专利名称：人参皂苷f的制作方法
本发明的目的在于提供了人参皂苷F1在制备治疗贫血的药物中的应用。具体为人参皂苷F1在制备治疗再生障碍性贫血药物中的应用。人参皂苷F1是一种已知的具有药物活性的物质，因此，可以按常规制剂方法，将其制备成临床适用的任何一种药剂，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂等口服固体制剂、口服液体制剂、注射剂等。在制备上述制剂的过程当中，可以将人参皂苷F1与任何一种适用于制备成临床药剂的赋型剂混合使用，制备成药物制剂。通过本发明，人参皂苷F1可有效用于治疗再生障碍性贫血，并且副作用小。由于人参皂苷F1在制备治疗再生障碍性贫血的药物中的应用是发明人的首次发现，因此，无论是人参皂苷F1单独使用为活性成分制成的药剂，还是利用人参皂苷F1的抗贫血活性与其他活性成分配合使用制成的药剂，均在本专利的保护范围之内。本发明通过下列实施方式证明了人参皂苷F1在治疗贫血方面的用途，但不仅限于这些实施例。1.2药品与试剂人参皂苷F1按制备例4、5方法制备。
丙酸睾酮注射液规格，1ml:10mg，福州海王福药制药有限公司。
红霉素片规格0.125g(12.5万单位)；新乡制药股份有限公司。
庆大霉素规格1ml4万单位，盐城制药有限公司。
台盼蓝Sigma公司生产。
大鼠抗小鼠CD34+RPE单克隆抗体购自深圳晶美公司FACScalibur流式细胞仪美国BECTONDICKINSON公司生产。
2分组与给药将Balb/c小鼠随机分为9组，每组10只，具体如下(1)正常对照组即未经照射组，给予无菌生理盐水灌胃，10ml·kg-1·d-1，每天1次，连续12d。(2)模型对照组于制模当天即给予无菌生理盐水灌胃，10ml·kg-1·d-1，每天1次，连续12d。(3)人参皂苷F1低剂量组(5mg/kg，ig)；(4)人参皂苷F1中剂量组(10mg/kg，ig)；(5)人参皂苷F1高剂量组(20mg/kg，ig)；于制模当天即给予人参皂苷F1灌胃，每天1次，连续12d。(6)人参皂苷F1低剂量组(2.5mg/kg，ip)；(7)人参皂苷F1中剂量组(5mg/kg，ip)；(8)人参皂苷F1高剂量组(10mg/kg，ip)；于制模当天即给予人参皂苷F1腹腔注射，每天1次，连续12d。(9)丙酸睾酮组于制模当天即给予腹腔注射丙酸睾酮，10ml·kg-1·d-1。所有小鼠均给予每升含红霉素250mg及庆大霉素320万U无菌水喂养。
3试验方法3.1免疫诱导AA小鼠模型的建立取DBA/2小鼠，断颈处死，常规消毒，无菌取出胸腺及颈部、颌下、腋窝、腹股沟、肠系膜等处淋巴结，加少量生理盐水，轻轻磨碎后过滤，使成单细胞悬液，台盼蓝鉴定细胞活性，活性细胞达98％。计数后配成所需浓度备用。雌性Balb/c小鼠，经60Co6.0Gyγ射线亚致死量全身照射。4h内由尾静脉输入取自DBA/2小鼠胸腺淋巴结混合细胞，输细胞量为每只1×106/0.2ml。
3.2观察指标与方法3.2.1小鼠外周血细胞计数，骨髓有核细胞计数于制模第12d，每只小鼠经尾静脉采血，按常规方法计数外周血细胞(白细胞、血小板、血红蛋白、网织红细胞)后，断颈处死，取右侧股骨，用PBS冲出骨髓细胞，计数，即为1根股骨中的骨髓有核细胞(BMNC)。
3.2.2骨髓CD34+细胞检测将冲出的BMNC用4％甲醛固定，加入10μlCD34+RPE单抗，4℃孵育30min，用PBS2ml洗2次后加入1mlPBS，经流式细胞仪检测CD34+细胞。
4.结果实验各组小鼠血细胞计数、骨髓有核细胞计数均显著低于正常对照组(P＜0.01)，但人参皂苷F1中、高剂量组(ig与ip)及丙酸睾酮组较模型对照组明显增加(P＜0.01)。模型对照组BMNC上CD34+细胞抗原的表达水平明显低于正常对照组(P＜0.01)，而人参皂苷F1中、高剂量组(ig与ip)及丙酸睾酮组较模型对照组明显增加(P＜0.05和P＜0.01)，且与正常对照组之间无显著性差异(P＞0.05)。但人参皂苷F1小剂量组(ig与ip)与模型对照组比较无显著差异(P＞0.05)。详见表1-2。
表1各组小鼠血细胞计数(x±s)

注与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与丙酸睾酮组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
表2小鼠骨髓有核细胞数及CD34+抗原表达的变化(x±s)

注与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与丙酸睾酮组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
5.结论人参皂苷F1无论注射或口服皆可通过促进骨髓造血细胞增生，从而对再障小鼠具保护作用。
制备例中所述的人参皂苷Re、人参皂苷Rg1采用云南植物药业有限公司生产的市售品；柚皮苷酶采用上海宝丰生化有限公司生产的市售品；二甲亚砜采用盘锦兴海制药有限公司生产的市售品；甲酰胺采用淄博市博山华耀试剂厂生产的市售品；羧甲基纤维素钠采用上海邦成化工有限公司生产的市售品。
制备例1人参皂苷F1的制备500mg人参皂苷Re、150mg柚皮苷酶溶于50ml磷酸-柠檬酸缓冲液(pH 4.5，离子强度为0.01M，含10％的乙醇)中，于40℃水浴中水解7天；反应液经离心收集沉淀；用10ml水洗涤沉淀，洗涤3次(10ml×3)，洗液与母液合并，浓缩至50ml供再次使用；用10ml乙醇洗涤沉淀，洗涤5次(10ml×5)，合并乙醇液、蒸干、收集残余物得人参皂苷F1301mg。HPLC法测定人参皂苷F1含量为63％。
制备例2人参皂苷F1的制备500mg人参皂苷Rg1，150mg柚皮苷酶溶于50ml甘氨酸-HCl缓冲液(pH 4.5，离子强度为0.01M，含10％的二甲亚砜)中，于40℃水浴中水解7天；反应液经离心收集沉淀；用10ml水洗涤沉淀，洗涤3次(10ml×3)，洗液与母液合并，浓缩至50ml供再次使用；用10ml乙醇洗涤沉淀，洗涤5次(10ml×5)，合并乙醇液、蒸干、收集残余物得人参皂苷F1325mg。HPLC法测定人参皂苷F1含量为84％。
制备例3人参皂苷F1的制备500mg人参皂苷Re和Rg1混合物，150mg柚皮苷酶溶于50ml为醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.5，离子强度为0.01M，含10％的甲酰胺)中，于40℃水浴中水解7天；反应液经离心收集沉淀；用10ml水洗涤沉淀，洗涤3次(10ml×3)，洗液与母液合并，浓缩至50ml供再次使用；用10ml乙醇洗涤沉淀，洗涤5次(10ml×5)，合并乙醇液、蒸干、收集残余物得人参皂苷F1310mg。HPLC法测定人参皂苷F1含量为69％。
制备例4人参皂苷F1注射药物的制备取制备例2的人参皂苷F10.1g，加水10ml，加入0.1g吐温80，充分溶解，0.22μm微孔滤膜滤过，分装，121℃灭菌15min，即得。
制备例5动物试验灌胃药物的制备取制备例1的人参皂苷F10.1g，加水10ml，加入1g助悬剂羧甲基纤维素钠，充分混悬，即得。


人参皂苷F