专利名称:人参皂苷f的制作方法
本发明的目的在于提供了人参皂苷F1在制备治疗或预防痴呆综合征的药物中的应用。具体为人参皂苷F1在制备治疗或预防阿尔茨海默病与血管性痴呆的药物中的应用。人参的促智及抗衰老作用经几千年的临床实践已得到充分证实,从而提示我们对来源于人参的成分人参皂苷F1是否具有治疗痴呆的作用进行探索,结果表明人参皂苷F1能改善痴呆大鼠空间学习记忆障碍,从而为人参皂苷F1治疗痴呆提供药效学支持。人参皂苷F1是一种已知的具有药物活性的物质,因此,可以按常规制剂方法,将其制备成临床适用的任何一种药剂,例如片剂、胶囊剂、颗粒剂等口服固体制剂、口服液体制剂、注射剂等。在制备上述制剂的过程当中,可以将人参皂苷F1与任何一种适用于制备成临床药剂的赋型剂混合使用,制备成药物制剂。通过本发明,人参皂苷F1可有效用于预防或治疗痴呆综合征,并且副作用小。由于人参皂苷F1在制备治疗或预防痴呆综合征的药物中的应用是发明人的首次发现,因此,无论是人参皂苷F1单独使用为活性成分制成的药剂,还是利用人参皂苷F1的抗痴呆活性与其他活性成分配合使用制成的药剂,均在本专利的保护范围之内。本发明通过下列实施方式证明了人参皂苷F1在治疗或预防痴呆综合征方面的用途,但不仅限于这些实施例。
1.2药品、试剂及设备
人参皂苷F1按制备例方法制备。
凝聚态β淀粉样肽1~40片段(Aβ1-40)购自美国Sigma公司。
实验动物脑立体定位仪(SN2型)为日本成茂公司产品。
水迷宫中国医学科学院药物研究所研制。
2分组与给药将SD鼠随机分为8组,每组10只,具体如下(1)假手术对照组即海马内注射等量生理盐水;(2)Aβ1-40处理模型组;(3)人参皂苷F1低剂量组(12.5mg/kg,ig);(4)人参皂苷F1中剂量组(25mg/kg,ig);(5)人参皂苷F1高剂量组(50mg/kg,ig);(6)人参皂苷F1低剂量组(5mg/kg,ip);(7)人参皂苷F1中剂量组(10mg/kg,ip);(8)人参皂苷F1高剂量组(20mg/kg,ip)。
给药方法各组动物于造模前一周开始腹腔注射或灌胃给药,每天1次,连续3周。迷宫训练期间,于训练前0.5h给药。
3试验方法3.1Aβ1-40诱导大鼠AD样病变模型的制备应用凝聚态β淀粉样肽1~40片段(Aβ1-40)注入大鼠海马内建立AD样病变的动物模型。具体如下SD大鼠经麻醉后于立体定位仪下以Aβ1-40行双侧海马内注射,每侧各1μl(预先将Aβ1-40溶于无菌生理盐水10μg/μl,用前37℃下孵育1周)。注射部位为前囟后3.5mm,脑正中线旁开2.0mm,其深度为2.7mm。
3.2观察指标与方法空间学习记忆力测试采用Morris水迷宫法。平台设于迷宫东北象限正中,水平面高出平台1.5cm,水温保持在19℃~20℃,大鼠连续训练5d,每天2次,设定最长游动时间为70s,以秒表记时,记录大鼠找到平台所需时间(潜伏期,EL)。
4.结果对AD大鼠空间学习记忆力的影响随训练天数增加,各组大鼠平均EL逐渐缩短。与假手术组比较,模型组大鼠EL明显延长,第4天开始差异显著(P<0.05),说明造模成功。与模型组比,灌胃给药各组人参皂苷F112.5mg/kg组大鼠于第5天开始EL明显缩短,25mg/kg组则于第4天开始EL明显缩短,50mg/kg组则于第3天即开始EL明显缩短,皆差异显著。
注射给药各组人参皂苷F15mg/kg组大鼠于第4天开始EL明显缩短,10mg/kg组则于第3天开始EL明显缩短,20mg/kg组则于第2天即开始EL明显缩短,皆差异显著;20mg/kg组第5天则有极显著性差异。表明人参皂苷F1各剂量组无论灌胃还是注射给药均能显著改善Aβ1-40诱导的大鼠空间学习记忆障碍,且呈剂量依赖性。详见表1。
表1人参皂苷F1对实验性AD模型大鼠空间辨别学习记忆能力的影响
注与AD模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。
试验例2人参皂苷F1对血管性痴呆模型大鼠学习记忆力的影响1试验材料1.1动物SD雄性大鼠共50只,清洁2级,体重250~300g。购自海南省人民医院试验动物中心,自由饮水进食,实验前在实验环境中适应2-3d,实验室温度控制在(24±1)℃,相对湿度为40%-80%。
1.2药品与试剂人参皂苷F1按制备例4、5方法制备。
10%水合氯醛溶液规格100ml。购自海南省人民医院。
注射用青霉素钠规格160万单位。天津药业焦作有限公司生产。
水迷宫中国医学科学院药物研究所研制。
2分组与给药将SD大鼠随机分为8组,每组10只,具体如下(1)假手术对照组即海马内注射等量生理盐水;(2)Aβ1-40处理模型组;(3)人参皂苷F1低剂量组(5mg/kg,ig);(4)人参皂苷F1中剂量组(10mg/kg,ig);(5)人参皂苷F1高剂量组(20mg/kg,ig);(6)人参皂苷F1低剂量组(2.5mg/kg,ip);(7)人参皂苷F1中剂量组(5mg/kg,ip);(8)人参皂苷F1高剂量组(10mg/kg,ip)。
给药方法各组动物于造模前一周开始腹腔注射或灌胃给药,每天1次,连续3周。迷宫训练期间,于训练前0.5h给药。
3试验方法3.1造模方法本研究采用永久性结扎双侧颈总动脉(2-VO)法制作慢性脑灌注不足VaD动物模型,大鼠术前12h禁食、4h禁水。用10%水合氯醛(0.35ml/100g)腹腔注射麻醉,必要时补充注射,保证手术期间有自主呼吸。待翻正反射消失后,仰卧固定木制手术台上。颈前部去毛,酒精、碘酒消毒后,沿腹侧颈正中切开,依次钝性分离皮下脂肪、胸骨舌骨肌和胸锁乳头肌,再分别分离暴露左、右侧颈总动脉及气管(注意勿伤及迷走神经),套以“0”号丝线双重结扎,然后逐层缝合肌肉、皮肤。其中控制麻醉深度、保持体温恒定是造模成功的关键。术后动物送至有通风设备动物房饲养。假手术组动物同法行颈前皮肤切开,分离皮下脂肪、肌肉等组织,分离、暴露但不结扎颈总动脉,逐层缝合切口。术毕给予注射用青霉素钠水溶液适量局部涂敷,放入笼中饲养,每日肌注青霉素钠20万U/只,连用3d(如出现感染者可延长至1周),防治感染。
3.2观察指标与方法同试验例1。
4.结果对AD大鼠空间学习记忆力的影响随训练天数增加,各组大鼠平均EL逐渐缩短。与假手术组比较,模型组大鼠EL明显延长,第4天开始差异显著(P<0.05),说明造模成功。与模型组比,灌胃给药各组人参皂苷F15mg/kg组大鼠于第5天开始EL明显缩短,10mg/kg组则于第4天开始EL明显缩短,20mg/kg组则于第3天即开始EL明显缩短,皆差异显著。注射给药各组人参皂苷F12.5mg/kg组大鼠于第4天开始EL明显缩短,5mg/kg组则于第3天开始EL明显缩短,10mg/kg组则于第2天即开始EL明显缩短,皆差异显著(P<0.05);10mg/kg组第4天开始即有极显著性差异(P<0.001)。表明人参皂苷F1各剂量组均能显著改善实验性VD大鼠空间学习记忆障碍,且呈剂量依赖性。详见表2。
表2人参皂苷F1对实验性VD模型大鼠空间辨别学习记忆能力的影响
注与AD模型组比较,*P<0.05;P<0.001。
制备例中所述的人参皂苷Re、人参皂苷Rg1采用云南植物药业有限公司生产的市售品;柚皮苷酶采用上海宝丰生化有限公司生产的市售品;二甲亚砜采用盘锦兴海制药有限公司生产的市售品;甲酰胺采用淄博市博山华耀试剂厂生产的市售品;羧甲基纤维素钠采用上海邦成化工有限公司生产的市售品。
制备例1人参皂苷F1的制备500mg人参皂苷Re、150mg柚皮苷酶溶于50ml磷酸-柠檬酸缓冲液(pH 4.5,离子强度为0.01M,含10%的乙醇)中,于40℃水浴中水解7天;反应液经离心收集沉淀;用10ml水洗涤沉淀,洗涤3次(10ml×3),洗液与母液合并,浓缩至50ml供再次使用;用10ml乙醇洗涤沉淀,洗涤5次(10ml×5),合并乙醇液、蒸干、收集残余物得人参皂苷F1301mg。HPLC法测定人参皂苷F1含量为63%。
制备例2人参皂苷F1的制备500mg人参皂苷Rg1,150mg柚皮苷酶溶于50ml甘氨酸-HCl缓冲液(pH 4.5,离子强度为0.01M,含10%的二甲亚砜)中,于40℃水浴中水解7天;反应液经离心收集沉淀;用10ml水洗涤沉淀,洗涤3次(10ml×3),洗液与母液合并,浓缩至50ml供再次使用;用10ml乙醇洗涤沉淀,洗涤5次(10ml×5),合并乙醇液、蒸干、收集残余物得人参皂苷F1325mg。HPLC法测定人参皂苷F1含量为84%。
制备例3人参皂苷F1的制备500mg人参皂苷Re和Rg1混合物,150mg柚皮苷酶溶于50ml为醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.5,离子强度为0.01M,含10%的甲酰胺)中,于40℃水浴中水解7天;反应液经离心收集沉淀;用10ml水洗涤沉淀,洗涤3次(10ml×3),洗液与母液合并,浓缩至50ml供再次使用;用10ml乙醇洗涤沉淀,洗涤5次(10ml×5),合并乙醇液、蒸干、收集残余物得人参皂苷F1310mg。HPLC法测定人参皂苷F1含量为69%。
制备例4人参皂苷F1注射药物的制备取制备例2的人参皂苷F10.1g,加水10ml,加入0.1g吐温80,充分溶解,0.22μm微孔滤膜滤过,分装,121℃灭菌15min,即得。
制备例5动物试验灌胃药物的制备取制备例1的人参皂苷F10.1g,加水10ml,加入1g助悬剂羧甲基纤维素钠,充分混悬,即得。
人参皂苷F
人参皂苷f制作方法
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