专利名称：含佐剂疫苗制剂的制作方法含佐剂疫苗制剂本发明涉及含佐剂疫苗(adjuvanted vaccine)制剂,尤其是能够增强粘膜免疫应答的流感疫苗，例如在鼻内或肌内递送后。季节性流感仍然是全世界死亡率和发病率的主要原因之一。每年进行疫苗接种是预防和控制流感感染的最有效对策。季节性流感疫苗是基于对下一季节流行病的预期株的预测而制备的。也有一些不预防感染本身的肠胃外注射的疫苗，其能够减少感染后的严重性和复杂性。肠胃外的疫苗能够诱导在血清中中和IgG抗体，但是它们不能诱导在粘膜的表面起作用的分泌型IgA抗体。相比之下，鼻内(i. η.)疫苗可诱导全身性免疫应答和粘膜免疫应答。在粘膜的膜表面上的分泌型IgA抗体对于预防感染是十分有效的，因为它们在病原体附着到上皮细胞表面(其是流感病毒感染的第一个靶点)之前在粘膜的膜表面上起作用。此外，血清IgG抗体针对漂移病毒株(drifted viral strain)不是那么有效，因为它们与分泌型IgA抗体相比具有更高的特异性。分泌型IgA抗体针对流感病毒的变异株具有交叉保护的作用。IgA的交叉反应作用的精确机制仍然是未知的，但是该现象在预防感染中是很大的优势。流感显示出改变其两种主要膜蛋白，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的 抗原特性的非凡能力。这通过在远离于人类人群中建立的适应性免疫应答的连续选择而发生。由于该病毒的高突变率，特定的疫苗制剂通常只在约一年内有作用。世界卫生组织每年整理疫苗的目录，以包括最有可能在第二年发起攻击的病毒株。现今，常规疫苗是由三种灭活的流感病毒(两种A-株和一种B株)所构成的疫苗。每年基于由WHO预期会在即将到来的流感季节中流行的流感株而重新配制这种三价流感疫苗。例如，在2007-2008年，该每年更新的三价流感疫苗由来自流感H3N2、HlNl和B流感病毒的血凝素(HA)表面糖蛋白组分组成。疫苗i.n.递送的其他优势在于，疫苗的递送不需要受过训练的卫生保健人员来进行疫苗的给药，这使得这种类型的疫苗适于患有针恐怖症(needle-phobia)的人群并且防止针刺损伤问题的发生。而且，有报道称粘膜免疫系统在生命中发育较早且不受老化的影响(McElhaney JE. Vaccine 2005 Jul 8; 23Suppl I: S10-25; Szewczuk MR et al. AnnN Y Acad Sci 1983 Jun 30;409:333-44)。因此，例如鼻内流感免疫的伴生优势在于，它能够在所有年龄段中潜在提供有效免疫，并且能够用于大规模疫苗接种。人们已经对经由鼻或口咽途径对抗流感以及利用灭活流感抗原的免疫法的各种概念进行了研究以作为对于皮下或肌肉注射免疫的更少使用针的其他选择方案。对于支持更少地使用针的方法的试验数据已经在动物模型中产生。由动物数据支持的利用灭活的流感抗原(如化学灭活整个病毒粒子，或进一步处理的病毒组分如裂解病毒，或纯化的表面抗原血细胞凝集素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)处理)经鼻内途径用于免疫的构思包括与灭活的流感抗原联合使用佐剂或免疫刺激物，或需要多疫苗接种。佐剂是增强与其混合的抗原的免疫原性的任何物质。在人类中，经由鼻内途径抗流感的成功疫苗接种仅报道了( a)活(冷适应株)流感疫苗(FluMist , Medlmmune Vaccines Inc)、(b)用大肠杆菌(E. coli)的不耐热毒素(heatlabile toxin)作为佐剂的类病毒体(virosomal)流感疫苗(NasalFlu, Berna BiotechLtd)或(c)利用大量抗原病且重复接种。虽然活疫苗能够诱导令人满意的免疫反应，但它们作为活病毒的特定性质会引起另外的安全考虑，并且可能会由于要求在上呼吸道附近发生病毒复制而诱导副作用。此外，其所要求的存储条件正在限制这些产品的商品化。大肠杆菌HLT作为佐剂的鼻内流感疫苗的使用与面瘫(贝尔麻痹)之间的密切联系导致HLT作为佐剂的类病毒体疫苗退出市场。目前，活的减弱的流感病毒疫苗(LAIV)已上市以用于i.n.给药。LAIV疫苗已经显示出既诱导全身免疫反应又诱导粘膜免疫反应。然而，FDA批准LAIV疫苗仅用于年龄为2-49岁的人，而不能用于高危人群(老年人、儿童以及长期患病的患者)(美国国家疾病控制与予页防中心(Centers for Disease Control and Prevention)http://www. cdc.gov/flu/professionals/vaccination/pdf/targetpopchart.pdf ；Belshe RB et al. Vaccine 2008 Sep 12;26Suppl 4:D10_6)。然而，大部分上市销售的流感疫苗是灭活疫苗，其可安全地经由i. η.途径给予全部人群。这些疫苗的缺点是，它们在经由该途径给药时较表现出弱的免疫原性(Vaccine 2007 Jul 20; 25 (29) : 5367-73;Eyles et al. , BioDrugs 2000Jan;13(I):35-59)。为了增加免疫原性，灭活流感疫苗需要佐剂以在经由i.n.途径给药时加强免疫反应。目前用于i.n.免疫法的若干佐剂正在开发之中，如病毒样颗粒(MatassovD et al.Viral Immunol 2007Sep;20 (3):441-52), ISCOMS (Sjolander S etal. Vaccine 2001 Jul I6; I9 (28_29) : 4072_80)、脂类、核酸类(Joseph et al. Vaccine2006 May I; 24 (18) : 3990-4006)、以及细菌组分(Haan et al. Vaccine 2001 Apr6; 19 (20-22) : 2898-907; Plante et al. Vaccine 2001 0ctl2; 20 (1—2) : 218—25)。然而，许多佐剂系统的发展受到安全性和管理问题的妨碍。例如，有效的细菌佐剂如LT (大肠杆菌的不耐热毒素)已在人类中表现出严重的副作用(Mutsch et al. N Engl J Med 2004 Feb26; 350 (9) : 896-903)。已建议用于流感疫苗的含铝盐佐剂在生产时不仅需要额外的混合步骤从而减慢总体生产，而且包含这些盐还与各种问题相关。例如，它们的不溶性意味着吸附的抗原从混悬剂中沉降，因此从大量疫苗制备单个剂量时就需要加倍小心。此外，抗原与盐结合使最终的疫苗质量控制变得更为复杂。尤其是，对流感疫苗的一些效能测试基于需要非结合抗原的体外免疫测定，即吸附至佐剂意味着不能使用这些测试。最近，更多地关注于免疫应答的表型即Thl、Th2或均衡应答。经由i. η.途径给予的亚单位疫苗以及许多鼻佐剂如壳聚糖、ISC0MS、脂类以及LT诱导混合的Thl/Th2型应答。然而，认为Thl应答要优于Th2或混合应答，因为它I)导致更好保护而免受感染；且2)通过分泌INF-γ而有助于病毒中和作用。此外，自然感染也诱导Thl型应答。另外，在粘膜膜表面上的分泌型IgA抗体对于预防感染是十分有效的，重要的是，分泌型IgA抗体对流感病毒的变异株具有交叉保护的作用，而且该粘膜免疫系统在生命中发育较早且不受年龄增加的影响。因此，对于对人类有效、安全且易于被管理机构批准的佐剂有明确的需求。优选地，能够诱导粘膜免疫应答如分泌型IgA抗体和/或偏向Thl型免疫的应答的疫苗是合乎需要的。因此本发明的目的在于提供另外的且改进的含佐剂流感疫苗(用于大范围流行和大范围流行之间)，优选适合于鼻内和/或肌内给药的疫苗。另一个目标在于提供用于便于制造且符合成本低廉的每年再配制的流感疫苗的灵活方法。人们发现，以上目标可以通过将抗原与获自革兰氏阳性细菌的灭活的肽聚糖颗粒共配制而得到满足。该颗粒不仅高效增强鼻内给予亚单位疫苗的免疫原性，而且还诱导分泌型IgA并将应答从均衡免疫应答调整到偏向Thl的免疫应答。与仅用亚单位流感病毒的常规肌内免疫相比，鼻内递送诱导与其相当的全身性免疫以及甚至超级的粘膜和细胞介导的免疫。可以通过简单混合抗原和细菌颗粒实现保护效应。因此，本发明涉及含佐剂疫苗制剂，包含(i)获自革兰氏阳性细菌的肽聚糖微粒，和(ii)至少一种抗原或其抗原制剂，其抗原或抗原制剂不是融合的或者是相反地共价连接于蛋白质的肽聚糖结合部分。可包含任何已知的或尚有 待发现的保护性抗原或其抗原片段，例如病毒、细菌、寄生或酵母来源。在一种实施方式中，抗原是病毒抗原，如乙型肝炎表面抗原或流感病毒抗原。在另外的实施方式中，该制剂包含细菌抗原，优选至少两种细菌蛋白质抗原或其抗原制剂，其抗原或抗原制剂不是融合的或者是相反地共价连接于蛋白质的肽聚糖结合部分。可包含任何已知的或尚有待发现的两种或多种蛋白质抗原或其抗原片段的保护性组合，如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原 PpmA、SlrA、IgAl 蛋白酶、PspA、CbpA> PdBD或其它的组合,或鼠疫耶尔森氏菌属(Yersinia pestis)抗原LcrV、FI、FliC的组合，或III型分泌途径抗原如LcrV、IpaB和D、SipB和D、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、志贺菌属(Shigella))的YopD的组合，或肠毒素大肠杆菌(enterotoxic Escherichia coli,ETEC)的LT和ST抗原的组合或其他细菌蛋白质抗原的组合。一方面，本发明提供包含PspAXbpA和/或PdBD的保护性制剂。特别令人感兴趣的是本发明的肺炎球菌三价疫苗制剂，其中细菌蛋白质抗原是PspAXbpA和PdBD。在与获自革兰氏阳性细菌的肽聚糖微粒混合后，发现该3种抗原的混合剂在感染肺炎链球菌的鼻内激发小鼠模型中提供了很好的保护。出人意料的是，在混合之后的保护活性比在抗原经由融合结合于蛋白质肽聚糖结合部分时更高(参见本文中下文的实施例12和图16)。并且，抗原的特定组合表现出对于保护活性的关联性，因为在与结合的抗原相比，与混合肽聚糖颗粒时包含抗原PpmA、IgAl蛋白酶、PspA、CbpA和PsaA的五价制剂是相对低的。参见实施例13和图17。在另外的实施方式中，该制剂包含至少一种寄生抗原或其抗原制剂，其抗原或抗原制剂不是融合的或者是相反地共价连接于蛋白质的肽聚糖结合部分。可包含任何已知的或尚有待发现的保护性寄生抗原或其抗原片段，如恶性痕原虫(Plasmodium falciparum)的环子孢子表面抗原或裂殖子表面抗原。示例性的保护性真菌抗原包括球孢菌属(Coccidioides ssp)的抗原。适合的酵母抗原是假丝酵母(Candida ssp)的抗原。还提供了含佐剂疫苗制剂，包含获自革兰氏阳性细菌的肽聚糖微粒和至少一种多糖抗原或其抗原制剂，其抗原或抗原制剂不是融合的或者是相反地共价连接于蛋白质的肽聚糖结合部分。可包含任何已知的或尚有待发现的保护性多糖抗原或其抗原片段，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、金色葡萄球菌荚膜多糖或其他多糖。在一种优选的实施方式中，本发明提供了含佐剂流感疫苗制剂，包含(i )获自革兰氏阳性细菌的肽聚糖微粒，和(ii)至少一种流感病毒抗原或其抗原制剂，其抗原或抗原制剂不是融合的或者是相反地共价连接于蛋白质的肽聚糖结合部分。在另外的实施方式中，本发明提供了含佐剂乙型肝炎疫苗制剂，包含(i)获自革兰氏阳性细菌的肽聚糖微粒，和(ii)至少一种乙型肝炎病毒抗原(例如病毒的包膜蛋白，如乙型肝炎表面抗原(HBsAg))或其抗原制剂，其抗原或抗原制剂不是融合的或者是相反地共价连接于蛋白质的肽聚糖结合部分。在另外的实施方式中，本发明提供了含佐剂肺炎球菌疫苗制剂，包括(i)获自革兰氏阳性细菌的肽聚糖微粒，和(ii)至少一种肺炎球菌抗原，优选PdBD，更优选PspA、CbpA和PdBD，其抗原不是融合的或者是相反地共价连接于蛋白质的肽聚糖结合部分。可以通过本领域已知的方法获得用于根据本发明的疫苗肽聚糖微粒。参见例如WO 02/101026以及US 6，896，887，公开一种用于获得革兰氏阳性细菌的细胞壁物质的方法，包括用能够去除细胞壁组分(如来自所述细胞壁物质的蛋白质、(脂)磷壁酸((Iipo)teichoic acid)或碳水化合物)的溶液处理所述细胞壁物质,其中所述细胞壁物质基本包括球形肽聚糖微粒。细胞壁物质没有被机械破碎，以产生反映革兰氏阳性细菌的大小与形 状的球形肽聚糖微粒。该颗粒是无生命的，表面蛋白和细胞内的内容物被完全剥夺。然而厚的肽聚糖细胞壁被完整保留，并提供结构刚性以构成细菌形状的约I μ m大小的肽聚糖球，其被称为革兰氏阳性增强子(GEM)颗粒。在粘膜佐剂发展的领域中的主要障碍是证明它们的安全性，以便获得管理机构的批准。与用于免疫的所评价的其他佐剂和其他乳酸菌系统相比，在本研究中使用的颗粒是使用安全的。在颗粒生产期间，用酸处理细菌导致遗传物质的损失。由于可避免由细菌引起的粘膜层的DNA脱落和感染问题，因此遗传物质的损失是有利的。此外，该颗粒由用于生产奶制品并且被认为是GRAS (公认安全的)生物体的细菌产生。已经在临床前GLP毒性研究中用兔子鼻内测试GEM颗粒，并且没有报道不利事件。因此，可以认为GEM颗粒是用于人类粘膜应用的安全候选佐剂。在一种实施方式中，疫苗制剂包含获自食品级细菌，优选乳酸细菌的微粒。优选地，微粒获自食品级细菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis), 一种非病原性、非定植(non-colonizing)的革兰氏阳性细菌。此外,乳酸乳球菌(L. lactis)被管理机构批准用于人类并且被认为是GRAS (—般认为是安全的)生物。在一种实施方式中，肽聚糖颗粒通过在酸中加热乳酸乳球菌，接着用磷酸盐缓冲液洗漆而产生(van Roosmalen ML et al. Methods2006 Feb;38(2):144-9)。该颗粒作为用于疟原虫抗原和肺炎球菌抗原的粘膜疫苗的抗原载体而被研究，因为它们具有提高的对于与包含肽聚糖结合区域的蛋白质物质结合的能力(如AcmA细胞壁结合区域或同系物(homolog)或其功能衍生物)。这些研究证明，与GEM颗粒连接并在GEM颗粒上展示的抗原比单独抗原诱导更高的免疫应答。在本领域中一般认为，抗原在载体颗粒上的固定和最优表面展示对于佐剂效应而言是重要的。本发明的研究出人意料地显示，不同于抗原结合至颗粒的早期研究，肽聚糖颗粒与(一种或多种)抗原的简单混合显著地增强了抗原的免疫原性。而且，在某些情况下，在与颗粒混合后，与连接/固定至颗粒上相比，可以实现更好的保护活性。如本文中使用的表达“其抗原或抗原制剂不是融合的或者是相反地共价连接于蛋白质的肽聚糖结合部分”意在将本发明与现有技术区分开，在现有技术中抗原部分通过融合或者通过将抗原连接在也被称为“蛋白质锚”或“锚蛋白(Protan)” (PA)的蛋白质物质上而连接于肽聚糖微粒，其典型地包括AcmA细胞壁结合区域或同系物或其功能衍生物的至少一个重复，但优选两个或三个重复序列。例如，EP 1395648公开了用于将AcmA型蛋白质锚融合物结合至微生物的细胞壁物质的方法。WO 2007/011216涉及负载有抗原的载体复合物，其包含至少一种连接于免疫原性载体的双功能多肽，所述双功能多肽包含肽聚糖结合区域(PBD)，多肽通过该肽聚糖结合区域连接于所述载体、融合至结合于至少一种感兴趣抗原的抗原结合区域(ABD)。在一种优选实施方式中，抗原是流感病毒抗原。如本文中下文所示，出人意料地发现根据本发明的基于GEM的i.n.流感疫苗引起了朝向Thl表型的应答偏移(responsebias)。人们发现，鼻内给予用GEM颗粒作为佐剂的亚单位疫苗(其与疫苗简单混合)能够用于初期强化免疫策略以诱导保护水平的HI效价(>2log5. 3，)，其被认为是重要的保护性关联。此外，基于GEM的i.n.流感疫苗 在致命激发之后是完全保护性的。此外，血清IgG结果明确强调GEM颗粒增强i.n.给药的流感亚单位疫苗的免疫原性。除了重要的血清应答之夕卜，GEM作为佐剂的i. η.疫苗引起强烈的粘膜免疫应答，即在呼吸道粘膜中分泌slgA。在鼻黏膜中诱导的SlgA的显著性水平显示GEM颗粒充当鼻黏膜中的免疫增强剂。鼻黏膜的免疫系统由鼻相关的淋巴组织(NALT)组成。在NALT中，抗原被M细胞摄取，然后呈递给抗原呈递细胞，其又将抗原片段呈递至下面的B细胞和T细胞。这种事件的级联对于针对流感病毒的初期先天性免疫应答和适应性免疫应答是必需的。我们的结果显示，与GEM颗粒混合的流感单位型疫苗的i. η.免疫比仅用疫苗的i. m.和i. η.免疫诱导鼻黏膜中的更高slgA水平。在NALT中slgA抗体的诱导可能是由于与存在于GEM颗粒中的肽聚糖的TLR-2 (Toll样受体)的相互作用，正如已知在体外研究中GEM颗粒起到TLR-2激动剂的作用。而且，已知GEM颗粒能在体外激活树突细胞和巨噬细胞的成熟(Audouy SA, et al. Vaccine 2007Mar22; 25 (13) : 2497-506)。因此，TLR-2的激活和树突细胞的成熟都可有助于更强的粘膜免疫应答。最近，更加强调免疫应答的表型即Thl、Th2或均衡应答。认为Thl应答优于Th2或混合应答，因为它I)引起更好的保护以避免感染；2)在病毒中通过分泌INF-Y而帮助中和。此外，自然感染也诱导Thl型应答。然而，经由i.n.途径给药的亚单位疫苗以及许多鼻佐剂如壳聚糖、ISC0MS、脂类和LT，诱导混合的Thl/Th2型应答。相比之下，根据本发明的i.n.流感疫苗诱导朝向Thl型的应答偏移。因此，GEM颗粒将应答从均衡应答调整到Thl偏移应答。而且，与必须是预先配制的大部分其他佐剂系统相比，本文中提供的疫苗制剂更加便于生产。用于这些实验的制剂通过将GEM颗粒与常规的亚单位疫苗混合而制备。GEM颗粒能在无菌的条件下被大量生产，并且能够在环境温度中长期储存。配制和给药的方便使i. n. GEM流感亚单位疫苗成为有希望的用于流行和传染疫情免疫的候选物。如在实施例I至8中所证明的，本发明发明人示出了，与仅用亚单位流感疫苗的i.m.免疫相比，用GEM颗粒作为佐剂的i.n.流感疫苗诱导可比得上全身性免疫的以及更强的粘膜和细胞介导的免疫。尤其是，在第一次强化免疫接种之后，与仅用亚单位流感疫苗i.m.免疫相比，诱导可比得上由HI效价所测量的免疫保护水平。重要地，它诱导更高的slgA水平，其在上呼吸道的流感感染期间是第一道防线。此外，它引起认为能够提供超级保护的偏移的Thl型免疫应答。另外，显示了这些免疫应答提供对用基于GEM的鼻内流感疫苗免疫的小鼠的完全保护。实施例7 (图9和图10)示出了口服给予流感疫苗组合物的效能。实施例8 (图11)显示，肌内给予基于GEM的流感疫苗能够用于在呼吸道或其他粘膜层的粘膜内层中引起高的slgA水平。此外，肌内途径能够用于与GEM颗粒混合的流感疫苗，以显著增加普通肌内基准疫苗(benchmark vaccine)的潜能,或以显著方式(图12)减少抗原数量(抗原剂量节约)。可以认为GEM颗粒对于i.n.、i.m.、或者口服递送的流感疫苗是安全且有效的佐剂。其他适合的病毒抗原包括呼吸道合胞病毒(RSV)蛋白，例如RSV融合(F)、和附着(G)糖蛋白或其相应部分或组合，如嵌合FG蛋白(J Virol. 1991July; 65 (7) : 3789-3796)。RSV感染已成文长期且有害的全球性问题，包括美国、欧洲、澳大利亚和日本。在早产儿、幼儿和老年人中，以及对于有较弱免疫系统的所有个体而言确实是特别麻烦的。据估计，约三分之二的I岁以下的儿童，以及几乎所有的I至4岁之间的儿童都被RSV感染过至少一次，大多数在无需医学关注的情况下恢复。然而，其中的5-10%存在持续很长时间的严重感染，这被认为是诱发哮鸣和哮喘样症状的因素。待与肽聚糖颗粒混合的其他感兴趣的抗原包括人类免疫缺陷病毒(HIV)蛋白，尤其是暴露在HIV信封样gpl20、gpl40或gpl60表面上的糖蛋白。Gpl20对病毒进入细胞是至关重要的，因为它在寻找用于进入的特异细胞表面受体方面发挥关键作用。 本文中提供的含佐剂流感疫苗制剂包含至少一种流感病毒抗原或其抗原制剂。例如，它包含流感蛋白或其片段和/或包含流感蛋白或其片段的融合蛋白(假如它未融合到肽聚糖结合区域)。本发明的异源性蛋白可包括感兴趣的任何流感抗原，包括血细胞凝集素抗原(HA)、神经醇胺酶抗原(NA)或它们的组合。优选地，流感抗原是表面抗原，即不是结构抗原，如流感基质蛋白2 (M2e)的胞外域。在一种实施方式中，流感抗原不是M2e。在一个具体的方面，流感疫苗制剂包含作为流感抗原的HA和/或NA。各种不同的流感HA和NA蛋白(例如来自不同亚型、或病毒株或隔离群(isolate))的氨基酸序列在本领域中是已知的，并且可在公共数据库如GenBank中获得。优选地，该疫苗制剂包括至少一种HA亚型。用于疫苗的流感病毒株随季节改变。在当前的流行爆发期间，疫苗通常包括两种A型流感株(H1N1和H3N2)和一种B型流感株，且三价疫苗是典型的。本发明还可以使用来自流行株的病毒如新的“猪流感(swine flu)”或“墨西哥流感(Mexican flu)"Hl或其他的流行株(即对于疫苗接受者和一般人群是天然免疫的株)，如H2、H5、H7或H9亚型株(尤其是A型流感病毒)，并且流行株的流感疫苗可以是单价的，或可以基于由流行株补充的常规三价疫苗。然而，根据季节以及包含在疫苗中的抗原的性质，本发明可预防一种或多种HA亚型 HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 或 H16。例如，在一种实施方式中，i. η.疫苗制剂包含每种流感株I至15 μ g之间的ΗΑ。在一个具体方面，疫苗制剂包括来自至少二种流感病毒株、至少一种与流行爆发有关或有可能与流行爆发有关的株的流感抗原或其抗原制剂。疫苗制剂中存在的肽聚糖颗粒的量，优选足以在初次强化免疫策略中诱导保护水平的血细胞凝集素抑制(HI)效价的量。例如，根据本发明的疫苗制剂可包括每微克流感病毒抗原O. OOlmg至Img,优选O. Olmg至O. Img的微粒(干重)。用于人类使用的示例性i.n.疫苗制剂包括0. 3mg-2. 5mg的GEMs (干重)、3 X 1-15 μ g的三价HA (卵、细胞、重组体)或 O. 1-15 μ g 的单价体 HA (流行的)、0. 05-0. 15M 的 PBS (pH6_8)。本发明的鼻疫苗组合物能够根据给药方法配制为液体或粉剂型组合物，尤其是，气雾剂、滴剂、吸入剂或吹入剂(insufflation)，且粉剂或微球体是优选的。用于滴鼻剂的组合物可包括一种或多种可接受的赋形剂，如抗菌剂、粘度调节剂、渗透调节剂以及缓冲齐U。然而，本发明不限于鼻疫苗制剂。出人意料地发现GEMs的加入赋予i.m. HA疫苗有效性。这能带来剂量节约策略。参见实施例8和9，图12。因此，本发明还提供了包含肽聚糖微粒和(常规)肌内HA疫苗制剂的组合物。此外，与GEMs混合的流感HA在口服给予后产生保护性血清HI效价(实施例7，图9和图10)。本发明另外的方面涉及包括本文中所公开的疫苗制剂的容器。在一种实施方式中，它是鼻内给药装置，以气雾剂或滴剂递送系统(鼻内喷雾剂)形式递送的装置，可选地备有使用说明书。仍然进一步地，本发明提供了用于预防对象的流感感染或疾病的方法，该方法包括给予对象如在本文上文所描述的疫苗制剂。因为其安全性，该疫苗制剂尤其适用于人类高危人群。例如，本发明因此提供了方便、安全和可靠的方法，用于预防老年人、年龄可达2岁(2岁以下)的儿童或长期患病的患者的流感感染或疾病。预防性方法可包括鼻内、口服、肌内给予该疫苗制剂，优选鼻内给药。其非常方便地使用给药装置，例如以气雾剂或滴剂递送系统形式的给药装置。疫苗的给药量由能够有效诱导免疫应答的量来确定。例如，对人给予疫苗的频率是到每天I次至几次，而剂量是1-250 μ g，且优选2-50 μ g0根据本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成人。流感疫苗目前被推荐用于从6个月年龄起的儿童和成人免疫。因此，患者可以小于I岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁、或至少55岁。接受疫苗的优选患者是老年人(例如> 50岁，> 60岁，且优选> 65岁)、年轻人(例如< 5岁)、住院患者、医疗保健工作者、武装服务和军事人员、孕妇、长期病患者、免疫缺陷患者、在接受疫苗之前7天内接受抗病毒化合物(如奥塞米韦或扎那米韦化合物，例如见下面的奥塞米韦磷酸盐)的患者、具有蛋变态反应的人和/或出国旅行的人。应理解，疫苗不是仅仅适合于这些组，而是，在人群中可更普遍地使用。对于流行株，所有年龄段的给予是优选的。此外，提供用于制备流感疫苗制剂的方法包括在本发明的范围内，该方法包括(a)提供获自革兰氏阳性细菌的肽聚糖微粒；(b)提供至少一种流感抗原或其抗原制剂；以及(C)混合微粒和(一种或多种)抗原的步骤。可以利用在本领域中本身已知的方法来实施步骤(a)和(b)。因为步骤(b)不需要将抗原融合或连接至肽聚糖结合区域，如锚蛋白，本发明的方法比现有技术方法更方便和具有经济吸引力，在现有技术的方法中必须首先使抗原改性(例如通过融合至蛋白的连接体部分)以结合于肽聚糖微粒。相对而言，能够利用这样的常规亚单位疫苗来实现本发明。因此，本发明还涉及获自革兰氏阳性细菌的肽聚糖微粒作为流感疫苗制剂中的佐剂的应用，所述制剂包含不是融合的或者是相反地共价连接于蛋白质肽聚糖结合部分的流感病毒抗原。图I :在用PBS或HA+不同量的GEM颗粒(以mg干重表示)免疫三次的小鼠中以μ g/ml表示的HA抗原(H1N1A/北京)特异总血清IgG。误差条表示平均标准误差(SEM)。图2 :在不同HA组即i. n. HA+GEM或i. m. HA在第一次免疫后在第14天、第28天和第42天(分别第I次、第2次和第3次免疫)的HA抗原(H1N1A/北京)特异性总血清IgG、稀释滴度的比较分析。误差条表示SEM。图3 :被免疫三次的小鼠的血清的HA抗原(H3N2A/威斯康星(H3N2A/Wisconsin))特异性HI效价。A.不同HA组即i. m.、i. η.和i. n. +GEM在第一次免疫后在第O天、第28天和第42天的HI效价的比较分析。B.三个HA组即i.m.、i.n.、i. n+GEM之间在第一次免疫后在第42天的HI效价比较分析。在柱上方的数值表明每组的应答数。误差条表示SEM。图4:用HA i.m.、i.n.、或i. n+GEM免疫的小鼠的鼻(a)或肺灌洗(b)的HA抗原(H3N2A/威斯康星)特异性IgA效价。在柱上方的数值表明每组的应答数。误差条表示SEM。图5 :用HA i. m.、i. η.或i. n+GEM免疫的小鼠的血清的HA抗原(H3N2A/威斯康星)特异性IgG亚型效价。确定IgGl (A)、IgG2a (b)和IgG2b (C)效价。星号的意思是对于指示的比较P-值〈O. 05。误差条表示SEM。图6 :细胞介导的免疫应答由确定用HA i.m.、i.n.或i. n+GEM免疫的小鼠中的 细胞因子释放曲线即IL-4 (a), IFNy (b)而确定。星号的意思是对于指示的比较P-值〈0.05。误差条表示SEM。图7 :激发后的生存率(％)。用每次剂量5μ gHA以及免疫的动物，且含GEM疫苗每剂量补充O. 3mg GEM。动物在最后的加强免疫后激发3周并且跟踪观察14天。五个疫苗组之间的比较分析。图8 :在激发后肺的病毒效价(A/Puerto Rico/8/34 [PR8]，TCID50 [组织培养感染剂量])(每克肺组织)。激发4天后分离肺。五组之间的比较分析。平均标准误差(SEM)用误差条表示。图9 :用口服HA或口服HA+GEM流感疫苗免疫的小鼠的亚单位抗原(A/广岛[H3N2])特异血清HI效价。将小鼠用每剂量20 μ gHA免疫三次。GEM疫苗含有每剂量O. 3mgGEM。*表明p〈0. 05。在2Log5. 3上方的效价是保护性的。平均标准误差(SEM)用误差条表/Jn ο图10 :用口服HA或口服HA+GEM流感疫苗免疫的小鼠的肠(灰色柱)和鼻灌洗(黑色柱)中的亚单位抗原(A/广岛[H3N2])特异性slgA效价。在柱上方的数值指示每次分析的动物数的应答数。平均标准误差(SEM)用误差条表示。图11 :用固定量的 HA (5 μ gB/Shangdong/7/97)，(含有或不含有 O. 3mg GEMs)鼻内(图表A)或肌肉内(图B)免疫三次(间隔14天)的雌性小鼠的鼻内或阴道洗涤的HA特异性IgA效价。在最后的免疫后的两周取洗涤样品。平均标准误差(SEM)用误差条表示。图12 :用 PBS (模拟)、不含 GEMs 的 I μ gHA (A/PuertoRico/8/34)或用 GEM 配制的O. 04 μ gHA (少25倍的抗原)免疫两次的小鼠的肺病毒效价。在给予最后剂量的两周后，将小鼠用鼠适应的A/PuertoRico/8/34激发。激发后五天，将动物处死，分离肺并均质化，并且通过在MDCK细胞上的最终效价测定病毒效价。平均标准误差(SEM)用误差条表示。图13 :用单独 HBsAg (i.n·)、+GEM (i. η·)或 VaxPro (i.m.)免疫三次的 C57BL6小鼠的血清中HBsAg抗原特异性IgG稀释滴度。误差条表示SEM。图14 :用HBsAg+GEM (i. η·)或VaxPro (i.m.)免疫三次的C57BL6小鼠的鼻和阴道灌洗的HBsAg抗原特异性slgA效价。误差条表示SEM。图15 :作为用仅 HBsAg (i.n. )、+GEM (i.n.)或 VaxPro (i.m.)免疫三次的 Wistar大鼠的mIU/ml而测量的HBsAg抗原特异性血清应答。认为> 10mIU/ml的水平是保护性的。误差条表不SEM。图16 :激发后的存活时间(天)。所有的组的试验材料是鼻内(i.n.)给予。用PBS(模拟免疫)、与GEM混合的肺炎球菌P3蛋白(PspA、CbpA、PdBD) (GEM+P3)或与GEM结合的P3蛋白(GEM-P3)免疫小鼠。两种疫苗都包含5 μ g的每种抗原。每个符号代表I只动物。水平线表示均值。图17 :用PBS (模拟免疫)、与P5蛋白混合的GEM (GEM+P5)或与P5蛋白结合的GEM (GEM-P5)免疫的小鼠在用病毒性肺炎链球菌(virul ent S. pneumonia)D39 (血清型2)鼻内激发40hrs后的健康状态。疫苗包含O. 5yg IgAlprt>3 μ g PsaA>l. 5 μ g CbpA>2 μ gPpmA>2 μ g PspA和0. 3mg GEM。激发40h后的健康状态是对于疫苗保护性(protectivity)的度量。实验部分材料与方法从蛋中获取的A/威斯康星(H3N2)株的流感单价亚单位疫苗和从蛋中获取的A/北京(HlNl)裂解病毒疫苗用于该研究。利用单辐射免疫扩散试验来确定疫苗中的血细胞凝集素(HA)的浓度。从多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)分离的重组HBsAg (ad/ay)用于该研究。来自Sanofi Pasteur/MSD的HBVaxPro用作基准HBsAg疫苗(40 μ g/ml )。如以前所描述的生产 GEM 颗粒(Van Roosmalen et al. , Methods 2006，Feb; 38 (2) : 144-9)。I. I免疫和激发根据由荷兰动物保护法案提供的方针评价和批准动物实验。Balb/c、C57BL6小鼠(6-8周)和Wistar Unilever大鼠(10周)购自Harlan,荷兰。CD I小鼠购自CharlesRiver，德国。每组小鼠5-10只动物。大鼠每组由4只动物组成。所有小鼠组在第O天用初始免疫接种免疫，病在第14天和第28天用5 μ g的HA强化免疫两次，或在第O天以及在第10天和第20天用5 μ g的HBsAg两次强化免疫。在吸入麻醉剂(异氟烷/O2)的情况下用通过两个鼻孔各给予10 μ I疫苗而完成鼻内小鼠免疫。大鼠组在第O天用初始免疫接种免疫，并在第10天和第20天用25 μ g的HBsAg强化免疫两次大鼠，以与小鼠的类似方式用30μ I的疫苗进行鼻内大鼠免疫。肌内小鼠组在吸入麻醉剂(异氟烷/O2)的情况下，在大腿后侧肌肉注射50 μ I的疫苗。肌内大鼠组通过两个后腿肌肉各注射200 μ I疫苗。在第二次强化免疫两周后将小鼠和大鼠处死。在将动物处死后，获取Balb/c小鼠的脾，并随后在4° C存储于含有5%FCS、1%青霉素/链霉素和50μΜβ-巯基乙醇的补充頂DM Glutamax培养基中。小鼠的口服给予进行3次，即在第O天、第14和第28天。简言之，含有或不含有O. 3mg GEM颗粒的20 μ g亚单位疫苗以200 μ I的碳酸氢钠溶液灌胃给予(3. 2%w/v)。利用不锈钢给料针在没有麻醉的情况下进行口服给予。在激发实验中，用流感HA疫苗免疫的小鼠在最后一次强化免疫3周后用100嗤斑形成单位(PFU)的株A/Puerto Rico/8/34 (高剂量,每组9只动物)或66PFU的株A/PuertoRico/8/34 (低剂量，每组4只动物)鼻内激发(40 μ L)。在动物经O2/异氟烷的轻微麻醉下实施激发病毒的鼻内给予。接受低剂量的动物在激发4 (天)后处死，并分离出肺以用于利用体外基于细胞的试验测定肺中的病毒载量。简言之，MDCK细胞与病毒稀释液一起在培养箱(37° C, 5% CO2)培养I小时并随后用PBS洗涤一次。将包含胰酶(100 μ I培养基含有7.5 μ g/ml的TPCK胰酶)的新鲜培养基加入到孔中。细胞在培养箱中培养72小时(37° C，5% CO2)后，之后将上清与50 μ I 1% (经洗涤的)豚鼠红细胞一起转移至圆底平板(Costar)。混合物在室温培养2小时，并观察血细胞凝集。仍然出示血细胞凝集的最高稀释的倒数即为效价。追踪观察接受高剂量动物的临床迹象直至激发后第14天并处死，除非动物由于不能承受痛苦(人道终止一天内体重减轻10%或多天内体重减轻15%,合并有倦怠、毛色毛躁并垂死)而被提前处死。对于肺炎球菌免疫⑶I小鼠，在第O天、第14天和第28天接受鼻内O. 01ml( IOyL)的剂量。肌内组在第O天、第14天和第28天接受在后肢的大腿肌内注射(左腿、右腿和左腿交替进行)的O. 04mL (40 μ L)的剂量。在最后一次强化免疫三周后，用I X IO6CFU的肺炎链球菌株TIGR4激发小鼠。在小鼠吸入麻醉剂(异氟烷)而处于轻微麻醉状态时，以50 μ L的接种物经鼻内弓I入肺炎双球菌。密集监控感染后的小鼠，并基于健康状态、体重和体温的情况对它们进行评分。在激发40小时后测定血液中的细菌数，并将患病和需要被处死(人 道终止)的小鼠以及在它们的血液中含有超过5. 4Χ 103CFU/mL的小鼠处死。剩余的小鼠在它们患病或在研究结束时处死(激发14天后)。I. 2血清收集和粘膜的洗涤在实验期间在每种疫苗给予之前抽取血样三次，并且最后一次抽血在最后一次强化给予后的第14天的终点进行。将血液在1200x g离心5分钟以获得血清，并随后将样品储存在-20° C，直至进一步的分析。通过用1ml PBS冲洗鼻咽而获得鼻洗涤物(补充有蛋白酶抑制剂混合剂)。通过用100 μ I的PBS (补充有蛋白酶抑制剂混合剂)冲洗阴道而获得阴道洗涤物。抽出IOOy I等分试样并通过使用附有黄色的200 μ I的尖端的移液管再插入九次。将洗涤液转移到干净的小瓶中并于-20° C储存。通过利用带有硅酮尖端的I. 2_X38mm的柔性特氟隆(聚四氟乙烯树脂)给料针经由胃后的切口插入十二指肠进行肠洗涤。在灌洗前，用结扎线闭合回肠之前的空肠。接着，将Iml注射器连接于进料针，并通过用Iml的PBS反复冲洗十二指肠/空肠来进行灌洗。在采集每个样品之后，立即将灌洗液与10μ I的储存液(补充有蛋白酶抑制剂混合剂)混合，并将灌洗液保存在冰上，直到进一步的制备。将灌洗样品以11，OOOXg离心15分钟，然后收集上清并于4° C储存直到进一步的分析。I. 3ELISA利用ELISA测试来测定对HA抗原的抗体应答以测定血清IgG、IgGU IgG2a和IgG2b、粘膜分泌的slgA的稀释滴度，或确定HA特异性IgG的量。对于稀释滴度，以200ngHA/孔孵育平板。在用HA的孵育过夜后，用3%的牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich，荷兰)封闭平板。然后，洗涤平板并与连续稀释的血清和粘膜样品一起在37° C孵育1.5h。接着，洗涤平板，并与直接抗鼠IgG、IgGU IgG2a、IgG2b和IgA的辣根过氧化物酶结合的山羊抗体(Southern Biotech, Birmingham, AL,美国)一起孵育。最后，加入底物溶液(在50mM的磷酸盐缓冲液(pH 5. 6)中 0. 02% 的 I, 2-苯二胺-二盐酸盐(1，2-phenyllendiamin-dihydrochlorid)，含有0. 006%的H2O2),并在室温在暗处孵育平板30分钟。通过加入2M的H2SO4终止反应，并利用 Benchmark Microplate 酶标仪(BioRad, Hercules, CA)读取在 490nm 处的吸光度。所报告的效价是在背景校正之后对应于A490 ^ 0. 2的计算的样品稀释度的倒数。为了确定HA特异性血清IgG的量，用200ng/100l·! I/孔的HlNlA/北京以及用于校正曲线的抗-鼠IgG涂覆微量滴定平板(microtiter well plates)。在4° C的孵育过夜之后，用涂覆缓冲液(O. 5M碳酸盐-碳酸氢盐，pH 9. 6-9. 8)洗涤平板2次。用Protifar Plus(在涂覆缓冲液中，2. 5%)在4° C进行封闭45分钟。在用涂覆缓冲液以及PBS/0. 05%Tween20洗涤平板四次后，将血清和用于校正曲线的(鼠IgGl)加入到孔中。将连续稀释的血清和校正曲线(鼠IgGl)在4° C孵育I. 5小时。随后，用PBS/TWeen20洗涤平板三次。将辣根过氧化物酶结合的免疫球蛋白(ITK, Southern Biotech)在PBS/Tween20中以1:5000稀释，加入到孔中并在4° C孵育I小时。用PBS/TWeen20洗涤平板三次并用水洗涤一次后，利用底物溶液(O. 02%,在50mM磷酸盐缓冲液pH 5. 6中的1，2-苯二胺-二盐酸盐，含有O. 006%的H2O2)将平板染色30分钟。用2M H2SO4终止显色反应。在493nm处进行测量。利用ELISA测试来测定对HBsAg抗原的血清抗体反应以确定IgG稀释滴度。为此目的，将涂覆有在PBS中的ZygAil HBsAg的ELISA平板，以50 μ I/孔加入并在37° C孵育I小时。用洗涤缓冲液(PBS/0. l%tWeen20)洗涤平板6χ。用封闭缓冲液(PBS/1%BSA)以200 μ I/孔封闭平板，并在37° C孵育I小时。血清样品在封闭缓冲液中连续稀释并以50 μ I/孔加入，然后在37° C孵育I小时。用洗涤缓冲液洗涤平板6χ。结合于碱性磷 酸酶(Southern Biotech)的山羊抗大鼠IgG用作二抗(在封闭缓冲液中以1:3000稀释)并以50μ I/孔加入，然后在37° C孵育I小时。用洗涤缓冲液(PBS/0. 1%吐温20)洗涤平板6χ。底物缓冲液(IOmM 二乙醇胺/0. 5mM MgC12，pH9. 5)中的对硝基苯磷酸二钠盐(p-Nitrophenyl Phosphate Disodium Salt) (Calbiochem)用于检测，并在 405nm 处完成测量。滴度表示为稀释滴度，其被定义为示出免疫前标准OD两倍的稀释度。利用ELISA试验来确定HBsAg-特异性粘膜分泌的slgA，以测定IgG稀释滴度。为此目的，像之前一样，涂覆、洗涤以及封闭ELISA平板。在缓冲液中连续稀释粘膜灌洗液。以50 μ I/孔加入并在37° C孵育I小时。用洗涤缓冲液洗涤平板6χ。结合于辣根过氧化物酶(Nordic Immunology)的在封闭缓冲液中以1:1000稀释的山羊抗大鼠IgA用作二抗并以50 μ I/孔加入，然后在37° C孵育I小时。用洗涤缓冲液(PBS/0. l%tWeen20)洗涤平板6x。将 TMB (3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，sigma，Lot 055K8208)溶于 Iml DMSO 中，并加入9ml 0. 05M的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH 5. 0)用于检测。在使用之前，向每IOml底物缓冲液溶液加入2 μ I 30%的过氧化氢。用2Μ H2SO4终止显色反应，并在450nm下完成测量。滴度表示为稀释滴度，定义为显示三倍于背景OD (涂覆有与封闭缓冲液一起孵育的HBsAg)的稀释度。I. 4血细胞凝集抑制(HI)测试如前文所描述的，测定血清的HI效价[35]。简言之，将血清在56° C灭活30分钟。为了减少非特异性HA血细胞凝集，向灭活的血清中加入25%的高岭土混悬液。在1200x g离心后，将50 μ I上清平行两份转移到96孔圆底平板(Greiner，Alphen a/d Ri jn，荷兰)中，并在PBS中连续稀释两倍。然后，将4血细胞凝集单位(HAU)的A/威斯康星(A/Wisconsin)流感灭活病毒的加入到每个孔中，并将平板在室温孵育40分钟。最后，将50μ1 1%的豚鼠红细胞(RBC)加入到每个孔中，并在室温孵育2h。将能够防止血细胞凝集的最高稀释度评价为HI效价。 I. 5利用Abbott AxSYM体系测定HBsAg-特异性Ig效价通过AxSYM AUSUB测试在Abbott AxSYM系统上完成以mIU/ml表示的抗HBsAg抗体的定量测定。该测试是微粒EIA (microparticle EIA),利用在作为固相的颗粒上的重组HBsAg (ad/ay)以及结合于作为结合物的重组HBsAg的生物素。在下一步中，结合有碱性磷酸酶的抗生物素与抗原夹心(antigen sandwich)结合。将反应混合物转移至微粒不可逆地结合的惰性玻璃纤维基质上。甲基伞形酮磷酸酯(methylumbelliferyl phosphate)用作底物，并用仪器读取最终产物甲基伞形酮的荧光。1.6Elispot (酶联免疫斑点测定) 如较早描述的进行Elispot 测试(Amorij JP et al. Vaccine 2007 Dec21;26(1) :67-76)。简言之，将 96 孔微孔滴定板(Greiner，Alphen a/d Rijn，荷兰)用抗鼠干扰素-Y (IFN-Y )和白细胞介素-4 (IL-4) (BD, Pharmingen, Erembodegem,比利时)在4° C孵育过夜。在用PBS/Tween (sigma-Aldrich，荷兰)洗涤平板三次后，将它们在37° C封闭(PBS+4%BSA) I小时，向平板中加入以IX IO6/孔浓度的脾细胞，含有或不含有作为刺激多肽的亚单位疫苗。在37° C、5% CO2孵育过夜之后，将细胞用冷水裂解。接着，用PBS/Tween洗涤平板五次，并在PBS+2%BSA中用以O. 125 μ g/ml浓度的生物素化抗鼠IFN-Y和IL-4抗体(BD Pharmingen)孵育。在洗涤后，在37° C用链霉亲和素碱性磷酸酶(Streptavidin alkaline phophatase) (BD Pharmingen)孵育平板 I 小时。最后，在用PBS/Tween洗涤三次并用PBS洗涤两次后，利用由lmg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(5_bromo-4-chloro-3-indoIyIphophate)>O. 92%w/v 的 2-氨基-2-甲基-I-丙醇、O. 08 μ 1/ml的TritonX-405、lM的MgCl2和6mg/ml的琼脂糖组成的底物溶液显影斑点。使用Elispot读数器(A. EL. VIS Elispot读数器)对斑点进行计数。I. 7统计分析使用学生-t检验或非参数ANOVA检验进行统计分析，以p〈0. 05作为最低显著水平。除非另外指出，结果以均值土平均标准误差(SEM)表示。实施例I鼻内HA疫苗中GEMs的佐剂效应在鼻内小鼠模型中通过向HA加入不同量的GEM颗粒(0、0. 03、O. I和O. 3mg干重)来评价对于鼻内HA (5 μ gHINIA/北京)的全身性血清抗体应答的增强。小鼠接受三次疫苗给药，每次间隔两周，并在最后一次强化免疫两周后分析血清样品。图I示出了通过鼻内途径给药的不含佐剂的HA仅引起低水平的全身性IgG抗体(5. O μ g/ml)。少量GEM颗粒(O. 03mg)的加入已通过因子4使该水平增加。向大约每ml 67 μ g的HA特异性IgG加入0.Img GEM颗粒获得最佳的增强，通过加入更多的GEM颗粒不会使该增强得到进一步的增力口。这些结果明确显示，与流感HA混合的GEM颗粒以剂量依赖的方式增强抗原特异性免疫应答。实施例2与肌内HA相比，与HA混合的鼻内GEM在鼻内HA+GEM疫苗与传统方式HA疫苗(即不含佐剂的HA通过肌内途径给予)之间进行比较。小鼠接受三次给药的i.n. HA (5 μ gHINI A/北京)+GEM (0.15mg干重)或
1.m.HA (5 μ g)，并且给药之间间隔两周。用每次免疫两周后取得的样品测量HA特异性血清IgG效价，以比较鼻内和肌内疫苗的免疫应答的数量级以及动力学。图2明确示出了数量级和动力学都类似于i. m. HA疫苗。在各自给予之后，i. η.和i. m.疫苗的应答之间没有统计学显著性差异(每个P值>0. 05 )。
实施例3与HA混合的鼻内GEM引起保护性应答流感疫苗的保护能力由测量的HI效价来确定。对于所有小鼠，在用i.n.HA(5μ gH3N2A/威斯康星)、HA+GEM (O. 3mg干重)、i. m. HA的第I次和第2次强化免疫后，测定HI效价。图3示出了常规i. m.疫苗和含GEM佐剂的i. η.疫苗都在第I次强化免疫后达到可比得上的在2Ioge以上的HI效价(ρ=0. 2062)。这些效价在两种情况下都增加到在两种治疗间没有显著性差异的2log7和2IogS之间的值(ρ=0. 7611)。用单独的亚单位疫苗i. η.免疫诱导低HI效价，即使在两次强化免疫后也是如此。此外，只有50%的动物在用i. η.亚单位疫苗免疫后发生应答，而在另两种疫苗组中所有动物均发生应答。由于认为2log5. 3以上的HI效价在人类中是具有保护性的，因此这些结果表明，对于i. n. GEM为佐剂的流感疫苗而言单次强化就足以实现保护性免疫。该结果证明，与仅用亚单位疫苗i.n.和i.m.免疫相比，含有GEM颗粒的亚单位疫苗制剂诱导强烈的全身性免疫应答。实施例4与HA混合的鼻内GEM的粘膜免疫应答 据先前报道，i.n.免疫可诱导呼吸道(即流感病毒的入口)的局部粘膜免疫。粘膜免疫的激活以潜在的B细胞和T细胞为主，并在粘膜部位引起slgA的分泌。因此，在小鼠的鼻和肺灌洗液中测定流感特异性slgA效价(图4)。i.m.免疫在鼻和肺灌洗液中引起的slgA水平在大部分小鼠中低于检测限(只有八分之一的小鼠在鼻灌洗液中显示应答)。同样，仅用亚单位疫苗的i.n.免疫在肺和鼻灌洗液中产生低slgA效价(3/8应答)。相比之下，用HA+GEM的i. η.免疫在所有小鼠的鼻和肺灌洗液中均诱导高slgA效价。总之，用HA+GEM的i. η.免疫在上呼吸道和下呼吸道均可诱导强烈的粘膜免疫应答。实施例5与HA混合的鼻内GEM的免疫应答表型为了评价应答表型即T-helper 1/T-helper 2之比(Thl/Th2)，测定IgG亚型、IFN-Y 和 IL-4 应答。IgG亚型分布(图5)显示，仅用亚单位疫苗的i.n.免疫诱导低IgGl、IgG2a和IgG2b应答。如先前报道的[35，36]，用亚单位疫苗的i.m.免疫诱导高IgGl应答，但几乎没有I gG2a和I gG2b应答，这表明免疫应答朝向Th2应答偏移。与i. m.免疫相比，用HA+GEM的i. η.免疫诱导显著更高的 IgG2a (p=0. 042)和 IgG2b (p=0. 030)和更低的 IgGl (p=0. 0135)应答。这些结果表明由i.n HA+GEM疫苗产生的抗体应答与常规i. m.疫苗相比，显著更偏向于Thl表型。通过测定免疫小鼠的产生抗原特异性IFN- Y和IL-4的脾细胞来进一步评价免疫应答的类型(图6)。用亚单位疫苗的i.m.免疫引起比IFN-Y产生细胞更多数量的产生IL-4的细胞，这再次表明Th2应答是占优势的。用亚单位疫苗的i.n.免疫产生更少数量的产生IL-4的细胞，但产生显著更多的产生IFN-Y的细胞(图6)，从而引起均衡的Thl/Th2应答。产生IFN-γT的细胞的增加在用HA+GEM i.n.免疫后甚至明显是更显著的(p=0. 0373)，这表明免疫应答从均衡Thl/Th2转移到Thl占优势的应答。 实施例6与HA混合的鼻内GEM在致死激发模型中的保护在致死激发模型中评价用i. n. HA+GEM产生的免疫应答的保护能力。用PBS(假免
疫(mock immunization))或单独用 HA (2 次)、HA+GEM (2 次)或用 HA+GEM (3 次)i. η.免疫小鼠。与肌内给予的HA基准疫苗一起进行比较。在该实验中的HA来源于PR8株(H1N1)。在将GEM加入到疫苗中的情况下，剂量是每剂量5 μ gHA和每剂量O. 3mg GEM。以2周的间隔给予疫苗。在最后一次强化免疫3周后，用致死量的PR8进行致命激发。观察了对于组HA+GEM (i.n. 2 次；9/9 存活)、HA+GEM (i.n. 3 次；9/9 存活)、以及 HA 基准对照(i. m. ；9/9存活)针对激发的保护[图7]。(这些组内的所有动物在激发后均未显示出临床迹象(无倦怠、毛色毛躁或驼背姿势)，并存活至第14天，直到实验结束。保护与无体重减轻相关(未示出)。相对而言，在组HA i. η.和PBS (假免疫，阴性对照)中的大多数动物分别从第3天和第4天起显示出严重的体重减轻，并且由于严重的临床症状(重量< 85%、倦怠、毛色毛躁、驼背姿势)在激发后的第5天至第8天后被安乐死。测定激发4天后的肺中的病毒效价证明，用HA+GEM的i. η.免疫(2或3次)与PBS阴性对照相比引起在激发4天后的肺中的病毒效价减少约1，000至10，000倍(图8)。在单独i. η.施加HA时，观察到在激发后非常有限的病毒效价减少(减少4倍)，这证明了需要GEM的佐剂性质以提供保护。与基准阳性对照组(HA，i. m)相比，HA+GEM的免疫(2次和3 次)引起在肺中约20至100倍的病毒效价提高。病毒效价的减少能够导致该病毒脱落减少，并且被认为是提供群体保护(herd protection)的重要因素。作为在实施例4和5中证明的呼吸道粘膜内层局部出现IgA和/或由i. n. HA+GEM疫苗产生的更好均衡的Thl/Th2类型免疫应答能够解释观察到的与i.m.基准疫苗相比的保护优势。实施例7与GEM混合的口服HA引起保护性应答口服途径给药因为其方便性，对于疫苗是有吸引力的，但因为灭活或降低抗原而常常缺乏有效性。已知口服给予不含佐剂的HA不足以引起保护性血清HI应答和/或粘膜IgA应答。在小鼠模型中分析在口服免疫(orogastric immunization)中添加GEM至HA的效果。使用H3N2 A/广岛(H3N2 A/Hiroshima)亚单位抗原HA (20 μ g/剂量)。HA+GEM疫苗另外包含每剂量0. 3mg的GEM。将小鼠以两周的间隔免疫三次，并分析最后一次免疫两周后的样品。测定血清HI效价以比较免疫的保护能力。如图9所示，用HA+GEM疫苗的口服免疫诱导比不含GEM颗粒的口服免疫显著更高(p〈0. 05)的HI效价。在口服HA+GEM组中，HI效价达到2log7以上,这显著高于2log5. 3的保护性截止水平(cut-off level)。此外，口服HA+GEM能够在胃肠道(图10)中使粘膜IgA有相当水平的升高(图10)。出人意料的是，在大部分动物中还引起呼吸道中的强力局部IgA应答。这些结果表明，与GEM混合的口服流感HA疫苗还引起保护性全身性免疫应答，并且此外引起有效的粘I吴应答，包括在呼吸道中。实施例8与GEM混合的肌内HA引起在粘膜表面的局部应答肠胃外疫苗通常不引起粘膜分泌的IgA的产生。在肌内免疫小鼠的粘膜样品的分析中，我们出人意料地发现，接受HA+GEM的小鼠在几个粘膜组织(如鼻、肺和阴道)处分泌局U IgA0将雌性小鼠用固定量的HA (5 μ gB/Shangdong/7/97)(含或不含0. 3mg GEMs)鼻内或肌内免疫三次(间隔14天)。在最后免疫一次两周后，进行鼻和阴道洗涤并通过特异性ELISA测试测定IgA效价。图11中的数据示出，HA+GEM的鼻内给予有效地诱导局部IgA应答，以鼻洗涤液中的IgA效价作为证明。IgA效价也被远距离地诱导，以阴道洗涤液中显现的IgA效价作为证明。如所预期的，单独肌内给予HA不能诱导有关的局部IgA应答。出人意料的是，肌内给予HA+GEM在鼻和阴道中都诱导有关的IgA效价，而效能接近于在鼻内给予后所达到的。因此，HA+GEM的肌内给予能够用于诱导粘膜免疫应答。实施例9与GEM混合的HA的肌肉内给予支持显著的剂量节约为了确定肌内GEM+HA引起的免疫应答是否可用于流感HA抗原的剂量节约(dosesparing)，将小鼠用 PBS (假处理)、不含 GEMs 的 I μ gHA (A/PuertoRico/8/34)或用 GEM (每剂量O. 3mg)配制的O. 04 μ gHA (少25倍的抗原)免疫两次。在给予最后剂量的两周后，用小鼠适应的A/PuertoRico/8/34激发小鼠。激发五天后，将动物处死，分离肺并均质化，然后通过在MDCK细胞上的终点滴定测定病毒效价。 图12，图A示出了与假处理的动物相比，用I μ gHA肌内免疫动物提供多于一个log的受感染动物的肺中的病毒载量减少。然而，HA+GEM提供对抗受感染动物的肺中流感病毒的复制的完全保护，以肺效价的完全没有为证明。这些结果证明，i.m.HA+GEM疫苗与基准i. m. HA相比的优越性。在包含仅O. 04 μ g HA (少25倍的抗原)的HA+GEM制剂中达到与对于基准i.m.相同水平的保护，如图12的图表B所示的，表明可以通过配制含GEMs的肌内流感疫苗而实现显著的抗原节约。实施例10 :鼻内基于GEM的乙型肝炎疫苗在小鼠中引起强烈的全身性IgG和局部IgA应答。用包含HBsAg抗原的基于GEM的乙型肝炎疫苗免疫成年C57BL6小鼠。在该情况下，将HBsAg[5 μ g]与GEM颗粒[O. 15mg干重]混合。还使用等量的不含GEM的HBsAg用于比较。疫苗通过鼻内途径给予。用铝(Alum)作为佐剂的商品化H印B疫苗VaxPro作为基准疫苗经皮下给予。在完全免疫(3次剂量，以10天间隔给予)后测量血清IgG。图13明确示出了 GEM颗粒在鼻内疫苗中的佐剂效应。在鼻内给予单独HBsAg时，没有可测量的HBsAg特异性血清IgG应答。相比之下，HBsAg+GEM以4. 2的稀释滴度引起剧烈的HBsAg特异性血清IgG应答。鼻内GEM-HBsAg疫苗引起与通过皮下途径给予的基准疫苗类似的HBsAg特异性 IgG (p=0. 2290)。粘膜免疫的激活引起在粘膜部位分泌slgA。在该实验中，在免疫部位(鼻)的洗涤液和远距离粘膜部位(阴道)的洗涤液中测定HBsAg特异性slgA的局部分泌。图14明确示出了仅使用i.n. HBsAg+GEM疫苗来产生slgA应答，而不是用i.m. VaxPro疫苗。
i.n. HBsAg+GEM疫苗甚至在远距离粘膜部位(如阴道)也能产生slgA的分泌。实施例11 :大鼠模型中鼻内GEM-HBsAg乙型肝炎疫苗引起血清抗体的保护水平通过将HBsAg抗原(25 μ g)与GEMs (O. 4mg)混合来制备含佐剂的乙型肝炎疫苗。为了比较，制备单独HBsAg抗原(25 μ g)和与Alum —起制备的包含相同抗原的基准疫苗(VaxPro)。完全免疫由以10天间隔的三次疫苗给予组成。在最后一次强化14天后收集最后的血清。鼻内给予GEM-HBsAg和HBsAg。通过肌内途径给予VaxPro。对于乙型肝炎疫苗，已知相关的保护。认为血清高于10mIU/ml的抗体水平是保护性的，并常规作为对于保护的替代指标。分析完全免疫的大鼠(每组4只Wistar大鼠)的血清，用于以每ml毫国际单位(mIU/ml)表示的HBsAg特异性抗体水平。图15概述了结果。鼻内HBsAg根本不引起应答。在HBsAg与肽聚糖微粒一起配制时，通过鼻内途径获得高且保护水平的抗体应答(mIU/ml彡10)。保护水平类似于通过肌内途径给予的基准疫苗VaxPiO (p=0. 7715)。实施例10和11的结果一致证明，尽管抗原不积极结合GEM颗粒，但在鼻内基于GEM的乙型肝炎HBsAg疫苗中唤起强烈的全身性抗体和局部抗体应答。实施例12基于三价体肺炎球菌蛋白质的GEM疫苗的保护性在GEM或者与蛋白混合或结合至蛋白质而配制的鼻内基于肺炎球菌蛋白质的疫苗之间进行比较。三种保守的(conserved)肺炎球菌蛋白(PspA、CbpA> PdBD)用于三价疫苗、GEM+P3 (混合)和GEM-P3 (结合)。将小鼠用这些疫苗或作为阴性对照的PBS (假免 疫)以给药之间间隔10天免疫三次。每种基于GEM的疫苗包含每剂量5 μ g的每种抗原和
0.3mgGEM。在最后一次的强化免疫三周之后，将小鼠用致死量的鼻内肺炎链球菌TIGR4(血清型4)激发。未保护的小鼠在激发后72h之内死亡。激发后，跟踪观察小鼠14天。基于人道的终止(激发48h后每ml血液>5. 4X IO3菌落形成单位(cfu)、重量< 85%、倦怠、毛色毛糙、驼背)或在研究的终点，对小鼠实施安乐死。假免疫的小鼠均未存活。出人意料地发现用GEM+P3 (混合)疫苗免疫的组(50%)与用GEM-P3 (结合)疫苗免疫的组(20%)相比，显示出更好的存活(参见图16)。这些结果明确显示，这些蛋白质与GEM颗粒混合时，含有P3蛋白质的GEM疫苗是更有效的。实施例13五价的基于肺炎球菌蛋白的GEM疫苗的有效性在GEM或者与蛋白混合或结合至蛋白质而配制的鼻内基于肺炎球菌蛋白质的疫苗之间进行比较。五种保守的肺炎球菌蛋白(PspA、PsaA、CbpA、PpmA、IgAlprt)用于五价疫苗、GEM+P3 (混合)和GEM-P3 (结合)将小鼠用这些疫苗或作为阴性对照的PBS (假免疫)以给药之间间隔10天免疫三次。每种基于GEM的疫苗包含每剂量O. 5μ g IgAlprt,3 μ gPsaA,
1.5 μ g CbpA、2 μ g PpmA、2 μ gPspA和O. 3mg GEM。在最后一次强化免疫三周之后,将小鼠用致死量的鼻内肺炎链球菌D39 (血清型2)激发。未保护的小鼠在激发后72h之内死亡。基于临床症状(倦怠、毛色毛躁、驼背)获得激发40h后的健康状态，并将其作为终点以测量疫苗的保护能力。图17显示在用GEM-P5 (结合)疫苗免疫的组中，10只小鼠中的8只保持完全健康，而这对于GEM+P5 (混合)疫苗(5/10)(保持完全健康的)是较少的，且对于阴性对照(1/10)(保持完全健康的)是非常少的。这些结果明确显示，这些蛋白质与GEM颗粒结合时，含有P5蛋白质的GEM疫苗是更有效的。


本发明涉及含佐剂疫苗制剂，尤其是用于鼻内递送的流感疫苗。提供了含佐剂流感疫苗制剂，包含(i)获自革兰氏阳性细菌的肽聚糖微粒，和(ii)至少一种流感病毒抗原或其抗原制剂，其抗原或抗原制剂不是融合的或者是相反地共价连接于蛋白质的肽聚糖结合部分。