专利名称：人参皂苷f的制作方法
本发明的目的在于提供了人参皂苷F1在制备治疗或预防心脑血管疾病的药物中的应用。具体为人参皂苷F1在制备治疗或预防缺血性心脏病与缺血性脑血管病的药物中的应用。其中缺血性心脏病包括心绞痛、心肌梗死；缺血性脑血管病包括短暂性脑缺血发作、脑梗塞。人参具有安神补气之功，且可用治惊悸等症，从而提示我们对来源于人参的成分人参皂苷F1是否具有治疗心脑血管疾病的作用进行探索，结果表明人参皂苷F1能改善模型大鼠心肌缺血及脑缺血，从而为人参皂苷F1治疗缺血性心脑血管疾病提供药效学支持。本发明提供了人参皂苷F1在制备治疗或预防脑缺血/再灌注损伤的药物中的应用。人参皂苷F1是一种已知的具有药物活性的物质，因此，可以按常规制剂方法，将其制备成临床适用的任何一种药剂，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂等口服固体制剂、口服液体制剂、注射剂等。在制备上述制剂的过程当中，可以将人参皂苷F1与任何一种适用于制备成临床药剂的赋型剂混合使用，制备成药物制剂。通过本发明，人参皂苷F1可有效用于预防或治疗缺血性心脑血管疾病，并且副作用小。由于人参皂苷F1在制备治疗或预防缺血性心脑血管疾病的药物中的应用是发明人的首次发现，因此，无论是人参皂苷F1单独使用为活性成分制成的药剂，还是利用人参皂苷F1的抗心脑缺血活性与其他活性成分配合使用制成的药剂，均在本专利的保护范围之内。本发明通过下列实施方式证明了人参皂苷F1在治疗或预防缺血性心脑血管疾病方面的用途，但不仅限于这些实施例。

1.2药品、试剂及设备人参皂苷F1按制备例4、5方法制备。
尼莫地平注射液规格10mg/50ml/瓶，拜尔医药保健有限公司生产。
红四氮唑美国Sigma公司产品，临用前用生理盐水配成4％溶液。
10％水合氯醛溶液规格100ml。购自海南省人民医院。
2分组与给药将Wistar大鼠随机分为9组，每组10只，具体如下(1)假手术组(等容量溶剂)；(2)模型对照组(等容量溶剂)；(3)人参皂苷F1低剂量组(5mg/kg，ig)；(4)人参皂苷F1中剂量组(10mg/kg，ig)；(5)人参皂苷F1高剂量组(20mg/kg，ig)；(6)人参皂苷F1低剂量组(2.5mg/kg，iv)；(7)人参皂苷F1中剂量组(5mg/kg，iv)；(8)人参皂苷F1高剂量组(10mg/kg，iv)；(9)尼莫地平组(Nim，1.5mg/kg)。
给药方法灌胃给药造模前一周开始。腹腔注射给药术后静脉注射相应药物(给药体积1ml/200g)。
3试验方法大鼠禁食12小时后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分离右侧颈总动脉，夹闭颈内、颈总动脉，颈外动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，将栓线(选用直径0.24mm尼龙线，长度5.0cm)由颈外动脉插入至颅内，遇轻微阻力时停止，插入深度约为2cm。结扎颈外动脉开口，并打开颈总动脉动脉夹，消毒缝合伤口，造成左侧大脑中动脉缺血模型；假手术组仅进行右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉的分离(以上实验均在23℃～25℃进行)。24小时后按文献刘小光，徐理纳，一种能评价溶栓和抗溶栓的大鼠脑中动脉模型，药学学报，1995，30662所述方法及标准观察并记录大鼠的行为障碍；(A)提鼠尾观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面，计为0分，如手术对侧前肢出现腕屈曲计为1分，肘屈曲计为2分，肩内旋计为3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩内旋者，计为4分。(B)将动物置于平地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力，计为0分，如向手术对侧推动时阻力下降者，根据下降程度不同分为轻、中、重三度，分别计为1，2和3分。(C)将动物双前肢置一金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢肌张力对等且有力者计为0分。同样根据手术对侧肌张力下降程度不同计为1，2和3分。(D)动物有不停地向一侧转圈者，计为1分。根据标准评分，满分为11分，分数越高，表示动物行为障碍越严重。
行为评分后处死大鼠，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，冠状切成5片，脑片用红四氮唑(TTC)染色，正常组织经染色后呈红色，梗塞组织呈白色，染色后照相，用中国航空航天大学病理图像分析软件求梗塞面积比。数据用X±s表示，以组间t检验进行统计学处理。
4.结果如表1所示，缺血24小时后，大鼠表现出明显的行为障碍，大鼠脑组织也出现明显的灶状缺血区，达到全脑的25％左右；灌胃或注射给予不同剂量的人参皂苷F1，动物行为障碍有不同程度的减轻，大鼠脑缺血区也有明显好转，且呈剂量依赖性。
表1人参皂苷F1对大鼠局部脑缺血损伤的影响(n＝10，X±s)

注与模型对照组比较 *P＜0.05，**P＜0.01。
试验例2人参皂苷F1对大鼠脑缺血/再灌注损伤的影响1试验材料1.1动物Wistar大鼠共90只，清洁2级，体重250～300g。购自海南省人民医院试验动物中心，自由饮水进食，实验前在实验环境中适应2-3d，实验室温度控制在(24±1)℃，相对湿度为40％-80％。
1.2药品、试剂及设备人参皂苷F1按制备例4、5方法制备。
尼莫地平注射液规格10mg50ml/瓶，拜尔医药保健有限公司生产。
10％水合氯醛溶液规格100ml。购自海南省人民医院。
2分组与给药将Wistar大鼠随机分为9组，每组10只，具体如下(1)假手术组(等容量溶剂)；(2)模型对照组(等容量溶剂)；(3)人参皂苷F1低剂量组(5mg/kg，ig)；(4)人参皂苷F1中剂量组(10mg/kg，ig)；(5)人参皂苷F1高剂量组(20mg/kg，ig)；(6)人参皂苷F1低剂量组(2.5mg/kg，iv)；(7)人参皂苷F1中剂量组(5mg/kg，iv)；(8)人参皂苷F1高剂量组(10mg/kg，iv)；(3)尼莫地平组(Nim，1.5mg/kg)。
给药方法灌胃给药造模前一周开始。注射给药术后10min静脉注射相应药物(给药体积1ml/200g)。
3试验方法禁食12小时后，按实验例1所述方法造成左侧大脑中动脉缺血；缺血2小时后，抽出尼龙线，造成大鼠脑缺血/再灌注损伤；再灌22小时后，按按实验例1所述方法进行行为评分、脑片染色。数据用X±s表示，以组间t检验进行统计学处理。
4结果如表2所示，缺血2小时再灌22小时后，大鼠表现出明显的行为障碍，大鼠脑组织也出现明显的灶状缺血区，达到全脑的25％左右；灌胃或注射给予不同剂量的人参皂苷F1，动物行为障碍有不同程度的减轻，大鼠脑缺血区也有明显好转，且呈剂量依赖性。
表2人参皂苷F1对大鼠脑缺血/再灌注损伤的影响(n＝10，X±s)

注与模型对照组比较 *P＜0.05，**P＜0.01。
试验例3人参皂苷F1对大鼠心肌缺血的影响1试验材料1.1动物Wistar大鼠共90只，清洁2级，体重250～300g。购自海南省人民医院试验动物中心，自由饮水进食，实验前在实验环境中适应2-3d，实验室温度控制在(24±1)℃，相对湿度为40％-80％。
1.2药品、试剂及设备人参皂苷F1按制备例4、5方法制备。
乌拉坦山东齐鲁兴华制药有限公司生产。
丹参注射液规格2ml/支，云南个旧生物药业有限公司生产。
氯化硝基四氮唑蓝(N-BT)由军事医学科学院药材供应站提供。
2分组与给药将Wistar大鼠随机分为9组，每组10只，具体如下(1)假手术组(等容量溶剂)；(2)模型对照组(等容量溶剂)；(3)人参皂苷F1低剂量组(5mg/kg，ig)；(4)人参皂苷F1中剂量组(10mg/kg，ig)；(5)人参皂苷F1高剂量组(20mg/kg，ig)；(6)人参皂苷F1低剂量组(2.5mg/kg，iv)；(7)人参皂苷F1中剂量组(5mg/kg，iv)；(8)人参皂苷F1高剂量组(10mg/kg，iv)；(3)丹参注射液组。
给药方法灌胃给药造模前一周开始。注射给药术后各组动物静脉滴注(用输液泵注射)相应药物(给药体积3ml，30min滴完)。
3试验方法禁食12小时后，iv乌拉坦(1.2g/kg)麻醉，测肢体导联心电图。剪去左胸前皮毛，碘酒及酒精消毒，沿胸骨左缘1cm处，剪开胸壁肌肉及二条肋骨，迅速打开胸腔，暴露心脏，在动脉圆锥与左心耳之间结扎左冠状动脉，立即将心脏放回，排挤出胸腔空气，用止血钳闭合胸腔，造成大鼠急性心肌缺血模型。记录术后0，2，6h心电图，随后取出心脏，以冷生理盐水洗净后，-20℃冰箱冷冻过夜。次日，将冷冻的心脏由结扎处至心尖部等厚切成5片，浸入新鲜配制的0.5％N-BT磷酸缓冲液(pH 7.4)中。37℃水浴振摇10～15min。用滤纸吸干切片表面的染色液，分离染色部分和未染色部分，称重，记算梗死面积。心肌梗死百分比(％)＝梗死部分重量/(非梗死部分重量+梗死部分重量)×100％。
4结果如表3所示，灌胃中高剂量与静脉给药各剂量的人参皂苷F1均明显减少结扎冠状动脉所致大鼠急性心肌缺血引起的心肌梗死面积，并可降低由心肌缺血造成的肢体导联心电图J点的升高。人参皂苷F1对心肌具有保护作用，能降低缺血引起的心肌损伤。
表3人参皂苷F1对大鼠心肌缺血损伤的影响(n＝10，X±s)

注与模型对照组比较 *P＜0.05，**P＜0.01。
制备例中所述的人参皂苷Re、人参皂苷Rg1采用云南植物药业有限公司生产的市售品；柚皮苷酶采用上海宝丰生化有限公司生产的市售品；二甲亚砜采用盘锦兴海制药有限公司生产的市售品；甲酰胺采用淄博市博山华耀试剂厂生产的市售品；羧甲基纤维素钠采用上海邦成化工有限公司生产的市售品。
制备例1人参皂苷F1的制备500mg人参皂苷Re、150mg柚皮苷酶溶于50ml磷酸-柠檬酸缓冲液(pH 4.5，离子强度为0.01M，含10％的乙醇)中，于40℃水浴中水解7天；反应液经离心收集沉淀；用10ml水洗涤沉淀，洗涤3次(10ml×3)，洗液与母液合并，浓缩至50ml供再次使用；用10ml乙醇洗涤沉淀，洗涤5次(10ml×5)，合并乙醇液、蒸干、收集残余物得人参皂苷F1301mg。HPLC法测定人参皂苷F1含量为63％。
制备例2人参皂苷F1的制备500mg人参皂苷Rg1，150mg柚皮苷酶溶于50ml甘氨酸-HCl缓冲液(pH 4.5，离子强度为0.01M，含10％的二甲亚砜)中，于40℃水浴中水解7天；反应液经离心收集沉淀；用10ml水洗涤沉淀，洗涤3次(10ml×3)，洗液与母液合并，浓缩至50ml供再次使用；用10ml乙醇洗涤沉淀，洗涤5次(10ml×5)，合并乙醇液、蒸干、收集残余物得人参皂苷F1325mg。HPLC法测定人参皂苷F1含量为84％。
制备例3人参皂苷F1的制备500mg人参皂苷Re和Rg1混合物，150mg柚皮苷酶溶于50ml为醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.5，离子强度为0.01M，含10％的甲酰胺)中，于40℃水浴中水解7天；反应液经离心收集沉淀；用10ml水洗涤沉淀，洗涤3次(10ml×3)，洗液与母液合并，浓缩至50ml供再次使用；用10ml乙醇洗涤沉淀，洗涤5次(10ml×5)，合并乙醇液、蒸干、收集残余物得人参皂苷F1310mg。HPLC法测定人参皂苷F1含量为69％。
制备例4人参皂苷F1注射药物的制备取制备例2的人参皂苷F10.1g，加水10ml，加入0.1g吐温80，充分溶解，0.22μm微孔滤膜滤过，分装，121℃灭菌15min，即得。
制备例5动物试验灌胃药物的制备取制备例1的人参皂苷F10.1g，加水10ml，加入1g助悬剂羧甲基纤维素钠，充分混悬，即得。


人参皂苷F