专利名称：人参皂苷f的制作方法
本发明的目的在于提供了人参皂苷F1在制备治疗骨性关节炎的药物中的应用。人参皂苷F1是一种已知的具有药物活性的物质，因此，可以按常规制剂方法，将其制备成临床适用的任何一种药剂，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂等口服固体制剂、口服液体制剂、注射剂、凝胶与霜剂等外用制剂等。在制备上述制剂的过程当中，可以将人参皂苷F1与任何一种适用于制备成临床药剂的赋型剂混合使用，制备成药物制剂。通过本发明，人参皂苷F1可有效用于治疗骨性关节炎，并且副作用小。由于人参皂苷F1在制备治疗骨性关节炎药物中的应用是发明人的首次发现，因此，无论是人参皂苷F1单独使用为活性成分制成的药剂，还是利用人参皂苷F1的抗骨性关节炎活性与其他活性成分配合使用制成的药剂，均在本专利的保护范围之内。本发明通过下列实施方式证明了人参皂苷F1在治疗骨性关节炎方面的用途，但不仅限于这些实施例。1.2药品、试剂及设备人参皂苷F1按制备例5方法制备。
硫酸氨基葡萄糖胶囊规格250mg/粒，意大利罗达制药厂生产。
3％戊巴比妥购自天津化学试剂有限公司。
注射用青霉素钠规格160万单位。天津药业焦作有限公司生产。
肝素钠2ml1.25万单位。江苏万邦生化医药股份有限公司生产。
SOD、NO测定试剂盒皆为南京建成生物工程研究所产品。
SANKE牌脑压计南宁市三科医疗器械有限公司生产。
2分组与给药动物随机分为6组，每组10只。具体如下(1)假手术组；(2)模型组无菌生理盐水10ml灌胃；(3)人参皂苷F1低剂量组(5mg/kg)；(4)人参皂苷F1中剂量组(10mg/kg)；(5)人参皂苷F1高剂量组(20mg/kg)；(6)硫酸氨基葡萄糖胶囊(40mg/kg)；加蒸馏水稀释成溶液。
给药方法于制模当天即给予灌胃，每天1次，连续10周。
3试验方法3.1造模方法以切断兔前后交叉韧带方法造模。以3％戊巴比妥30mg/kg静脉麻醉，随机取左、右膝内侧髌腱旁直切口1-2cm，沿髌腱旁切开关节囊向内侧推离髌骨造成脱位。屈曲膝关节，直视下可见膝交叉韧带，用眼科剪小心剪断交叉韧带，避免损伤关节面软骨。行前后抽屉实验证实交叉韧带完全切断，冲洗关节腔积血、积屑，逐层缝合伤口，无菌包扎固定。术后4d肌注青霉素4×106U/d，以预防感染。
3.2观察指标与方法3.2.1X线给药10周后摄兔膝关节前后位CR片观察膝关节X线表现。
3.2.2骨内压采用脑压计测量骨内压。在静脉全麻下，把兔仰卧固定于手术台上，在兔左或右胫骨结节上约5mm处内侧平坦骨面将骨穿针头垂直穿入髓腔，拔出针芯，快速将带有细长针头、充有0.1％肝素钠生理盐水的注射管向骨穿针内芯管注射充满，再将装有肝素钠生理盐水的细塑料管经三通管连接到骨穿针和脑压计，观察10min，指针稳定后，记录数据。所得数据(单位mmH2O)经公式换算成kPa。
3.2.3血清SOD、NO含量测定给药10周后自兔耳缘静脉取血5ml测血清SOD、NO含量。
4.结果4.1X线观察假手术组膝关节内外侧间隙均匀一致，股骨髁、胫骨平台关节面轮廓清晰、光整；模型组膝关节内侧间隙明显变窄，外侧间隙增大，膝关节失稳，股骨内髁、胫骨平台关节面不光整；人参皂苷F1各剂量组及硫酸氨基葡萄糖组膝关节内侧间隙变窄，外侧间隙稍宽，但与模型组比较，股骨内髁、胫骨平台关节面尚光整。
4.2骨内压结果表明模型组、人参皂苷F1组、硫酸氨基葡萄糖组皆与假手术组对比有显著性差异，说明造模成功。人参皂苷F1组中、高剂量组、硫酸氨基葡萄糖组与模型组比较有显著性差异，说明人参皂苷F1中、高剂量及硫酸氨基葡萄糖组皆可降低兔膝关节炎模型骨内压，两者比较无显著性差异。详见表1。
表1人参皂苷F1对兔膝关节炎模型骨内压的影响(n＝10，X±s)

注与模型对照组比较*P＜0.05；与硫酸氨基葡萄糖组比较#P＜0.05。
4.3血清SOD、NO含量测定用黄嘌呤氧化酶法测定SOD含量，用硝酸还原酶法测定NO含量，结果显示模型组血清中SOD含量明显下降，人参皂苷F1组及硫酸氨基葡萄糖组SOD活性升高，说明人参皂苷F1与硫酸氨基葡萄糖均可提高SOD活性。血清NO测定，模型组血清中NO含量明显升高，人参皂苷F1组及硫酸氨基葡萄糖组NO含量降低(表2)。
表2人参皂苷F1对膝关节炎模型兔血清SOD、NO的影响(n＝10，X±s)

注与模型对照组比较*P＜0.05；与硫酸氨基葡萄糖组比较#P＜0.05。
5.结论上述结果表明人参皂苷F1能降低骨内压、提高SOD含量，抑制氧自由基对软骨细胞及基质的损害，从而起到防止并延缓关节软骨的退行性改变，抑制滑膜炎症以起到防治骨性关节炎的作用。
制备例中所述的人参皂苷Re、人参皂苷Rg1采用云南植物药业有限公司生产的市售品；柚皮苷酶采用上海宝丰生化有限公司生产的市售品；二甲亚砜采用盘锦兴海制药有限公司生产的市售品；甲酰胺采用淄博市博山华耀试剂厂生产的市售品；羧甲基纤维素钠采用上海邦成化工有限公司生产的市售品。
制备例1人参皂苷F1的制备500mg人参皂苷Re、150mg柚皮苷酶溶于50ml磷酸-柠檬酸缓冲液(pH 4.5，离子强度为0.01M，含10％的乙醇)中，于40℃水浴中水解7天；反应液经离心收集沉淀；用10ml水洗涤沉淀，洗涤3次(10ml×3)，洗液与母液合并，浓缩至50ml供再次使用；用10ml乙醇洗涤沉淀，洗涤5次(10ml×5)，合并乙醇液、蒸干、收集残余物得人参皂苷F1301mg。HPLC法测定人参皂苷F1含量为63％。
制备例2人参皂苷F1的制备500mg人参皂苷Rg1，150mg柚皮苷酶溶于50ml甘氨酸-HCl缓冲液(pH 4.5，离子强度为0.01M，含10％的二甲亚砜)中，于40℃水浴中水解7天；反应液经离心收集沉淀；用10ml水洗涤沉淀，洗涤3次(10ml×3)，洗液与母液合并，浓缩至50ml供再次使用；用10ml乙醇洗涤沉淀，洗涤5次(10ml×5)，合并乙醇液、蒸干、收集残余物得人参皂苷F1325mg。HPLC法测定人参皂苷F1含量为84％。
制备例3人参皂苷F1的制备500mg人参皂苷Re和Rg1混合物，150mg柚皮苷酶溶于50ml为醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.5，离子强度为0.01M，含10％的甲酰胺)中，于40℃水浴中水解7天；反应液经离心收集沉淀；用10ml水洗涤沉淀，洗涤3次(10ml×3)，洗液与母液合并，浓缩至50ml供再次使用；用10ml乙醇洗涤沉淀，洗涤5次(10ml×5)，合并乙醇液、蒸干、收集残余物得人参皂苷F1310mg。HPLC法测定人参皂苷F1含量为69％。
制备例4人参皂苷F1注射药物的制备取制备例2的人参皂苷F10.1g，加水10ml，加入0.1g吐温80，充分溶解，0.22μm微孔滤膜滤过，分装，121℃灭菌15min，即得。
制备例5动物试验灌胃药物的制备取制备例1的人参皂苷F10.1g，加水10ml，加入1g助悬剂羧甲基纤维素钠，充分混悬，即得。


人参皂苷F