ul总体积ddH2O补至50ul反应条件94℃5min/94℃30s，48℃40s，72℃40s(10个循环)/94℃30s，65℃40s，72℃40s(25个循环)/72℃7min/4℃保存。
从质粒T-Easy-SLFC中扩增slfc基因T-Easy-SLFC DNA 1.0ulSp5-NcoI 1.0ulP2 1.0uldNTP混合物(25uM) 1.0ulTaq DNA聚合酶(5U/ul)0.5ul10×buffer 5ul总体积 ddH2O补至50ul反应条件94℃5min/94℃30s，53℃40s，72℃40s(10个循环)/94℃30s，65℃40s，72℃40s(25 cycles)/72℃7min/4℃保存。
酶切及连接反应均参照《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克编，冷泉港实验室，2001年，第三版)和所用试剂的说明书。
实施例3、slfc基因在烟草中的遗传转化大量提取p3301-slfc的质粒DNA，取1ug转化农杆菌LBA4404感受态细胞，28℃、YEB培养基(含Km和Sm)上培养两天。挑选两个克隆做菌液的PCR鉴定，均扩增出大小为390bp的目标条带。
将含有表达载体的农杆菌接种于YEB培养基(含Km 100ug/ul，Sm125ug/ul)，28℃振荡培养至OD600为0.6-0.8，4000rpm，室温离心10分钟，沉淀用MS盐溶液(pH7.0)悬浮，并稀释至原体积的30-40倍。
用叶盘法转化烟草叶片，取烟草无菌苗叶片，切去叶片边缘和主要叶脉，将叶片切成0.4×0.6cm2大小，外植体在制备好的菌液中浸泡5-10min，用无菌滤纸吸干表面菌液，转入表面铺有一层滤纸的培养基II中28℃暗培养。三天后，转到添加有除草剂ppt(10ug/ml)和Cef(250ug/ml)的培养基II中培养，每日光照12-16小时，28℃培养。
每2-3周继代一次，每次将变黄的叶片和愈伤丢掉，大的愈伤切割成小块，经二到三代继代培养的愈伤陆续生长出幼苗。将幼苗转移入装有培养基I的罐头瓶中28℃培养，待其根系发育完全后，移栽到温室中。
实施例4、转基因植物的分子检测1、PCR检测DNA微量提取在一装有400ul冰冷的CTAB提取缓冲液(不含β-巯基乙醇)的Eppendoff管中用圆玻璃棒磨碎约1-2cm2的新鲜幼嫩叶片。加入500ul 65℃预热的CTAB提取缓冲液(含β-巯基乙醇)混匀，65℃保温90min，不时颠倒混匀。待冷至室温后加入450ul氯仿/异戊醇，颠倒混匀至溶液呈乳浊状---但不要振荡。离心2min分层。将液相转移至一干净的Eppendoff管中，加入3ul RNase A，室温下保温30min。加入600ul异丙醇，颠倒混匀。微量离心机中离心10min沉淀DNA，去上清。依此用800ul 76％乙醇，0.2mol/L乙酸钠和100ul 70％乙醇洗涤沉淀。离心沉淀5min，然后吸去残留的乙醇。抽真空泵干燥DNA，最后把DNA溶解于50ul TE缓冲液中，4℃保存。
植物总DNA 2.0ulSp5-NcoI1.0ulP2 1.0uldNTP混合物(25uM)1.0ulTaq DNA聚合酶(5U/ul) 0.2ul10×buffer 5ul总体积 ddH2O补至50ul反应条件94℃ 5min/94℃ 30s，65℃ 1min，72℃ 1min(35个循环)/72℃7min/4℃保存。取PCR产物10ul进行电泳检测。以质粒p3301-SLFC1为正对照，未转基因植株为负对照，在大部分样品中都有大小为390bp的目的基因条带，而负对照则没有。结果如图4，其中0+正对照，质粒p3301-SLFC；M1kb Ladder；0-负对照，未转基因的烟草；1-10分别编号SLFCl-SLFC10的转基因烟草，均有或强或弱的条带。
2、Southern杂交SDS法大量提取烟草总DNA，在1.5ml Eppendorf管中进行酶解加入以下组分基因组DNA 15-30ug10×Buffer 10ulHindIII内切酶 10ulddH2O 补充水到100ul37℃酶解12小时，取1ul电泳检测是否酶解完全，如不完全，则补加酶和Buffer；酶切完成后，电泳、转尼龙膜。4℃保存或直接用于杂交。标记探针PCR制备的lfc片段(约100bp)30ng，用灭菌水补至32ul，沸水中变性5min，冰浴5min。按Promega公司的Prime-a-Gene Labelling System Kit明，依此加入5×Labelling Buffer 10uldA.T.G(0.5mM each)2ulBSA(10mg/ml) 2ulKlenow片段(5units/ul) 1ulα-32P dCTP(10uCi/ul)3ul总体积50ul37℃保温三个小时，沸水中变性10min，冰浴10min，备用。预杂交和杂交5×SSC预湿的杂交膜放入杂交管，带有DNA的一面向里，加入10ml预热到65℃C的Church缓冲液(含1％BSA，1mM EDTA，0.25MNa2HPO4-NaH2PO4(pH7.2)，7％SDS)预杂5hr，加入变性好的探针，于65℃杂交16h以上。杂交结束后，依此用2×SSC+0.5％SDS，1×SSC+0.5％SDS，0.5×SSC+0.5％SDS，0.1×SSC+0.1％SDS在65℃洗膜，每次15min，洗完后，滤纸吸干膜表面的水分，保鲜膜包好，放入暗盒，-70℃放射自显影，自显影的时间根据信号强弱而定。
对PCR阳性的部分植株进行Southern杂交(图5)。X-光片上出现的信号条带用箭头标出。说明目的基因已整合到烟草基因组中，在植株SLFC6中有明显的多个插入位点。
3、RT-PCR提取植物总RNA，进行反转录试剂体积(ul)DEPC-H2O 5.25×Buffer 4MgCl24.8dNTP混合物(每个10uM)1Oligo dT-Adaptor1RNA 3ImProm-IITM反转录酶1总体积 20
反应条件参照Promega公司ImProm-IITMReverse Transcriptase使用说明书，[25℃ 5min/42℃ 1-1.5hr/70℃ 15min]1个循环，然后进行RT-PCR，H2O 77.5ul10×Buffer 9uldNTP 1ul引物Sp5-NcoI 1ul引物P2 1ulEx-Taq 0.5ul反转录产物 10ul总体积数 100ul反应条件94℃ 5min/94℃ 30s，68℃ 40s，72℃ 40s(35个循环)/72℃7min/4℃保存。
在对基因组PCR呈阳性的植株进行RT-PCR时，均得到产量较高的PCR产物，大小约280bp，由于信号肽中含有110bp的内含子，而负对照中无此条带，如图6所示，其中S1-S3分别为转基因烟草SLFC1-SLFC3；M1kbLadder；+质粒p3301-SLFC(由于信号肽基因中含有110bp的内含子，因此正对照的扩增片段比待检测样本的片段大110bp)；-未转基因的烟草苗。因此可以说明目的基因在转基因烟草中得到了转录。
实施例5、抗病毒实验半叶接种法，取10ul(20ug/ml)烟草花叶病毒TMV滴于叶片上，用金刚砂轻轻磨擦叶表，三天后计数黄色病斑。发现接种2-3天后，枯斑开始出现。大多数转基因植株的枯斑数明显少于对照，通常在20个左右，直径0.5-0.8mm(对照通常稍大一些，约0.8-1.2mm)；如表中所示，分别对编号CON1-CON11的11株非转基因的烟草和编号为SLFC1-SLFC11的转基因植株进行半叶接种TMV，每棵植株选取三个叶位进行对照实验，叶位1为心叶第1-2片，2为心叶第3-4片，3为心叶第5-7片。三天后计数黄色病斑，病斑数量和直径列于下表一中。但随着时间的延长，对照植株的枯斑增大明显，如图7所示，两叶片取自同一叶位的不同植株，左侧为未转基因烟草(Con3)，右侧为转基因烟草SLFC2，同时接种10ul(20ug/ml)TMV。在温室中培养第九天，非转基因植株的枯斑增大明显，而转基因植株的病斑几乎不再增大。接种同一植株不同叶位，嫩叶更容易感染TMV，且发病症状较重。
表一转基因烟草抗烟草花叶病毒TMV数据统计平均非转基因 叶位 叶位 叶位 转基因编 叶位 叶位 叶位 平均直直径编号 1 2 3号1 2 3 径(mm)(mm)CON1 4439380.8SLFC1 21 17290.5CON2 7244421.2SLFC2 13 8 200.5CON3 4456490.8SLFC3 23 20311.2CON4 6947470.8SLFC4 13 12100.6CON5 4871650.5SLFC5 13 15150.8CON6 4716391.2SLFC6 18 18130.8CON7 8453721.3SLFC7 17 26210.5CON8 4728421.0SLFC8 20 216 0.3CON9 1914391.0SLFC9 10 107 0.7CON10 8 48680.5SLFC109 104 0.6CON11 6585301.0SLFC1121 15191.0实施例6、转基因烟草粗蛋白抗细菌实验为检测转基因烟草对大肠杆菌的抑制能力，采用前述方法对10棵烟草(PCR检测均为阳性)进行抑菌实验，如表二和表三。
表二转基因烟草粗蛋白抑菌实验第一组数据(用于接菌的菌液OD600为0.3503)

表三转基因烟草粗蛋白抑菌实验第二组数据(用于接菌的菌液OD600为0.4291)

结果表明，转基因烟草对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌与都有明显的抑制作用。由表二和表三可以看出，当粗蛋白的终浓度为1mg/ml和1.5mg/ml时，菌液浓度分别比对照降低了两到三个数量级；当蛋白的终浓度从1到1.5mg/ml变化后，抑菌效果普遍增强，但也有例外，并不完全符合倍数关系。该表为一次实验数据，未进行重复，可以定性地说明转基因烟草粗蛋白对大肠杆菌DH5α有明显的抑菌作用，只有通过最小抑菌实验才能定量地说明抑菌能力。
采用上述方法对金黄色葡萄球菌的抑菌效果进行分析。发现转基因烟草粗蛋白较非转基因烟草的抑菌效果仍然显著。如图8所示，上方两个平板未转基因烟草(Conl)在粗蛋白浓度为1mg/ml时，100ul培养液按106到109倍稀释后，各取50ul铺半个平板，依次用字母A、B、C、D表示；下方两个平板转基因烟草(SLFC1)在粗蛋白浓度为1mg/ml时，100ul培养液按106到109倍稀释后，各取50ul铺半个平板，依次用字母E、F、G、H表示；显示当对照未转基因粗蛋白浓度为1mg/ml时，过夜培养的菌液经稀释后铺板，菌斑很密，无法计数。而在相同条件下，转基因植株的则可以计数。当稀释倍数变化时，菌斑数也规律性变化，说明实验中稀释的方法比较可靠。
SEQUENCE LISTING<110>中国农业大学<120>一种提高植物抗菌和抗病毒的方法<130>1030591<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>1acgggagctc agatcttcaa ca 22<210>2<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>2agctggtcac ctctagatca gaag 24<210>3<211>26<212>DNA<213>人工合成<400>3acacgcgtac agacactctt cacccc 26<210>4<211>26<212>DNA<213>人工合成
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本发明公开了一种提高植物抗菌和抗病毒能力的方法，该方法包括以下步骤1)将牛乳铁蛋白抗菌肽基因(Lfcin B)进行一系列遗传密码子改造，与来源于马铃薯蛋白酶抑制因子II的信号肽序列连在一起克隆到中间载体上；2)将目的基因克隆到转化载体上，通过农杆菌转化法导入烟草；3)在选择培养基上筛选出抗性愈伤组织，诱导出胚状体或不定芽，发育成苗后进行分子生物学检测；4)将分子生物学检测呈阳性的植株进行抗细菌和抗植物病毒的实验研究，发现转基因植株抗菌能力加强，抗植物病毒能力得到提高。